Artigo de método

Refinamento Técnico de um Modelo Bilateral de Isquemia-Reperfusão Renal em Camundongos para Pesquisa de Lesão Renal Aguda

DOI:

10.3791/63957

⸱

3 de novembro de 2023

 ,  , 
1Department of Life Science, Fu Jen Catholic University, 2MacKay Junior College of Medicine, Nursing, and Management, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, MacKay Memorial Hospital

Neste artigo

Resumo

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Este estudo estabeleceu um protocolo com foco no refinamento técnico de um modelo murino de isquemia-reperfusão renal bilateral para pesquisa de lesão renal aguda.

Resumo

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A parada cardíaca representa um grande fardo para a saúde pública. A lesão renal aguda (LRA) é um marcador adverso em sobreviventes de parada cardíaca após o retorno da circulação espontânea (RCE) após ressuscitação cardiopulmonar bem-sucedida. Por outro lado, a recuperação da função renal da LRA é um preditor de desfechos neurológicos favoráveis e alta hospitalar. No entanto, falta uma intervenção efetiva para prevenir o dano renal causado pela parada cardíaca após RCE, sugerindo que estratégias terapêuticas adicionais são necessárias. A hipoperfusão e a reperfusão renal são dois mecanismos fisiopatológicos que causam LRA após parada cardíaca. Modelos animais de IRA induzida por isquemia-reperfusão (IR-IR) de ambos os rins são comparáveis aos pacientes com LRA após RCE em um cenário clínico. No entanto, a IR-LRA de ambos os rins é tecnicamente difícil de analisar, pois o modelo está associado a alta mortalidade e ampla variação na lesão renal, o que pode afetar a análise. Foram escolhidos camundongos leves, colocados sob anestesia geral com isoflurano, submetidos à cirurgia por via dorsolateral e com temperatura corporal mantida durante a operação, reduzindo o dano tecidual e estabelecendo um protocolo reprodutível de pesquisa de IR-LRA renal aguda.

Introdução

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A parada cardíaca ocorre mais de 80.000 vezes ao ano nos Estados Unidos 1,2. A taxa de mortalidade da parada cardíaca é extremamente alta 3,4,5,6. A LRA é um importante fator de risco associado à alta mortalidade e piores desfechos neurológicos em pacientes com parada cardíaca após RCE 7,8,9,10,11,12,13. A recuperação da LRA é um bom preditor de evolução neurológica favorável e alta hospitalar14,15,16. No entanto, ainda faltam terapias efetivas para IR-LRA 15,16,17,18,19. Estratégias terapêuticas adicionais são necessárias para melhorar ainda mais os desfechos clínicos da doença.

IR-IR com abordagem de isquemia renal bilateral é um dos modelos animais utilizados para pesquisa de LRA 20,21,22,23,24,25,26. Modelos animais de IR-IR renal são menos complicados do que um modelo de lesão de IR de corpo inteiro para o estudo de LRA em pacientes com parada cardíaca súbita após RCE6,27,28,29,30. Isso implica que resultados consistentes de um modelo animal de IR-IR renal são mais fáceis de alcançar devido à presença de menos fatores de confusão nos experimentos. Além disso, os protocolos renais de IR-LRA comumente envolvem uma oclusão unilateral ou bilateral do pedículo renal. Condições em experimentos com IR-IR renal bilateral são comparáveis às condições clínicas para IR após RCE em pacientes com parada cardíaca súbita após ressuscitação cardiopulmonar bem-sucedida. Embora as características patológicas dos rins em ambos os modelos reflitam as características patológicas da lesão renal humana de IR 31,32,33, uma abordagem de isquemia renal bilateral é mais relevante para LRA em condições patológicas humanas, como insuficiência cardíaca, vasoconstrição e choque séptico 35. Modelos animais bilaterais de IR-IR renal são adequados para estudos enfocando lesões renais de IR em parada cardíaca após RCE.

Modelos renais bilaterais de IR-LRA estão associados a dificuldades técnicas, complexidade experimental e longa duração da cirurgia 23,26,32,33,35,36. Para superar essas dificuldades técnicas, o presente estudo estabeleceu um protocolo de pesquisa bilateral confiável de IR-LRA em camundongos, fazendo algumas modificações técnicas. O protocolo proposto resultou em menos complicações cirúrgicas, menor dano tecidual e menor probabilidade de mortalidade durante a cirurgia. Portanto, pode ser utilizado para investigar os processos fisiopatológicos da LRA após RCE para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra o dano de hipoperfusão e reperfusão renal37,38,39.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo National Institutes of Health dos EUA (publicação NIH no. 85-23, revisada em 1996). O protocolo do estudo foi aprovado e de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Católica de Fu-Jen. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e instrumentos usados neste protocolo.

1. Preparação dos ratos

  1. Selecionar camundongos machos C57BL/6 de 8 semanas de idade com peso de 21-23 g.
  2. Abrigar e manter os ratos sob um ciclo claro e escuro de 12 h a uma temperatura controlada (21 ± 2 °C) com livre acesso a alimentos, pellets padrão de ração para camundongos e água da torneira.

2. Anestesia

  1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas estéreis.
  2. Colocar os camundongos sob anestesia com isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 1 L/min na câmara de indução.
  3. Avaliar o nível de anestesia pelo reflexo pedalar.
    NOTA: O reflexo do pedal é uma retração da pata traseira em resposta a uma pinça firme do dedo do pé. A anestesia é completa quando o reflexo pedal desaparece.
  4. Mover e colocar cada camundongo em decúbito ventral em uma plataforma cirúrgica com uma manta elétrica para manter sua temperatura corporal assim que a anestesia estiver completa. Estabilizar a temperatura corporal antes da cirurgia e monitorar com sondas de temperatura retal. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
  5. Tape as patas dos ratos na prancha.
  6. Anexar uma máscara ao rosto dos ratos para fornecer um fornecimento constante de isoflurano a 1% e 1 L/min de oxigénio
  7. Avaliar o nível de anestesia pelo reflexo pedioso regularmente e ajustar a administração anestésica de acordo durante a cirurgia.

3. Cirurgia renal bilateral de IR-LRA

  1. Toque as costas e encontre a coluna lombar dos ratos manualmente. Mova-se ao longo da coluna cefálica e procure ângulos costovertebrais que estão abaixo de ambos os lados da última costela dos camundongos.
  2. Aplique loção depilatória em ambos os lados da região do ângulo costovertebral por aproximadamente 30 s e, em seguida, remova o pelo com soro fisiológico.
  3. Desinfete a pele raspada com três rodadas de solução de betadina e álcool a 75% usando bolas de algodão.
    OBS: Manter um campo estéril para a cirurgia durante todo o procedimento é fundamental. Aplique um pano cirúrgico e use instrumentos estéreis.
  4. Use pinça de ponta fina para levantar suavemente a pele abaixo do ângulo costovertebral esquerdo e, em seguida, use tesoura para criar uma incisão dorsolateral oblíqua de 1 cm ao longo das linhas de tensão da pele a partir da linha média lombar no flanco esquerdo. Transeccionar a parede muscular do flanco esquerdo com tesoura para visualizar o rim esquerdo.
  5. Repetir os procedimentos cirúrgicos citados acima para visualizar o rim direito. Remova as pequenas quantidades de sangue produzidas durante o procedimento com cotonetes estéreis.
  6. Empurre e separe o rim esquerdo cuidadosamente do tecido circundante com pinças. Identificar o pedículo renal após a exposição do rim esquerdo.
    NOTA: Tenha cuidado para não ferir a glândula adrenal e os vasos sanguíneos circundantes.
  7. Fixação sobre o pedículo renal esquerdo com clipe microvascular por 25 min. Confirme a isquemia por uma mudança visível na cor do rim de rosa para vermelho escuro.
  8. Cubra o rim pinçado com bolas de algodão úmidas de soro fisiológico estéril para evitar a dessecação durante o clampeamento do pedículo renal esquerdo.
  9. Repetir os procedimentos cirúrgicos acima mencionados para pinçar o pedículo renal direito com um clipe microvascular por 25 min.
  10. Cubra o rim pinçado com bolas de algodão úmidas de soro fisiológico estéril para evitar a dessecação durante o clampeamento do pedículo renal direito.
  11. Monitorar periodicamente a profundidade e a umidade da anestesia das bolas de algodão úmidas com soro fisiológico estéril.
  12. Abra o clipe microvascular esquerdo para iniciar a reperfusão do rim esquerdo. Confirme a reperfusão por uma mudança de cor visível do rim esquerdo de vermelho escuro para rosa.
  13. Abra o clipe microvascular direito para iniciar a reperfusão do rim direito.
  14. Depois que a mudança de cor do rim for verificada, devolva o rim para a cavidade abdominal.
  15. Fechar a cavidade abdominal e a pele com sutura absorvível 6-0.
  16. Esfregue para desinfetar a ferida com uma solução de betadina e álcool a 75% usando bolas de algodão.
  17. Observe o animal cuidadosamente até que ele comece a se mover livremente e se alimentar.
    NOTA: Preste muita atenção aos animais até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
  18. Administrar carprofeno (5 mg/kg em 0,2 mL, administrado por via subcutânea) por 2-3 dias para prevenir dor pós-cirúrgica.

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Resultados

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A qualidade da cirurgia renal bilateral de IR-IR deve ser avaliada antes de análises microscópicas ou moleculares adicionais. Durante a cirurgia, a isquemia renal deve ser confirmada verificando-se se o rim mudou de cor de rosa para vermelho escuro logo após o pedículo renal ser pinçado com um clipe microvascular (Figura 1). Após a cirurgia, o dano renal causado pela cirurgia de IR-LRA pode ser validado com alguns microlitros de soro através da coleta de sangue submandibular para análise bio...

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Discussão

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O protocolo bilateral de IR-LRA proposto é adequado para investigar o mecanismo de lesão de hipoperfusão e reperfusão de ambos os rins. O protocolo sugere que camundongos leves, anestesia geral com isoflurano, abordagem dorsolateral da cirurgia e manutenção da temperatura corporal durante a operação atenuam as dificuldades técnicas associadas, encurtam a duração da cirurgia e aumentam a consistência do procedimento para pesquisa de IR-IR renal bilateral aguda.

Dificuldades técnicas influenciam...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados à publicação deste artigo.

Agradecimentos

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Este modelo foi desenvolvido com o apoio financeiro do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). Este manuscrito foi editado pela Wallace Academic Editing.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sutura absorvível, 6-0EthiconJ510G-BX
Solução BetadineShineteh Istrument
CarprofenoSigmaPHR1452
Bolas de algodãoShineteh Istrument
Graefe FórcepsFine ScienceTools 11051-10
Almofada de aquecimentoShineteh Istrument
IsofluranoPiramal Critical Care Inc.26675-46-7
Moria Vessel ClampFine Science Tools18320-11
Olsen-Hegar agulha titularFine Science Tools12002 - 12
SalineShineteh Istrument
Bisturi bladesShinvas2646
Small Animal Anesthesia MachineSheng-Cing Instruments Co.STEP AS-01
Tesoura de tecidoFine Science Tools14072 - 10

Referências

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