Summary
Den nuværende protokol beskriver fremstillingen af poly(mælkesyre-co-glycolsyre)-baserede meget åbne porøse mikrosfærer (HOPM'er) via den enkeltemulsionsformuleringsbaserede letkøbte mikrofluidiske teknologi. Disse mikrosfærer har potentielle anvendelser inden for vævsteknik og lægemiddelscreening.
Abstract
Sammenlignet med bulkstilladser og direkte injektion af celler alene har de injicerbare modulære enheder fået enorm interesse for at reparere defekte væv på grund af bekvemmelighed i pakningen af celler, forbedret celleretention og minimal invasivitet. Desuden kan den porøse konformation af disse mikroskalabærere forbedre mediumudvekslingen og forbedre niveauet af næringsstoffer og iltforsyninger. Denne undersøgelse illustrerer den bekvemme fremstilling af poly (mælkesyre-co-glycolsyre) -baserede meget åbne porøse mikrosfærer (PLGA-HOPM'er) ved hjælp af den letkøbte mikrofluidiske teknologi til celleleveringsapplikationer. De resulterende monodisperserede PLGA-HOPM'er havde partikelstørrelser på ~ 400 μm og åbne porer på ~ 50 μm med sammenkoblede vinduer. Kort fortalt blev de emulgerede oliedråber (PLGA-opløsning i dichlormethan, DCM), indpakket med den vandige fase på 7,5% (w / v) gelatine, introduceret i den 1% (w / v) kontinuerligt flydende poly (vinylalkohol) (PVA) vandige opløsning gennem koaksialdysen i den tilpassede mikrofluidiske opsætning. Derefter blev mikrosfærerne udsat for opløsningsmiddelekstraktion og lyofiliseringsprocedurer, hvilket resulterede i produktion af HOPM'er. Især forskellige formuleringer (koncentrationer af PLGA og porogen) og behandlingsparametre (emulgeringskraft, nålemåler og strømningshastighed for dispergeret fase) spiller afgørende roller i kvaliteterne og egenskaberne ved de resulterende PLGA HOPM'er. Desuden kan disse arkitekturer potentielt indkapsle forskellige andre biokemiske signaler, såsom vækstfaktorer, til udvidet lægemiddelopdagelse og vævsregenereringsapplikationer.
Introduction
Cellebelastede mikrosfærer tilbyder gunstige fordele, såsom forbedret celleretentionskapacitet in situ, effektiv levering af celler og efterfølgende evne til celleproliferation in vivo 1. Til dato er der blevet fremsat adskillige undersøgelser for at udvikle en vellykket stilladsstruktur til støtte for et gunstigt miljø for celler til vævsregenerering eller lægemiddelscreeningsapplikationer2. Imidlertid er hypoximiljøet ofte uundgåeligt i det indre på grund af utilstrækkelige forsyninger af næringsstoffer / ilt og metabolisk affaldsophobning3. For at overvinde disse problemer er der udviklet meget porøse mikrosfærer (PM'er) ved hjælp af forskellige biomaterialer 4,5,6. Derudover lider stilladserne i dynamisk kultur af overdreven forskydningsspænding7, og kulturmediets ustabile tilstand kan bryde PM'ernes troskab. For eksempel demonstrerede vi co-injektion af mus myoblast (C2C12) -ladet PLGA meget åbne PM'er (HOPM'er) og human navlestrengsendotelcelle (HUVEC) -ladet poly (ethylenglycol) hule mikrorod for at helbrede volumetrisk muskeltab og opnå bemærkelsesværdig forbedring af in situ skeletmuskelregenerering8.
Især er PM'er kendetegnet ved store overfladearealer og høje porøsiteter, hvilket er af særlig interesse for celleadhæsion og vækst mod minimalt invasiv cellelevering9. I lyset af disse aspekter er forskellige biokompatible materialer blevet anvendt til fremstilling af PM'erne10,11. Disse designbare PM'er, der er samdyrket med celler, tilbyder fremragende vedhæftning, betydelig mekanisk styrke og stærkt sammenkoblede vinduer, hvilket kan forbedre celleproliferation til reparation af beskadigede væv12. I denne henseende er der også udviklet forskellige teknologier til fremstilling af porøse kugler13,14. På den ene side blev PM'er produceret ved hjælp af gasdannende midler, såsom NH4HCO3, som blev fastholdt på grund af utilstrækkelig sammenkobling15,16,17. På den anden side blev PM'er direkte klippet efter emulgering, hvilket førte til polydisperse PM'er18. I sidste ende er dråbemikrofluidteknologien baseret på emulsionstemplating-tilgangen måske en effektiv metode til konstruktion af PM'er, da det ofte resulterer i partikler i ensartet størrelse19. Især afhænger mikrosfærernes morfologiske egenskaber ofte af kvaliteten af de genererede emulsionsdråber (dvs. vand-i-olie, W/O eller olie-i-vand, O/W), hvilket i væsentlig grad kan påvirke biomaterialernes egenskaber20. Det er værd at bemærke, at den foruddesignede mikrofluidiske platform kan anvendes til at generere mikrofibre eller mikrosfærer. I et tilfælde demonstrerede Yu et al. produktionen af cellebelastede mikrofibrøse strukturer baseret på kapillærbaserede mikrofluidiske platforme, som kunne bruges til at samle cellulære netværk til efterligning af naturlige væv21. I et andet tilfælde fremstillede Ye et al. fotoniske krystalmikrokapsler ved skabelonreplikation af silica kolloide krystalperler gennem mikrofluidiske teknologier, som kunne overvinde mange begrænsninger af nuværende teknikker, der kræver kompleks mærkning og specifikt apparat22.
Faktisk skyldes rationalet bag brugen af denne teknik forskellige fordele, såsom at være letkøbt, ikke kræver sofistikeret udstyr og dets bekvemmelighed ved syntetisering af PM'er i ensartet størrelse til cellelevering og regenerative medicinapplikationer. I denne sammenhæng kan PM'er med foruddesignede komponenter af emulsionstemplating bekvemt opnås fra en mikrofluidisk enhed samlet fra poly (vinylchlorid) (PVC) rør, en glaskapillær og en nål. En W/O-emulsionsprækursor fremstilles ved homogenisering af en vandig opløsning af gelatine og en organisk opløsning af PLGA. Ved selektivt at injicere den relevante del af emulsionen i den mikrofluidiske platform fremstilles PM'erne med ensartede partikelstørrelser og sammenkoblede porer i hele overfladen til interiøret. Den nuværende protokol sigter mod at fremstille PLGA-HOPM'erne ved emulsionstemplating i den mikrofluidiske platform. Det antages, at denne protokol tillader reproducerbar produktion af PLGA-HOPM'er og potentielt vil være anvendelig inden for deres relaterede områder inden for vævsteknik og lægemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered PVA-stamopløsningen på forhånd ved at opvarme PVA-opløsningen i et 80 °C vandbad og derefter anbringe den i køleskabet ved 4 °C. Afkøles til stuetemperatur (RT) til eksperimentel brug.
- Emulsionsprækursoren fremstilles ved at tilsætte den vandige gelatineopløsning (1 ml, 7,5%, w/v) til den organiske fase af PLGA (2 ml, 2%, w/v i dichlormethan, DCM) (se materialetabel).
BEMÆRK: Generelt involverer mikrofluidisk teknologi forskellige faser for at danne mikrosfærerne. Den kontinuerlige eller opsamlingsfase omfatter en vandig poly (vinylalkohol) (PVA, 600 ml, 1%, w / v).
2. Dråbemikrofluidisk enhedssamling og fremstilling af PLGA-HOPM'er
BEMÆRK: De forbrugsvarer, der kræves til denne samling, er angivet i materialetabellen.
- Tilpas dråbegeneratorenheden.
- Konstruer en co-flow mikrofluidisk generator ved hjælp af en glaskapillær (OD, 1 mm), PVC-rør (ID, 1 mm) og en 26 G dispenseringsnål.
- Tilslut glaskapillæren til enden af PVC-røret, og gennembor derefter med en nål ved tilslutningen af ovenstående struktur.
- Placer den anden ende af PVC-røret i den kontinuerlige fase under dråbegenereringen. Brug UV-lim til at forsegle hullerne ved samlingen efter hærdning.
BEMÆRK: Nålen skal bøjes buet ca. 45 ° for praktisk piercing ved PVC-røret, og nålepunktet strækkes ind i kapillarrøret for at danne koaksialstrukturen.
- Forbered dråbemikrofluidisk platform.
- Brug to sprøjtepumper, som vist i figur 1. Brug en 50 ml sprøjte til at indlæse den kontinuerlige fase og en 5 ml sprøjte til emulsionsdannelse.
- Indstil strømningshastighederne for de kontinuerlige faser og dispersionsfaserne til henholdsvis 2 ml/min og 0,08 ml/min.
- Et 500 ml bægerglas anbringes i et isbad, og det fyldes med en forkølet vandig PVA-opløsning (trin 1.1).
BEMÆRK: Enden af glaskapillæren skal nedsænkes i opsamlingsfasen. Det foreslås at omrøre (1 time, 60 o / min) supernatanten i opsamlingsfasen med glasstangen efter emulsionsdråbernes dannelse i platformen. Emulsionsdråber produceres ved spidsen af nålepunktet. Generelt påvirker nålens måler størrelsen af PM'er, hvor den mindre måler svarer til den mindre størrelse af PM'er. Desuden er porediameteren hovedsageligt korreleret med porogenkoncentrationen, der er i stand til at stige med passende gelatinekoncentration1.
- Udfør emulgering og dråbegenerering.
- Forbered emulsionen ved at følge nedenstående trin.
- Forbered emulsionen ved straks at dekantere den vandige gelatineopløsning i DCM-opløsningen af PLGA (trin 1.2) og emulgere ved hjælp af ultralydsenheden (se Materialetabel).
- Juster ultralydseffekten til 400 W, og indstil den samlede behandlingstid som 90 s (interval 2 s, ultralydsbehandling 1 s), ledsaget af konstant ændring af sondens position manuelt.
- Stabiliser den resulterende emulsion til sprøjtesugning og dråbegenerering på ca. 20 min.
BEMÆRK: Placer sonden af ultralydscellebryderen i olie-vand-grænsefladen. Det foreslås ikke at lade ultralydssonden komme i kontakt med beholderen.
- Udfør dråbegenereringen.
- Læg den forberedte emulsion (trin 2.3.1) hurtigt i 5 ml sprøjten på den mikrofluidiske platform efter ultralydsbehandling.
- Indfør den ustabile W/O-emulsion (som er i løbet af faseadskillelse) i den mikrofluidiske enhed som den diskontinuerlige fase. På samme tid skal du bruge den vandige opløsning af PVA som den kontinuerlige fase.
- De mikrosfærer, der indeholder emulsionen, samles i bunden af opsamlingsbægerglasset (PVA, 1 %, w/v) efter injektion af de korrekte dele af emulsionen i mikrofluidanordningen.
- Prøven anbringes ved 4 °C natten over for yderligere stabilisering.
- Skyl og lyofiliser de forberedte mikrosfærer (PLGA-HOPM'er) ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: De genererede PLGA-HOPM'er indeholder vilkårlige porer på indersiden og overfladen.- Mikrosfærerne opbevares ved 4 °C, før de normaliseres til RT, og omrøres med en glasstang (1 time, 60 o/min) for at eliminere den resterende DCM.
- Filtrate opsamlingsfasen i 500 ml bægerglasset omhyggeligt, og vask de opsamlede mikrosfærer tre gange med deioniseret vand for at vaske den resterende PVA af på overfladen af PM'er.
- Placer PLGA-mikrosfærerne i 37 °C vandbadet i 30 minutter for at opløse gelatinen indpakket i PLGA-rygraden.
- Skyl de resulterende PLGA-HOPM'er to gange med det deioniserede vand for at fjerne den resterende gelatine og forkøles til frysetørring ved -80 °C i 24 timer.
- Opbevar de tørre PLGA-HOPM'er ved -20 °C for yderligere eksperimenter.
- Forbered emulsionen ved at følge nedenstående trin.
3. Scanning elektronmikroskop (SEM) billeddannelse
- Deponer PLGA-HOPM'er på prøvestadiet af SEM (se Materialetabel) ved RT, og sæt prøvetrinnet i magnetronsputterens spruttecelle. Tænd transformeren og magnetronen en efter en. Indfør prøven til SEM efter at være blevet sputter-belagt med guld i 1 min.
- Få SEM-billederne ved at indstille accelerationsspændingen til 5 kV.
- Derudover kvantificeres partikelstørrelsen af PLGA-HOPM'er ved hjælp af 100 PM'er i det variable felt af SEM-billeddannelse. Mål det repræsentative resultat for at kvantificere porestørrelsesfordelingen.
- Åbn grafikken med billede J, og brug den "lige linje" til at matche skalalinjen i SEM-billedet, hvilket får softwaren til at identificere pixel til længde.
- Klik på analyser > sæt skala, indstil den "kendte afstand" til skalalinjen i SEM-billedet, og klik på global > OK.
- Klik på analyser > værktøjer > ROI manager ... for at måle pore- eller partikelstørrelsen på PLGA PM'er og klikke på tilføj den. Mål antallet af prøver baseret på kravet.
- Klik på Mål for at få de kvantitative data i grafikken til yderligere beregning.
4. Cellekultur og fluorescensbilleddannelse
BEMÆRK: Rotteknoglemarv mesenkymale stamceller (BMSC'er) blev brugt til det nuværende arbejde. Cellerne blev hentet fra en kommerciel kilde (se Materialetabel).
- Kultur cellerne i Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med L-glutamin (DMEM / F-12), 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin. Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
- Passage rotten BMSC'er i et 1: 2 forhold efter at have nået 90% af sammenløbet.
- Udfør celleadhæsion ved at følge nedenstående trin.
- Der inkuberes PLGA-HOPM'erne med ethylalkohol (5 ml, 70%, v/v) og centrifugeres ved 500 x g i 10 minutter ved RT for at sterilisere.
- De steriliserede PLGA-HOPM'er vaskes to gange med fosfatbufferopløsning.
- HOPM'erne inkuberes (fem i antal) med cellesuspensionen (5 ml, 1 x 105 celler/ml) i et sterilt centrifugerør (50 ml) under dynamisk kultur for BMSC-adhæsion til PLGA-HOPM'er.
- Udfør den dynamiske kultur i en termostatisk aseptisk ryster (37 °C, 90 o / min) ved at placere et forseglet 50 ml centrifugerør i rysteren (se Materialetabel).
BEMÆRK: Den dynamiske kultur har til hensigt at forbedre vedhæftningsgraden for BMSC'er på stilladserne i stedet for direkte at inkubere PM'erne og cellerne på plastpladen. Cellerne og PLGA PM'erne tilsættes i et 50 ml sterilt centrifugerør, inkuberer røret ved en termostatisk aseptisk ryster (37 ° C, 90 o / min) og skifter mediet hver 2. dag.
- Udfør det levende og døde dobbeltpletassay.
- Skyl de cellebelastede PM'er tre gange for at eluere BMSC'er uden fastgørelse til PLGA-HOPM'er.
- Placer de cellebelastede PM'er på 35 mm glasbundpladen. Der tilsættes 1 ml farvningsbuffer (se materialetabel), herunder henholdsvis 1 μL calcein-AM og propidiumiodid (PI), til den forvaskede PBS-prøve.
- Vurder prøverne ved konfokal laserscanningsmikroskopi (se Materialetabel). Tænd for excitationslyset på 488 nm og 552 nm ved den tilsvarende detektor. Til z-overlay-analyse skal du indstille z-bredden til at fange de forskellige lag af prøven ved z-aksebevægelse af mikroskopet.
BEMÆRK: Det er værd at bemærke, at de andre pletter kan anvendes hensigtsmæssigt til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på tidligere arbejde, der optimerede de vigtigste parametre1, blev PLGA opløst i det fordampbare DCM-opløsningsmiddel. Den primære W/O-emulsion blev fremstillet ved homogenisering med gelatine under ultralydssondebehandling. Den tilpassede co-flow fluidiske struktur blev forenklet samlet, hvor en sprøjte blev anvendt til at introducere strømmene konstant. Desuden blev der udført tilstrækkelige skylleprocedurer til at eliminere PVA og gelatine i PLGA-mikrosfærer (figur 1A, supplerende figur 1A, B). Derefter blev de morfologiske egenskaber af PLGA-HOPM'er observeret ved SEM-billeddannelse. Det blev observeret, at PLGA-HOPM'erne udviste store størrelser (350-500 μm) med porer af vilkårlig størrelse (10-100 μm) og sammenkoblede vinduer, hvilket kunne lette høj effektivitet i ilt / metabolisk affaldstransport (figur 1B). Disse morfologiske resultater var i overensstemmelse med de rapporterede resultater1.
Som et proof-of-concept blev BMSC'erne ansat til forsøgsvis at dyrke inden for PLGA-HOPM'erne. Det blev antaget, at PM'ernes indre struktur kunne gøre det muligt for cellerne at klæbe til og sikre spredning under dynamisk kultur8. Derudover er begrundelsen for at vælge BMSC'er, at disse celler er kendetegnet ved multipolær differentiering og reparation af beskadigede væv og også almindeligvis anvendes til at studere den biologiske opførsel af forskellige bioaktive materialer23. BMSC'erne blev brugt til at konstruere in vitro-mikrovæv med mikrosfærerne og visualiseret cellefordeling og overlevelsestilstand ved z-analyse af CLSM (figur 1C). Det blev observeret, at et stort antal celler klæbede til stilladser i 1 d, og den grønne fluorescens blev opretholdt, hvilket repræsenterer omfattende vedhæftnings- og migrationsfunktioner for celler i PLGA-HOPM'er. Cytoplasmaet blev indirekte afbildet med calcein-AM-farvning, da acetoxymethylester (AM) -gruppen giver forbedret hydrofobicitet og letter penetrationen gennem den levende cellemembran. Selvom calcein-AM ikke har fluorescens, kan den hydrolyseres af den endogene esterase intracellulært for at generere det polære molekyle calcein med en stærk negativ ladning og udsende stærk grøn fluorescens24. Derfor visualiseres cytoplasmaet indirekte med calcein-AM-farvning (figur 1C, supplerende figur 1C).
Figur 1: Fabrikation og cytokompatibilitet af PLGA-HOPMs. (A) Skematisk illustration af fremstillingen af PLGA-HOPM'erne. (B) Porediameteren af PM'er baseret på SEM-billeddannelse (10-100 μm). Skalabar = 100 μm. (C) Levende (calcein-AM, grøn) og død (propidiumiodid, PI, rød) farvning af BMSC'er samdyrket med PLGA-HOPMs i 24 timer. Skalabjælke = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Illustrationer af den virkelige mikrofluidiske platform, emulsion og mellemlagsbilleddannelse af cellebelastede PLGA-HOPM'er. (A) Ordning med ægte dråbemikrofluidikplatform. (B) W/O-forløber emulgeret ved ultralydsbehandling. (C) Interlaget af levende og død farvning af BMSC'er samkultureret med PLGA-HOPMs i 24 timer. Skala bar = 250 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en effektiv strategi til fremstilling af PLGA-baserede arkitekturer, nemlig PLGA-HOPM'erne. Det skal bemærkes, at flere kritiske skridt skal tages omhyggeligt, herunder at undgå opløsningsmiddelfordampning af PLGA og blid justering af ultralydseffekten til målpositionen under fremstillingen af emulsionen. Derudover kan væskeudløbet på 20 ml sprøjten justeres til en vis grad for at løse faseadskillelsen af emulgerede prækursorer. En begrænsning er imidlertid, at da porogens tilstand påvirkes af miljøtemperaturen, kan emulsionens stabilitet være uønsket. Sammen kan den praktiske samling af dråbemikrofluidplatformen i væsentlig grad lette fremstillingen af cellebelastede mikrogeler til vævsteknik og lægemiddelscreeningsapplikationer. PLGA anvendes ofte som et leveringsmiddel til fremstilling af mikrosfærer, da det er en Food and Drug Administration (FDA) -godkendt lægemiddelleveringsvare25. Derudover tilbyder den alifatiske polyester harmløse nedbrydningsegenskaber via hydrolyse enten in vitro eller in vivo, som er afhængig af andelen af lactidsyre og glycolsyre under synteseprocedurer26.
For at fremstille PLGA-HOPMs blev de vandige og organiske faser homogeniseret til dannelse af en W / O-emulsion ved hjælp af ultralydssonden. Derefter blev W/O-emulsionen indført i dråbemikrofluidanordningen og udviklede sig til vand-i-olie-i-vand (W/O/W) dråber ved nålespidsen (figur 1A, supplerende figur 1A, B). De opnåede W/O/W-dråber kunne størknes ved at ekstrahere og fordampe DCM i opsamlingsfasen. Den forkølede opsamlingsfase i et isbad kan gøre det muligt for gelatinen at forblive i blød geltilstand og direkte bevare den velfordelte emulsion under opløsningsmiddelfordampning, hvilket resulterer i PLGA-HOPM'erne efter yderligere lyofilisering (figur 1B).
Derudover indeholder emulsionstemplatingmetoden flygtige organiske opløsningsmidler, som kan fjernes ved fordampning. Desuden kunne resterne af DCM i PLGA-HOPM'erne næsten helt fjernes, beregnet ud fra gaskromatografimåling2. Desuden vil den mikrofluidiske teknologi ikke påvirke PLGA's cyto/biokompatibilitet. Faktisk viste PLGA-HOPM'erne dyrket med rotte BMSC'er, at antallet af levende celler var omfattende, med kun få døde celler og den strækende morfologi. Desuden kunne cytoplasma afbildes af det levende fluorescerende farvestof, hvilket indikerer, at der strækkes på HOPM'erne.
Sammen kan PLGA-HOPM'er med fremragende morfologiske egenskaber opfylde kravene til cellulær vedhæftning og spredningsevner i hele HOPM'erne til vævsregenerering og forskellige biomedicinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK og AZC anerkender økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 og U1605225) og Program for Innovative Research Team in Science and Technology i Fujian Province University. YSZ blev hverken understøttet af nogen af disse programmer eller modtaget betaling af nogen art; I stedet anerkendes støtten fra Brigham Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
