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Bioengineering

माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी के माध्यम से अत्यधिक खुले छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स (एचओपीएम) का निर्माण

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63971
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 4, 1,2
1Institute of Biomaterials and Tissue Engineering, Huaqiao University, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Biochemical Technology, Huaqiao University, 3Affiliated Dongguan Hospital, Southern Medical University, 4Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एकल-इमल्शन फॉर्मूलेशन आधारित सरल माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के माध्यम से पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) आधारित अत्यधिक खुले छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स (एचओपीपी) के निर्माण का वर्णन करता है। इन माइक्रोसेफर्स में ऊतक इंजीनियरिंग और दवा स्क्रीनिंग में संभावित अनुप्रयोग हैं।

Abstract

थोक मचानों और अकेले कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन की तुलना में, इंजेक्टेबल मॉड्यूलर इकाइयों ने कोशिकाओं की पैकेजिंग में सुविधा, बेहतर सेल प्रतिधारण और न्यूनतम इनवेसिवनेस के कारण खराब ऊतकों की मरम्मत में भारी रुचि हासिल की है। इसके अलावा, इन माइक्रोस्केल वाहकों की छिद्रपूर्ण रचना मध्यम विनिमय को बढ़ा सकती है और पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की आपूर्ति के स्तर में सुधार कर सकती है। वर्तमान अध्ययन सेल वितरण अनुप्रयोगों के लिए सरल माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक द्वारा पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) आधारित अत्यधिक खुले छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स (पीएलजीए-एचओपीपी) के सुविधाजनक निर्माण को दर्शाता है। परिणामी मोनोस्प्रेटेड पीएलजीए-एचओपीपी में ~ 400 μm के कण आकार और इंटरकनेक्टिंग विंडो के साथ ~ 50 μm के खुले छिद्र थे। संक्षेप में, इमल्सीफाइड तेल की बूंदों (डाइक्लोरोमेथेन, डीसीएम में पीएलजीए समाधान), 7.5% (डब्ल्यू / वी) जिलेटिन जलीय चरण के साथ लपेटा गया था, को अनुकूलित माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप में समाक्षीय नलिका के माध्यम से 1% (डब्ल्यू / वी) निरंतर बहने वाले पॉली (विनाइल अल्कोहल) (पीवीए) जलीय घोल में पेश किया गया था। इसके बाद, माइक्रोसेफर्स को विलायक निष्कर्षण और लियोफिलाइजेशन प्रक्रियाओं के अधीन किया गया, जिसके परिणामस्वरूप एचओपीएम का उत्पादन हुआ। विशेष रूप से, विभिन्न फॉर्मूलेशन (पीएलजीए और पोरोजेन की सांद्रता) और प्रसंस्करण पैरामीटर (उत्सर्जित शक्ति, सुई गेज, और छितरी हुई चरण की प्रवाह दर) परिणामस्वरूप पीएलजीए एचओपीपी के गुणों और विशेषताओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, ये आर्किटेक्चर संभावित रूप से विस्तारित दवा की खोज और ऊतक पुनर्जनन अनुप्रयोगों के लिए विकास कारकों जैसे विभिन्न अन्य जैव रासायनिक संकेतों को समाहित कर सकते हैं।

Introduction

सेल से भरे माइक्रोसेफर्स अनुकूल लाभ प्रदान करते हैं, जैसे कि सीटू में बढ़ी हुई सेल प्रतिधारण क्षमता, कोशिकाओं का कुशल वितरण, और विवो1 में सेल प्रसार की बाद की क्षमता। आज तक, ऊतक पुनर्जनन या दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं के लिए अनुकूल वातावरण का समर्थन करने के लिए एक सफल मचान संरचना विकसित करने के लिए कई जांच ें सामने रखी गईहैं। हालांकि, पोषक तत्वों / ऑक्सीजन की अपर्याप्त आपूर्ति और चयापचय अपशिष्ट संचय के कारण अंदरूनी हिस्सों में हाइपोक्सिया वातावरण अक्सर अपरिहार्यहोता है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, विभिन्न बायोमैटेरियल्स 4,5,6 का उपयोग करके अत्यधिक छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स (पीएम) विकसित किए गए हैं। इसके अतिरिक्त, गतिशील संस्कृति में, मचान अत्यधिक कतरनी तनाव7 से पीड़ित हैं, और संस्कृति माध्यम की अस्थिर स्थिति पीएम की निष्ठा को तोड़ सकती है। वैकल्पिक रूप से, पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) का उपयोग गतिशील संस्कृतिके लिए अच्छी यांत्रिक शक्ति के साथ पीएम को संसाधित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने वॉल्यूमेट्रिक मांसपेशियों के नुकसान को ठीक करने के लिए माउस मायोब्लास्ट (सी 2 सी 12) से भरे पीएलजीए अत्यधिक खुले पीएम (एचओपीएस) और मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल सेल (एचयूवीईसी) से भरे पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) खोखले माइक्रोरोड्स के सह-इंजेक्शन का प्रदर्शनकिया, जिससे सीटू कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन में उल्लेखनीय सुधार हुआ।

विशेष रूप से, पीएम को बड़े सतह क्षेत्रों और उच्च छिद्रों की विशेषता है, जो सेल आसंजन और न्यूनतम इनवेसिवसेल डिलीवरी की ओर विकास के लिए विशिष्ट रुचि रखता है। इन पहलुओं को ध्यान में रखते हुए, पीएम10,11 को बनाने के लिए विभिन्न जैव-संगत सामग्रियों को नियोजित किया गया है। कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन करने वाले ये डिजाइन योग्य पीएम उत्कृष्ट आसंजन, काफी यांत्रिक शक्ति और अत्यधिक परस्पर जुड़ी खिड़कियां प्रदान करते हैं, जो क्षतिग्रस्तऊतकों की मरम्मत के लिए सेल प्रसार में सुधार कर सकते हैं। इस संबंध में, छिद्रपूर्ण क्षेत्रों को बनाने के लिए विभिन्नप्रौद्योगिकियां भी विकसित की गई हैं। एक तरफ, पीएम को गैस बनाने वाले एजेंटों का उपयोग करके उत्पादित किया गया था, जैसे कि एनएच4एचसीओ3, जिन्हें अपर्याप्त इंटरकनेक्टिविटी 15,16,17 के कारण रोक दिया गया था। दूसरी ओर, पायसीकरण के बाद पीएम को सीधे काट दिया गया था, जिसके कारण पॉलीस्प्रेट पीएम18 हो गए। अंत में, इमल्शन-टेमप्लेटिंग दृष्टिकोण पर आधारित ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक शायद पीएम के निर्माण के लिए एक कुशल तरीका है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप अक्सर समान आकार के कण19 होते हैं। विशेष रूप से, माइक्रोसेफर्स की रूपात्मक विशेषताएं अक्सर उत्पन्न इमल्शन बूंदों (यानी, पानी में तेल, डब्ल्यू / ओ, या तेल-इन-वाटर, ओ / डब्ल्यू) की गुणवत्ता पर निर्भर करती हैं, जो बायोमैटिरियल्स20 की विशेषताओं को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकती हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि माइक्रोफाइबर या माइक्रोसेफर्स उत्पन्न करने के लिए पूर्वनिर्धारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म लागू किया जा सकता है। एक उदाहरण में, यू एट अल ने केशिका-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों के आधार पर सेल से लदी माइक्रोफिब्रोस संरचनाओं के उत्पादन का प्रदर्शन किया, जिसका उपयोग प्राकृतिक ऊतकोंकी नकल करने के लिए सेलुलर नेटवर्क को इकट्ठा करने के लिए किया जा सकता है। एक अन्य उदाहरण में, ये एट अल ने माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों के माध्यम से सिलिका कोलाइडल क्रिस्टल मोतियों की टेम्पलेट प्रतिकृति द्वारा फोटोनिक क्रिस्टल माइक्रोकैप्सूल का निर्माण किया, जो वर्तमान तकनीकों की कई सीमाओं को दूर कर सकता है जिनके लिए जटिल लेबलिंग और विशिष्ट उपकरण22 की आवश्यकता होती है।

दरअसल, इस तकनीक के उपयोग के पीछे तर्क विभिन्न फायदों के कारण है, जैसे कि प्रकृति में आसान होना, किसी परिष्कृत उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और सेल वितरण और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए समान आकार के पीएम को संश्लेषित करने में इसकी सुविधा है। इस संदर्भ में, इमल्शन-टेमप्लेटिंग के पूर्वनिर्धारित घटकों के साथ, उच्च छिद्र और इंटरकनेक्टिविटी वाले पीएम को पॉली (विनाइल क्लोराइड) (पीवीसी) ट्यूबिंग, एक ग्लास केशिका और एक सुई से इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। एक डब्ल्यू / ओ इमल्शन-अग्रदूत जिलेटिन के जलीय घोल और पीएलजीए के कार्बनिक घोल को समरूप करके तैयार किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में इमल्शन के लागू हिस्से को चुनिंदा रूप से इंजेक्ट करके, एक समान कण आकार वाले पीएम और पूरे सतह से इंटीरियर तक परस्पर जुड़े छिद्रों का निर्माण किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में इमल्शन-टेमप्लेटिंग द्वारा पीएलजीए-एचओपीपी को बनाना है। यह माना जाता है कि यह प्रोटोकॉल पीएलजीए-एचओपीपी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पादन की अनुमति देता है और संभावित रूप से ऊतक इंजीनियरिंग और दवा स्क्रीनिंग के उनके संबंधित क्षेत्रों में लागू होगा।

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Protocol

1. समाधान तैयार करना

  1. पीवीए समाधान को 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करके और बाद में इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में रखकर पीवीए स्टॉक समाधान पहले से तैयार करें। प्रयोगात्मक उपयोग के लिए कमरे के तापमान (आरटी) को ठंडा करें।
  2. पीएलजीए के कार्बनिक चरण (2 एमएल, 2%, डीसीएम में डब्ल्यू / वी) में जलीय जिलेटिन घोल (1 एमएल, 7.5%, डब्ल्यू / वी) जोड़कर इमल्शन-अग्रदूत तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: आम तौर पर, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक में माइक्रोसेफर्स बनाने के लिए विभिन्न चरण शामिल होते हैं। निरंतर या एकत्रित चरण में एक जलीय पॉली (विनाइल अल्कोहल) (पीवीए, 600 एमएल, 1%, डब्ल्यू / वी) शामिल है।

2. ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस असेंबली और पीएलजीए-एचओपीपी का निर्माण

नोट: इस असेंबली के लिए आवश्यक उपभोग्य आइटम सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

  1. ड्रॉपलेट जनरेटर असेंबली को अनुकूलित करें।
    1. ग्लास केशिका (ओडी, 1 मिमी), पीवीसी ट्यूब (आईडी, 1 मिमी), और 26 जी डिस्पेंसिंग सुई का उपयोग करके एक सह-प्रवाह माइक्रोफ्लुइडिक जनरेटर का निर्माण करें।
    2. ग्लास केशिका को पीवीसी ट्यूब के अंत में कनेक्ट करें और फिर उपरोक्त संरचना के कनेक्शन पर सुई से छेद करें।
    3. बूंद पीढ़ी के दौरान निरंतर चरण में पीवीसी ट्यूब के दूसरे छोर को रखें। यूवी गोंद का उपयोग करके, इलाज के बाद जोड़ पर अंतराल को सील करें।
      नोट: पीवीसी ट्यूब पर सुविधाजनक छेदन के लिए सुई को लगभग 45 ° घुमावदार मोड़ने की आवश्यकता होती है, और समाक्षीय संरचना बनाने के लिए सुई बिंदु को केशिका ट्यूब में फैलाया जाता है।
  2. ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म तैयार करें।
    1. दो सिरिंज पंपों का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। निरंतर चरण को लोड करने के लिए 50 एमएल सिरिंज और इमल्शन गठन के लिए 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
    2. निरंतर और फैलाव चरणों की प्रवाह दर क्रमशः 2 एमएल / मिनट और 0.08 एमएल / मिनट पर सेट करें।
    3. एक बर्फ स्नान में 500 एमएल बीकर रखें और इसे प्री-कूल्ड पीवीए जलीय घोल (चरण 1.1) से भरें।
      नोट: ग्लास केशिका के अंत को संग्रह चरण में डुबोया जाना चाहिए। मंच में इमल्शन-बूंदों के गठन के बाद ग्लास रॉड के साथ एकत्र चरण के सतह पर तैरने वाले चरण को हिलाने (1 घंटे, 60 आरपीएम) का सुझाव दिया जाता है। इमल्शन की बूंदें सुई बिंदु की नोक पर उत्पन्न होती हैं। सामान्य तौर पर, सुई का गेज पीएम के आकार को प्रभावित करता है, जिसमें कम गेज पीएम के छोटे आकार से मेल खाती है। इसके अलावा, छिद्र व्यास मुख्य रूप से पोरोजेन एकाग्रता से संबंधित है, जो उचित जिलेटिन एकाग्रता1 के साथ बढ़ने में सक्षम है।
  3. पायसीकरण और बूंद पीढ़ी का प्रदर्शन करें।
    1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए इमल्शन तैयार करें।
      1. जलीय जिलेटिन समाधान को तुरंत पीएलजीए (चरण 1.2) के डीसीएम समाधान में डीसीएम घोल में डीकैंटिंग करके और अल्ट्रासोनिक डिवाइस का उपयोग करके इमल्शन तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. अल्ट्रासोनिक शक्ति को 400 डब्ल्यू में समायोजित करें, और कुल प्रसंस्करण समय को 90 एस (अंतराल 2 एस, अल्ट्रासोनिक उपचार 1 एस) के रूप में सेट करें, साथ ही मैन्युअल रूप से जांच की स्थिति को लगातार बदलें।
      3. लगभग 20 मिनट में सिरिंज सक्शन और ड्रॉपलेट जनरेशन के लिए परिणामी इमल्शन को स्थिर करें।
        नोट: अल्ट्रासोनिक सेल ब्रेकर की जांच को तेल-पानी इंटरफ़ेस में रखें। यह सुझाव दिया जाता है कि अल्ट्रासोनिक जांच को कंटेनर से संपर्क न करने दें।
    2. ड्रॉपलेट जनरेशन का प्रदर्शन करें।
      1. अल्ट्रासोनिक उपचार के बाद माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के 5 एमएल सिरिंज में तैयार इमल्शन (चरण 2.3.1) को तेजी से लोड करें।
      2. अस्थिर डब्ल्यू / ओ इमल्शन (जो चरण-पृथक्करण के दौरान है) को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में असंतुलित चरण के रूप में पेश करें। इसी समय, निरंतर चरण के रूप में पीवीए के जलीय घोल का उपयोग करें।
      3. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में इमल्शन के उचित भागों को इंजेक्ट करने के बाद एकत्र करने वाले बीकर (पीवीए, 1%, डब्ल्यू / वी) के तल पर इमल्शन युक्त माइक्रोसेफर्स एकत्र करें।
      4. आगे स्थिरीकरण के लिए नमूने को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए तैयार माइक्रोसेफर्स (पीएलजीए-एचओपीपी) को कुल्ला और लियोफिलाइज़ करें।
      नोट: उत्पन्न पीएलजीए-एचओपीपी में आंतरिक और सतह पर मनमाने ढंग से छिद्र होते हैं।
      1. आरटी में सामान्य होने से पहले माइक्रोसेफर्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और अवशिष्ट डीसीएम को खत्म करने के लिए ग्लास रॉड (1 घंटे, 60 आरपीएम) से हिलाएं।
      2. 500 एमएल बीकर में एकत्र करने के चरण को सावधानी से छान लें, और पीएम की सतह पर अवशिष्ट पीवीए को धोने के लिए एकत्र किए गए माइक्रोसेफर्स को विआयनीकृत पानी से तीन बार धोएं।
      3. पीएलजीए रीढ़ में लिपटे जिलेटिन को भंग करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पीएलजीए माइक्रोसेफर्स रखें।
      4. अवशिष्ट जिलेटिन को हटाने के लिए परिणामी पीएलजीए-एचओपीपी को दो बार विआयनीकृत पानी से धोएं और 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर लियोफिलाइजेशन के लिए प्री-कूल करें।
      5. आगे के प्रयोगों के लिए शुष्क पीएलजीए-एचओपीपीएम को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) इमेजिंग

  1. आरटी में एसईएम के नमूना चरण पर पीएलजीए-एचओपीपी जमा करें ( सामग्री की तालिका देखें) और नमूना चरण को मैग्नेट्रॉन स्पटर के स्पटर सेल में डाल दें। ट्रांसफार्मर और मैग्नेट्रॉन को एक-एक करके चालू करें। 1 मिनट के लिए सोने के साथ स्पटर-लेपित होने के बाद नमूने को एसईएम में पेश करें।
  2. त्वरण वोल्टेज 5 kV पर सेट करके SEM छवियाँ प्राप्त करें।
  3. इसके अतिरिक्त, एसईएम इमेजिंग के चर क्षेत्र में 100 पीएम का उपयोग करके पीएलजीए-एचओपीपी के कण आकार की मात्रा निर्धारित करें। छिद्र आकार वितरण को निर्धारित करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम को मापें।
    1. छवि जे के साथ ग्राफिक्स खोलें और एसईएम छवि के स्केल बार से मेल खाने के लिए "सीधी रेखा" का उपयोग करें, जो सॉफ्टवेयर को पिक्सेल से लंबाई की पहचान करता है।
    2. सेट स्केल > विश्लेषण पर क्लिक करें, एसईएम छवि के स्केल बार में "ज्ञात दूरी" सेट करें, और ग्लोबल > ओके पर क्लिक करें।
    3. पीएलजीए पीएम के छिद्र या कण आकार को मापने के लिए विश्लेषण > उपकरण > आरओआई प्रबंधक पर क्लिक करें और इसे जोड़ें पर क्लिक करें। आवश्यकता के आधार पर नमूनों की संख्या मापें।
    4. आगे की गणना के लिए ग्राफिक्स के मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए माप पर क्लिक करें।

4. सेल संस्कृति और प्रतिदीप्ति इमेजिंग

नोट: वर्तमान कार्य के लिए चूहे अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम सेल (बीएमएससी) का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में कोशिकाओं को एल-ग्लूटामाइन (डीएमईएम / एफ -12), 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  2. 90% संगम तक पहुंचने के बाद चूहे बीएमएससी को 1: 2 अनुपात में पारित करें।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सेल आसंजन करें।
    1. पीएलजीए-एचओपीपी को एथिल अल्कोहल (5 एमएल, 70%, वी / वी) और सेंट्रीफ्यूज के साथ आरटी में 10 मिनट के लिए 500 x g पर इनक्यूबेट करें।
    2. फॉस्फेट बफर समाधान के साथ निष्फल पीएलजीए-एचओपीपी को दो बार धोएं।
    3. पीएलजीए-एचओपीएस के लिए बीएमएससी आसंजन के लिए गतिशील संस्कृति के तहत एक बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (50 एमएल ) में सेल सस्पेंशन (5 एमएल, 1 x 10 5 सेल / एमएल) के साथ एचओएमपी (संख्या में पांच) को इनक्यूबेट करें।
    4. शेकर में एक सील 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखकर थर्मोस्टेटिक एसेप्टिक शेकर (37 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम) में गतिशील संस्कृति का प्रदर्शन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: गतिशील संस्कृति प्लास्टिक प्लेट पर सीधे पीएम और कोशिकाओं को शामिल करने के बजाय मचानों पर बीएमएससी की पालन दर को बढ़ाने का इरादा रखती है। कोशिकाओं और पीएलजीए पीएम को 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा जाता है, ट्यूब को थर्मोस्टैटिक एसेप्टिक शेकर (37 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम) पर इंजेक्ट किया जाता है और हर 2 दिनों में मीडिया को बदल दिया जाता है।
  4. जीवित और मृत दोहरे दाग परख का प्रदर्शन करें।
    1. पीएलजीए-एचओपीपी से जुड़े बिना बीएमएससी को एल्यूट करने के लिए सेल से भरे पीएम को तीन बार कुल्ला करें।
    2. सेल से भरे पीएम को 35 मिमी ग्लास-बॉटम प्लेट पर रखें। पीबीएस-प्रीवॉश किए गए नमूने में क्रमशः कैल्सीन-एएम और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के 1 μL सहित 1 एमएल धुंधला बफर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूने का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। संबंधित डिटेक्टर पर 488 एनएम और 552 एनएम के उत्तेजना प्रकाश पर स्विच करें। जेड-ओवरले विश्लेषण के लिए, माइक्रोस्कोप के जेड-अक्ष आंदोलन द्वारा नमूने की विभिन्न परतों को पकड़ने के लिए जेड-वाइड सेट करें।
      नोट: यह ध्यान देने योग्य है कि अन्य दागों को विश्लेषण के लिए उचित रूप से नियोजित किया जा सकता है।

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Representative Results

पिछले काम के आधार पर जो प्रमुख मापदंडों1 को अनुकूलित करता था, पीएलजीए को इवोपोरबल डीसीएम विलायक में भंग कर दिया गया था। प्राथमिक डब्ल्यू / ओ इमल्शन अल्ट्रासोनिक जांच उपचार के तहत जिलेटिन के साथ समरूप करके तैयार किया गया था। अनुकूलित सह-प्रवाह द्रव संरचना को सरल रूप से इकट्ठा किया गया था, जिसमें प्रवाह को लगातार पेश करने के लिए एक सिरिंज नियोजित किया गया था। इसके अलावा, पीएलजीए माइक्रोसेफर्स के पीवीए और जिलेटिन को खत्म करने के लिए पर्याप्त कुल्ला प्रक्रियाएं की गईं (चित्रा 1 ए, पूरक चित्रा 1 ए, बी)। इसके बाद, एसईएम इमेजिंग द्वारा पीएलजीए-एचओपीपी की रूपात्मक विशेषताओं को देखा गया। यह देखा गया कि पीएलजीए-एचओपीपी ने मनमाने आकार के छिद्रों (10-100 μm) और परस्पर खिड़कियों के साथ बड़े आकार (350-500 μm) का प्रदर्शन किया, जो ऑक्सीजन / चयापचय अपशिष्ट परिवहन में उच्च दक्षता की सुविधा प्रदान कर सकता है (चित्रा 1 बी)। ये रूपात्मक परिणाम रिपोर्ट किए गए परिणामों के अनुरूप थे।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, बीएमएससी को पीएलजीए-एचओपीपी के भीतर अस्थायी रूप से संस्कृति के लिए नियोजित किया गया था। यह माना जाता था कि पीएम की आंतरिक संरचना कोशिकाओं को गतिशील संस्कृति 8 के दौरान प्रसार का पालन करने और सुनिश्चित करने की अनुमति दे सकतीहै। इसके अलावा, बीएमएससी का चयन करने के लिए तर्क यह है कि इन कोशिकाओं को बहुध्रुवीय भेदभाव और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत की विशेषता है, और आमतौर पर विभिन्न बायोएक्टिव सामग्रियों के जैविक व्यवहार का अध्ययन करने के लिए भी नियोजित किया जाताहै। बीएमएससी का उपयोग माइक्रोसेफर्स के साथ इन विट्रो माइक्रोटिश्यू बनाने के लिए किया गया था और सीएलएसएम (चित्रा 1 सी) के जेड-विश्लेषण द्वारा सेल वितरण और उत्तरजीविता स्थिति की कल्पना की गई थी। यह देखा गया कि बड़ी संख्या में कोशिकाओं ने 1 डी में मचानों का पालन किया, और हरे रंग की प्रतिदीप्ति को बनाए रखा गया, जो पीएलजीए-एचओपीएम में कोशिकाओं के व्यापक आसंजन और प्रवासन क्षमताओं का प्रतिनिधित्व करता है। साइटोप्लाज्म को अप्रत्यक्ष रूप से कैल्सीन-एएम धुंधला के साथ चित्रित किया गया था क्योंकि एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर (एएम) समूह बेहतर हाइड्रोफोबिसिटी प्रदान करता है और जीवित कोशिका झिल्ली के माध्यम से प्रवेश की सुविधा प्रदान करता है। यद्यपि कैल्सीन-एएम में कोई प्रतिदीप्ति नहीं है, इसे अंतर्जात एस्टरेज़ द्वारा इंट्रासेल्युलर रूप से एक मजबूत नकारात्मक चार्ज के साथ ध्रुवीय अणु कैल्सीन उत्पन्न करने और मजबूत हरे प्रतिदीप्ति24 का उत्सर्जन करने के लिए हाइड्रोलाइज्ड किया जा सकता है। इसलिए, साइटोप्लाज्म को अप्रत्यक्ष रूप से कैल्सीन-एएम धुंधला (चित्रा 1 सी, पूरक चित्रा 1 सी) के साथ कल्पना की जाती है।

Figure 1
चित्र 1: पीएलजीए-एचओपीपीएमएस का निर्माण और साइटोकम्पैटिबिलिटी( ए) पीएलजीए-एचओपीपीएमएस के निर्माण का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) एसईएम इमेजिंग (10-100 μm) के आधार पर पीएम का छिद्र व्यास। स्केल बार = 100 μm. (C) 24 घंटे के लिए PLGA-HOPMs के साथ सह-संवर्धन किए गए BMSCs के जीवित (कैल्सीन-एएम, हरा) और मृत (प्रोपिडियम आयोडाइड, पीआई, लाल) धुंधलापन। स्केल पट्टी = 250 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: सेल से लदे पीएलजीए-एचओपीपी के वास्तविक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म, इमल्शन और इंटरलेयर इमेजिंग के चित्र। (ए) वास्तविक ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स प्लेटफॉर्म की योजना। (बी) अल्ट्रासाउंड उपचार द्वारा डब्ल्यू / ओ अग्रदूत इमल्सीफाइड। (ग) बीएमएससी के जीवित और मृत धुंधलापन का अंतर 24 घंटे के लिए पीएलजीए-एचओपीपी के साथ सह-संवर्धन करता है। स्केल पट्टी = 250 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह आलेख PLGA-आधारित आर्किटेक्चर, अर्थात् PLGA-HOPMs बनाने के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से उठाए जाने चाहिए, जिसमें पीएलजीए के विलायक वाष्पीकरण से बचना और इमल्शन की तैयारी के दौरान लक्ष्य स्थिति में अल्ट्रासोनिक शक्ति का कोमल समायोजन शामिल है। इसके अलावा, इमल्सीफाइड अग्रदूतों के चरण पृथक्करण को हल करने के लिए 20 एमएल सिरिंज के तरल आउटलेट को एक निश्चित सीमा तक समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, एक सीमा यह है कि, चूंकि पोरोजेन की स्थिति पर्यावरणीय तापमान से प्रभावित होती है, इसलिए इमल्शन की स्थिरता अवांछनीय हो सकती है। साथ में, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म की सुविधाजनक असेंबली ऊतक इंजीनियरिंग और दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए सेल से भरे माइक्रोगेल के निर्माण की सुविधा प्रदान कर सकती है। पीएलजीए को अक्सर माइक्रोसेफर्स बनाने में एक वितरण वाहन के रूप में लागू किया जाता है क्योंकि यह एक खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित दवा वितरण वस्तु25 है। इसके अलावा, एलिफैटिक पॉलिएस्टर हाइड्रोलिसिस के माध्यम से हानिरहित गिरावट विशेषताएं प्रदान करता है या तो विट्रो या विवो में, जोसंश्लेषण प्रक्रियाओं के दौरान लैक्टाइड एसिड और ग्लाइकोलिक एसिड के अनुपात पर निर्भर है।

पीएलजीए-एचओपीपी को बनाने के लिए, जलीय और कार्बनिक चरणों को अल्ट्रासोनिक जांच का उपयोग करके डब्ल्यू / ओ इमल्शन बनाने के लिए समरूप किया गया था। फिर, डब्ल्यू / ओ इमल्शन को ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में पेश किया गया और सुई की नोक (चित्रा 1 ए, पूरक चित्रा 1 ए, बी) पर पानी में तेल-इन-पानी (डब्ल्यू / ओ / डब्ल्यू) बूंदों में विकसित हुआ। प्राप्त डब्ल्यू /ओ / डब्ल्यू बूंदों को एकत्र चरण में डीसीएम को निकालकर और वाष्पित करके ठोस किया जा सकता है। बर्फ स्नान में प्री-कूल्ड संग्रह चरण जिलेटिन को नरम-जेल अवस्था में रहने की अनुमति दे सकता है, सीधे विलायक-वाष्पीकरण के दौरान अच्छी तरह से वितरित इमल्शन को बनाए रख सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आगे लियोफिलाइजेशन के बाद पीएलजीए-एचओपीपीएम हो सकते हैं (चित्रा 1 बी)।

इसके अलावा, इमल्शन-टेमप्लेटिंग विधि में वाष्पशील कार्बनिक सॉल्वैंट्स होते हैं, जिन्हें वाष्पीकरण द्वारा हटाया जा सकता है। इसके अलावा, पीएलजीए-एचओपीपी में डीसीएम के अवशेषों को लगभग पूरी तरह से हटाया जा सकता है, गैस क्रोमैटोग्राफी माप2 से गणना की जा सकती है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक पीएलजीए की साइटो / बायोकम्पैटिबिलिटी को प्रभावित नहीं करेगी। वास्तव में, चूहे बीएमएससी के साथ संवर्धित पीएलजीए-एचओपीपी ने दिखाया कि जीवित कोशिकाओं की संख्या व्यापक थी, जिसमें केवल कुछ मृत कोशिकाएं और स्ट्रेचिंग आकृति विज्ञान था। इसके अलावा, साइटोप्लाज्म को लाइव फ्लोरोसेंट डाई द्वारा चित्रित किया जा सकता है, जो एचओपीपी पर खिंचाव का संकेत देता है।

साथ में, उत्कृष्ट रूपात्मक विशेषताओं के साथ पीएलजीए-एचओपीपी ऊतक पुनर्जनन और विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए पूरे एचओपीपी में सेलुलर आसंजन और प्रसार क्षमताओं से संबंधित आवश्यकताओं को पूरा कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एससीएल, वाईडब्ल्यू, आरकेके और एजेडसी चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, 32071323, 81971734 और यू 1605225) और फ़ुज़ियान प्रांत विश्वविद्यालय में विज्ञान और प्रौद्योगिकी में अभिनव अनुसंधान टीम के लिए कार्यक्रम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। वाईएसजेड को न तो इनमें से किसी भी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और न ही किसी भी प्रकार का भुगतान प्राप्त हुआ था; इसके बजाय, ब्रिघम रिसर्च इंस्टीट्यूट से समर्थन स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge tube Solarbio, Beijing, China 5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy Leica, Wetzlar, Germany TCS SP8
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China 20161110 Research Grade
Dispensing needle Kindly, Shanghai, China 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12 Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA 15400054 DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's
Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12
50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China 20210918 Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra Research Grade
Freeze drier Bilon, Shanghai, China FD-1B-50
Gelatin Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# SZBF2870V From porcine skin, Type A
Glass bottom plate Biosharp, Hefei, China BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary Huaou, Jiangsu, China 0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker Zhicheng, Shanghai, China ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit Solarbio, Beijing, China 60421211112 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge Xiangyi, Hunan, China TD5A
Magnetron sputter Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China MSP-2S
Microflow injection pump Harvard Apparatus, Holliston, USA Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra 2135250 Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS) Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China GP21090181556 PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid) Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# MKCF9651 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# MKCK4266 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube Shenchen, Shanghai, China Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope Phenom pure, Eindhoven, Netherlands Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose Kindly, Shanghai, China 5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath Mingxiang, Shenzhen, China 36 W
Transformer Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China JY 92-IID
UV curing glue Zhuolide, Foshan, China D-3100

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बायोइंजीनियरिंग अंक 183
माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी के <em>माध्यम से</em> अत्यधिक खुले छिद्रपूर्ण माइक्रोसेफर्स (एचओपीएम) का निर्माण
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Luo, S. C., Wang, Y., Kankala, R.… More

Luo, S. C., Wang, Y., Kankala, R. K., Zhang, Y. S., Chen, A. Z. Fabricating Highly Open Porous Microspheres (HOPMs) via Microfluidic Technology. J. Vis. Exp. (183), e63971, doi:10.3791/63971 (2022).

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