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Anestesia e Intubação de Filhotes de Camundongos Pré-Adolescentes para Cirurgia Cardiotorácica

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DOI:

10.3791/64004

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2 de junho de 2022

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos cirúrgicos cardiotorácicos em camundongos com >7 dias de idade requerem intubação, mas isso é um desafio para filhotes de camundongos pré-adolescentes (8-14 dias de idade) e há pouca informação sobre regimes anestésicos para intubação. Aqui, apresentamos esquemas posológicos de cetamina/xilazina/atropina em filhotes de camundongos C57BL/6J de 10 dias de idade que permitem a intubação endotraqueal, minimizando a mortalidade animal.

Resumo

Os modelos cirúrgicos murinos desempenham um papel importante na pesquisa pré-clínica. Insights mecanicistas sobre a regeneração miocárdica após lesão cardíaca podem ser obtidos a partir de modelos de cirurgia cardiotorácica em camundongos de 0 a 14 dias de idade, cujos cardiomiócitos, ao contrário dos adultos, retêm a capacidade proliferativa. Filhotes de camundongos com até 7 dias de idade são efetivamente imobilizados por hipotermia e não necessitam de intubação para cirurgia cardiotorácica. Filhotes de camundongos pré-adolescentes (8-14 dias de idade), no entanto, requerem intubação, mas isso é um desafio e há pouca informação sobre anestesia para facilitar a intubação. Aqui, apresentamos esquemas posológicos de cetamina/xilazina/atropina em filhotes de camundongos C57BL/6J de 10 dias de idade que permitem a intubação endotraqueal, minimizando a mortalidade animal. A titulação empírica dos regimes posológicos de cetamina/xilazina/atropina para o peso corporal indicou que a resposta à anestesia de filhotes de camundongos de diferentes pesos foi não linear, em que doses de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg facilitaram a intubação de filhotes pesando entre 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) e 5,50-8,10 g (n = 20), respectivamente. Filhotes de menor peso corporal necessitaram de mais tentativas de intubação do que filhotes mais pesados (p < 0,001). A sobrevida pós-intubação correlacionou-se com o peso corporal (59%, 70% e 80% para os grupos de baixo, médio e alto peso, respectivamente, R2 = 0,995). Para a cirurgia de infarto do miocárdio após a intubação, um plano cirúrgico de anestesia foi induzido com isoflurano a 4,5% em oxigênio a 100% e mantido com isoflurano a 2% em oxigênio a 100%. A sobrevida pós-operatória foi semelhante para os três grupos de peso em 92%, 86% e 88% (p = 0,91). Juntamente com refinamentos nas práticas de manejo de animais para intubação e cirurgia, e minimizando a canibalização pela barragem pós-cirurgia, a sobrevida global de todo o procedimento (intubação mais cirurgia) correlacionou-se com o peso corporal (55%, 60% e 70% para os grupos de baixo, médio e alto peso, respectivamente, R2 = 0,978). Dada a dificuldade encontrada com a intubação de filhotes de 10 dias de idade e a alta mortalidade associada, recomendamos que a cirurgia cardiotorácica em filhotes de 10 dias de idade seja restrita a filhotes com peso mínimo de 5,5 g.

Introdução

Os modelos murinos são ferramentas inestimáveis na pesquisa cardiotorácica pré-clínica, em particular devido à facilidade com que as linhagens de camundongos geneticamente modificadas podem ser geradas, e também à facilidade com que os camundongos podem ser manipulados cirurgicamente para fornecer modelos de doenças patológicas que permitam, por exemplo, o estudo da regeneração miocárdica após lesão cardíaca1 . A esse respeito, é interessante que, ao contrário de camundongos adultos em que os cardiomiócitos se retiraram do ciclo celular, os corações neonatais de camundongos de 0 a 2 dias de idade se reparam com cicatrizes mínimas após ressecção apical ou indução de infarto do miocárdio 2,3,4. Em contraste, os corações neonatais de 7 dias de idade se regeneram incompletamente com maior incidência de cicatrizes 2,3. Como os cardiomiócitos no ápice do ventrículo esquerdo retêm a capacidade proliferativa por até 2 semanas após o nascimento, estudos mecanicistas de regeneração após lesão cardíaca em camundongos de 0 a 14 dias de idade podem ser informativos para identificar alvos terapêuticos para a regeneração do coração adulto lesado5.

O desenvolvimento de modelos de lesão cardíaca em camundongos envolve manipulação cirúrgica sob anestesia. Isso requer que o tórax seja aberto para acessar o coração, o que geralmente exige intubação e ventilação mecânica. A tensão do rato, o peso corporal e a idade influenciam a sensibilidade aos anestésicos6. Camundongos adultos podem ser anestesiados com uma ampla gama de agentes, sendo um regime comum para intubação cetamina/xilazina/atropina a 100/13/0,5 mg/kg 6,7. Camundongos neonatais (0-7 dias de idade) não possuem reflexo de dor centralizado, podendo ser efetivamente imobilizados no gelo e submetidos à cirurgia sem intubação 6,8,9. Filhotes de camundongos pré-adolescentes (8-14 dias de idade) não podem ser anestesiados com hipotermia 9,10; necessitam de intubação para cirurgia cardiotorácica. Não há estudos prévios sobre cirurgia cardiotorácica em camundongos pré-adolescentes com menos de 14 dias de idade. Em nossa experiência, a intubação de camundongos pré-adolescentes anestesiados com isoflurano com menos de 14 dias de idade é difícil. O regime anestésico injetável recomendado para camundongos com mais de 7 dias é de 50-150 mg/kg de cetamina e 5-10 mg/kg de xilazina10. Camundongos pré-adolescentes ainda estão se desenvolvendo neurologicamente e suas respostas às drogas e ao metabolismo das drogas são muito diferentes dos animais adultos6. Isso representa um risco aumentado de desequilíbrio líquido, eletrólito e ácido-básico, bem como hipoglicemia e hipotermia devido não apenas à sua alta taxa metabólica, que rapidamente esgota seus estoques limitados de energia, mas também devido à sua imaturidade termorreguladora 6,11,12. Assim, há pouca informação sobre regimes anestésicos que facilitem a intubação e maximizem a sobrevida de camundongos pré-adolescentes.

Aqui, titulamos empiricamente os regimes posológicos de cetamina/xilazina/atropina em filhotes de camundongos C57BL/6J de 10 dias de idade, variando em peso de 3-8 g para alcançar um plano de anestesia suficiente para permitir a intubação endotraqueal para a cirurgia cardiotorácica subsequente, minimizando a mortalidade animal. Também refinamos as práticas de manuseio de animais para reduzir a mortalidade por intubação, cirurgia e canibalismo materno pós-cirúrgico.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Garvan/St Vincent, de acordo com o Código de Prática Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos e as diretrizes ARRIVE, e todos os experimentos foram realizados por um cirurgião experiente de pequenos animais (TJ) com orientação de um anestesista pediátrico (JJS).

1. Preparação dos instrumentos

  1. No dia da cirurgia, montar equipamentos especializados para intubação de filhotes de 10 dias de idade (Figura 1A,B). Isso inclui uma lâmpada de aquecimento, plataforma de intubação, luz de fibra óptica, pinça pequena, um laringoscópio formado a partir de um pedaço de fio de cobre de 0,02 mm de diâmetro (60 mm de comprimento com a extremidade do fio moldada em um círculo de 3 mm de diâmetro em um ângulo de 175°; Figura 1B) e cânula plástica intravenosa (i.v.) de calibre 24, que é utilizada como tubo endotraqueal.
  2. Certifique-se de que a cânula consiste em uma tubulação plástica de 19 mm de comprimento (0,7 mm OD) conectada a um adaptador de luer lock fêmea de plástico de 21 mm (Figura 1B). Enrijeça a tubulação da cânula inserindo um pedaço de fio de cobre através do adaptador luer lock. Use uma cânula com um volume total de 130 μL para um rato com volume corrente de ~8 μL/g13,14.

2. Anestesia de camundongos de 10 dias de idade

  1. No dia da cirurgia, retire a barragem de uma gaiola de filhotes C57BL/6J de 10 dias de idade e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento (37 °C).
  2. Anestesiar os filhotes em injeção intraperitoneal de 10 μL por g de peso corporal usando uma seringa de insulina de 0,5 mL e uma agulha de 29 G com cetamina/xilazina/atropina nas proporções detalhadas na Tabela 1 para diferentes grupos de peso.
  3. Imediatamente após a injeção, coloque o filhote em uma câmara de plexiglass aquecida (37 °C) que tenha sido pré-oxigenada com oxigênio a 100%.

3. Intubação de camundongos de 10 dias de idade

  1. Após 3-4 min de oxigenação, transfira o filhote para uma plataforma de intubação essencialmente como para camundongos adultos. Efectue-o com o filhote em decúbito dorsal (Figura 1C) ou suspenso num ângulo de 45°15. Mantenha a temperatura com uma lâmpada de aquecimento.
    1. Antes da intubação, avalie a profundidade da anestesia pelo reflexo de pinça da pata. Para uma intubação ideal, o reflexo de pinça da pata ainda deve estar presente, mas acentuadamente reduzido em relação ao de um animal consciente.
  2. Após a fixação do filhote anestesiado em decúbito dorsal a uma plataforma de intubação (Figura 1C), segure a língua com pinça pequena e utilize um laringoscópio formado a partir de um pedaço de fio de cobre (Figura 1B) para expor a glote e as pregas vocais. Auxílio na visualização das pregas vocais por transiluminação com luz flexível de fibra óptica (Figura 1D).
  3. Usando uma cânula enrijecida, incline a cânula de modo que a extremidade do luer lock fique um pouco mais baixa (~10°) do que a ponta e, assim que as cordas vocais se separarem, insira a cânula e avance-a até que o adaptador luer lock esteja fora da boca. Retire o fio imediatamente após a intubação.
    NOTA: Nenhuma resistência durante a intubação é esperada em camundongos desta idade, a menos que a cânula esteja avançada demais e a resistência seja sentida a partir da carina.
    1. Avaliar a profundidade da anestesia após a intubação pela capacidade do animal de respirar espontaneamente. Confirme a intubação traqueal bem-sucedida de filhotes que respiram espontaneamente, bloqueando brevemente o cateter de intubação para verificar se isso impede o movimento do tórax.
  4. Transfira imediatamente o filhote intubado para uma almofada de aquecimento (37 °C) e conecte a cânula endotraqueal a um ventilador fornecendo oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min com 30 μL/braçada, 40 μL/acidente vascular cerebral ou 50 μL/acidente vascular cerebral por 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g ou 5,50-8,10 g de filhotes, respectivamente, e 150 braçadas/min.
  5. Realize esses procedimentos rapidamente, dentro de <15 s para minimizar a re-respiração.

4. Cirurgia de infarto do miocárdio de camundongos de 10 dias de idade

  1. Para induzir um plano cirúrgico de anestesia para cirurgia, mude o gás que flui para o ventilador de 100% de oxigênio para 4,5% de isoflurano em oxigênio (a concentração de isoflurano sendo determinada por um vaporizador) por 4-5min.
    1. Depois de mudar para isoflurano, confirme novamente a intubação traqueal, verificando se a frequência de movimento da parede torácica é igual à do ventilador. A perda da respiração espontânea seguida pela ausência de um reflexo de aperto de cauda ou pata indica que um plano cirúrgico de anestesia foi atingido (após 4-5 min).
  2. Manter a anestesia com isoflurano a 2% em oxigênio.
  3. Realizar cirurgia de infarto do miocárdio ao microscópio cirúrgico (objetivo 10x e 16x), conforme descrito em16.
    1. Desinfete a pele em um movimento circular várias vezes com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina, e álcool a 70%. Usando uma tesoura fina, faça uma incisão horizontal da pele entre a terceira e a quarta costela (quarto espaço intercostal) na parede lateral esquerda do tórax. Usando pinças finas, abra o tórax por dissecção contundente do espaço intercostal e use um afastador para manter o espaço aberto.
    2. Induzir um infarto do miocárdio por ligadura da artéria coronária esquerda apenas distal ao apêndice atrial esquerdo com sutura de monofilamento de polipropileno 9-0. Após a cirurgia de infarto ~ 10 min, feche a pele com 7-0 prolene e desinfete a incisão com betadine. Limpe o filhote de sangue com etanol a 70% ou solução salina.
      NOTA: A ligadura da artéria coronária esquerda em filhotes pré-adolescentes é essencialmente sem sangue, como acontece com as ligaduras adultas.
    3. Administrar um após o outro com uma seringa de insulina de 0,5 mL e agulha 29 G: atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneal) para rápida recuperação da sedação, analgesia (buprenorfina, 0,075 mg/kg, 10 μL, subcutânea) e solução salina (50 μL, intraperitoneal).
  4. Permitir que os animais se recuperem descontinuando o isoflurano. Certifique-se de que a respiração espontânea seja retomada dentro de alguns minutos depois.
    1. Devolva o filhote à câmara pré-oxigenada aquecida e monitore continuamente durante a recuperação até que o reflexo de endireitamento seja recuperado, momento em que extubar o filhote.
    2. Esfregue suavemente o filhote com a cama da gaiola caseira, mantenha o filhote aquecido, verifique se a respiração é regular e se o filhote é capaz de movimento espontâneo. Isso reduzirá o canibalismo pós-cirúrgico pela barragem.
  5. Devolva a barragem à gaiola quando todos os filhotes tiverem se recuperado totalmente da anestesia.
    NOTA: O tempo total necessário para a preparação, anestesia, intubação, cirurgia e recuperação de um filhote pode variar de 40-60 min.
  6. Represa da casa e filhotes durante a noite em uma gaiola colocada metade sobre / metade de uma almofada de aquecimento de 37 ° C.

5. Avaliação pós-cirúrgica do tamanho do infarto

  1. No3º dia de pós-operatório, anestesiar os filhotes colocando-os em uma câmara de plexiglass pré-equilibrada com isoflurano a 4,5% em oxigênio a uma vazão de 1 mL/min.
  2. Uma vez que um plano cirúrgico de anestesia tenha sido atingido (após 4-5 min), avaliado pelo reflexo de pinça da pata, remova o filhote da câmara e prenda em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento prendendo a cauda.
  3. Coloque um fio sobre os incisivos e fita adesiva na posição para manter a cabeça estendida e coloque a cabeça em um cone nasal conectado a um ventilador que fornece 4,5% de isoflurano em oxigênio a 200 μL / curso, 150 cursos / min. Manter um plano cirúrgico de anestesia com isoflurano a 2% em oxigênio.
  4. Desinfete a pele com etanol a 70%. Usando uma tesoura fina, faça uma incisão de 1 cm na pele sobre a artéria carótida comum direita ao longo da traqueia e canule o vaso exposto usando um único tubo de polietileno de lúmen (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) para administrar 0,2 mL de solução salina heparinizada (200 U) por 1 min para evitar a coagulação do sangue.
  5. Aumentar o isoflurano para 4,5% em oxigênio por 1 min antes de administrar rapidamente 0,2 mL de 3,3 M KCl dentro de 2 s para deter o coração na diástole.
  6. Dissecar a veia jugular direita através da mesma incisão e transectá-la. Perfundir o coração com 0,2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, perfundir com 0,1mL de Azul Alciano a 0,2% para manchar o miocárdio remoto não infartado. Verifique a perfusão bem-sucedida, evidenciada pela lavagem do sangue, PBS e, em seguida, Alcian Blue através da veia jugular.
  7. Abra o tórax e excise o coração, dissecando o tecido conjuntivo circundante e os vasos para liberar o coração. Lave o coração em PBS, remova os átrios, se desejar, e fotografe o coração com uma câmera montada em um microscópio cirúrgico usando uma objetiva de 10x.

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Resultados

Anestesia de camundongos de 10 dias de idade. Os filhotes de 10 dias de idade podem ser anestesiados com isoflurano a 4,5% em 4-5 min; no entanto, eles se recuperam da anestesia no processo de preparação para a intubação. Devido ao seu pequeno tamanho, a intubação sob anestesia com isoflurano administrada por um cone nasal padrão não é viável. Utilizamos previamente um esquema anestésico de cetamina/xilazina/atropina de 100/13/0,5 mg/kg, respectivamente, para cirurgia cardiotorácica em filhotes e adultos...

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Discussão

Atualmente, não existem métodos bem documentados para anestesia e intubação de camundongos de 10 dias de idade para cirurgia cardiotorácica. Para este fim, titulamos os regimes de dosagem de cetamina/xilazina/atropina para o peso corporal, em que doses de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg facilitaram a intubação de filhotes com baixo (3,15-4,49 g), médio (4,50-5,49 g) e alto (5,50-8,10 g) de peso corporal, respectivamente. A sobrevida pós-intubação correlacionou-se com o peso corporal (59%, 70% e 80% par...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NHMRC Program Grant [ID 1074386], uma bolsa da Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research [RMG] e uma bolsa do RT Hall Trust [RMG & SEI].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Atipamezol (Antisedan)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropina 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprenorfina (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
Luz de fibra ópticaLeica 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersão 9.1.2
Plataforma de intubação --Qualquer caixa robusta (por exemplo, caixa de ponta de plástico) com dimensões aproximadas 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Cetamina 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Cânula intravenosa de plástico 24-gauge Polywin Safety BD Insyte CE008619 mm de comprimento de tubo de plástico (0,7 mm de diâmetro externo) conectado a um adaptador de trava luer fêmea de plástico de 21 mm; volume total do anel 130 μ L
Tubo de polietileno de lúmen únicoCritchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSWDiâmetro externo 0,61 mm, diâmetro interno 0,28 mm
Pinça pequenaFSTNO 11051-10
Microscópio cirúrgico (câmera opcional)Leica M651 (câmera Leica IC80 HD)Objetiva de 10x e 16x
Sutura 7-0 proleneEthicon8708H
Sutura 9-0 monofilamento de polipropilenoEthicon2813
V-1 Tampo de mesa com sistema de anestesia de isoflurano de limpeza ativaVetEquip901820
Câmara de indução de plexiglass ventilada de 2 litrosVetQuip Pty Ltd94210225 cm (L) x 13 cm (L) x 11 cm (H)
Lâmpada de aquecimentoBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

Referências

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