Summary
Анализ CAM-Delam для оценки метастатической способности раковых клеток относительно быстрый, простой и дешевый. Метод может быть использован для разгадки молекулярных механизмов, регулирующих образование метастазов, и для скрининга лекарственных средств. Оптимизированный анализ для анализа образцов опухолей человека может быть клиническим методом персонализированного лечения рака.
Abstract
Основной причиной смертей, связанных с раком, является образование метастазов (то есть когда раковые клетки распространяются от первичной опухоли к отдаленным органам и образуют вторичные опухоли). Расслоение, определяемое как деградация базальной пластинки и базальной мембраны, является начальным процессом, который облегчает трансмиграцию и распространение раковых клеток в другие ткани и органы. Оценка расслояющей способности раковых клеток будет указывать на метастатический потенциал этих клеток.
Мы разработали стандартизированный метод, ex ovo CAM-Delam assay, для визуализации и количественной оценки способности раковых клеток расслаиваться и вторгаться, тем самым имея возможность оценивать метастатическую агрессивность. Вкратце, метод CAM-Delam включает посев раковых клеток в силиконовые кольца на хориоаллантоидной мембране цыпленка (CAM) на эмбриональный день 10 с последующей инкубацией от нескольких часов до нескольких дней. Анализ CAM-Delam включает использование внутренней увлажненной камеры во время инкубации эмбриона цыпленка. Этот новый подход увеличил выживаемость эмбрионов с 10%-50% до 80%-90%, что решило предыдущие технические проблемы с низкими показателями выживаемости эмбрионов в различных анализах CAM.
Затем образцы CAM с ассоциированными кластерами раковых клеток были выделены, зафиксированы и заморожены. Наконец, криостатные образцы были визуализированы и проанализированы на предмет повреждения базальной мембраны и инвазии раковых клеток с использованием иммуногистохимии. Оценивая различные известные метастатические и неметастатические линии раковых клеток, предназначенные для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), количественные результаты CAM-Delam показали, что паттерны расслоения отражают метастатическую агрессивность и могут быть оценены в четыре категории. Будущее использование этого анализа, помимо количественной оценки способности к расслоению как признака метастатической агрессивности, заключается в разгадке молекулярных механизмов, которые контролируют расслоение, инвазию, образование микрометастазов и изменения в микроокружении опухоли.
Introduction
Примерно 90% смертности у больных раком вызвано последствиями метастазирования рака, которое представляет собой образование вторичных опухолей в других частях тела, откуда рак изначально возник1. Поэтому важно выявить механизмы, связанные с метастазами, чтобы найти потенциальные мишени для подавления образования метастазов опухоли. Впоследствии возникает потребность в модельных системах, в которых можно оценить метастатический процесс.
Во время метастазирования раковые клетки подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМТ), нормальному клеточному процессу, в котором эпителиальные клетки теряют свои свойства адгезии и полярности и вместо этого приобретают инвазивный мезенхимальный характер2. Расслоение является частью процесса ЭМТ и включает деградацию ламинина в базальной мембране, что является предпосылкой для того, чтобы раковые клетки покинули первичную опухоль и вторглись в другие ткани. Основными факторами, которые регулируются при образовании метастазов, являются матричные металлопротеиназы (MMP), ADAM (дезинтергин и металлопротеиназа), ADAMTS (ADAM с тромбоспондиновыми мотивами) и MMP мембранного типа (MT-MMP)3,4. Эти факторы разрушают молекулы, такие как ламинин, который экспрессируется во всех базальных мембранах, чтобы облегчить миграцию и инвазию клеток.
Хориоаллантоическая мембрана (CAM) оплодотворенной яйцеклетки цыпленка является типом базальной мембраны. Оплодотворенные яйца цыплят были использованы в качестве метастатических моделей, в которых раковые клетки были посеяны на внеэмбриональный CAM и более позднее образование метастазов, наблюдаемое в эмбрионах цыплят5. Кроме того, часто используются мышиные метастатические модели in vivo , в которых раковые клетки имплантируются мышам и анализируются метастазы в различных органах6. Такой подход отнимает много времени, дорог и может вызвать дискомфорт у животных. Чтобы решить эту проблему, мы разработали анализ CAM-Delam, более быструю и дешевую модель для оценки метастатической агрессивности раковых клеток. В этой модели способность раковых клеток разлагать CAM цыпленка (например, способность к расслоению) сочетается с потенциальной инвазией раковых клеток в мезенхиму и используется в качестве измерения метастатической агрессивности.
Настоящая статья, основанная на предыдущей публикации7, подробно описывает анализ CAM-Delam, от обработки оплодотворенных яйцеклеток цыплят, культуры раковых клеток и посева, вскрытия и анализа образцов CAM до оценки расслояющей способности раковых клеток на четыре категории: неповрежденные, измененные, поврежденные и инвазия. Мы также приводим примеры того, как этот анализ может быть использован для определения молекулярных механизмов, регулирующих процесс расслоения.
Protocol
Вкратце, на рисунке 1 обобщены общие шаги в анализе CAM-Delam. Приведенный ниже протокол основан на 30 культивируемых оплодотворенных куриных яйцах и использовании двух различных линий раковых клеток, посеянных отдельно в трех кольцах / яйцеклетке и проанализированных в четырех временных точках.
1. Инкубация яиц
- Используйте оплодотворенные яйца цыплят из местного инкубатория, которые гарантируют более 90% оплодотворения
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца не должны были храниться более 4 дней при комнатной температуре (RT). В Швеции этическое разрешение на экспериментальное использование эмбриональных цыплят требуется только с эмбрионального дня (E) 14 и далее. - При необходимости тщательно механически протрите грязь или перья на яйцах с помощью сухого бумажного полотенца или смочите в воде.
- Очистите и стерилизуйте инкубатор яиц 70% этанолом перед использованием (каждый раз).
- Поместите нужное количество яиц в лотки для яиц и высиживайте яйца цыплят горизонтально в инкубаторе для яиц при температуре 37,5-38 °C при влажности 70%. Рассмотрим это как инкубационный день 0 (рисунок 1А).
2. Подготовка весовой лодки, пластиковых коробок и инструментов для рассечения
- Используйте 70% этанола для стерилизации 30 весовых лодок и 30 небольших пластиковых коробок (~ 0,4 л) с прозрачными колпачками.
- Высушите весовые лодки и ящики в ламинарной вытяжке на ночь (ON) и храните в закрытой пластиковой коробке до дальнейшего использования в 3-й день инкубации.
- Стерилизуют 2 л дистиллированного или деионизированного H2Oна 30 инкубированных яиц.
- Стерилизуйте две пары ножниц и три пары щипцов, распыляя 70% этанола. Высушите инструменты на воздухе, а затем храните их в стерилизованной коробке до 3-го дня инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти действия (Шаги 2.1-2.4) могут быть выполнены за любой день до 3-го дня инкубации. Используйте перчатки, чтобы избежать загрязнения.
3. Вскрытие яиц и перенос во внутреннюю увлажненную камеру
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения.
- Добавьте приблизительно 50 мл стерилизованногоH2Oв стерилизованные пластиковые коробки. Храните заполненные водой коробки с закрытыми крышками, чтобы избежать загрязнения, на RT до использования.
- На 3-й день инкубации разбейте яичную скорлупу острой частью ножниц и вырежьте прямое отверстие в скорлупе.
- Вручную разбейте яичную скорлупу над весовой лодкой и соберите яичный белок, желток и прикрепленный к нему здоровый эмбрион в весовую лодку (рисунок 1B). Ищите неповрежденный эмбрион с бьющимся сердцем, неповрежденным желтком и развитыми кровеносными сосудами для эксперимента (>95% инкубированных яиц). Выбросьте яйца с деформированным эмбрионом, эмбрионом без бьющегося сердца, разбитым яичным желтком или поврежденными кровеносными сосудами желтка.
- Аккуратно перенесите весовую лодку во внутреннюю увлажненную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 3.2.-3.4 работайте как можно быстрее, чтобы избежать загрязнения, и, если возможно, используйте ламинарный капюшон. - Инкубируют внутреннюю увлажненную камеру в инкубаторе яиц (рисунок 1С).
- Культивируйте яйца без скорлупы с 3-го по 10-й день в инкубаторе для яиц перед использованием (см. Шаг 3.6.), а при необходимости добавляйте воду в инкубатор для поддержания влажности 70%.
- Проверяйте внутренние увлажненные камеры через прозрачную пластиковую крышку на наличие мертвых эмбрионов или загрязненных яиц без скорлупы каждый день и извлекайте их из инкубатора.
4. Подготовка силиконовых колец
- Для приготовления силиконовых колец вырежьте силиконовую трубку с внутренним и наружным диаметром 4 мм и 5 мм соответственно толщиной ~1 мм, предпочтительно с помощью бумагореза (рисунок 1D).
- Переложите силиконовые кольца на небольшие стеклянные бутылки (рисунок 1D), накройте металлической фольгой и стерилизуйте их с помощью автоклава или аналогичного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного автоклавирования неиспользуемых силиконовых колец, которые могут быть загрязнены, поскольку такая обработка снижает способность силиконовых колец прикрепляться к мембране с последующей утечкой раствора раковых клеток / коллагена / RPMI за пределы колец. - Храните стерильные силиконовые кольца в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен за любой день до 10-го дня инкубации.
5. Подготовка раковых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Такие растворы, как клеточная культуральная среда, трипсин и 1x PBS, хранятся при 4 °C и должны быть нагреты до 37 °C на водяной бане перед добавлением в клетки. После нагрева промойте флаконы в 70% этаноле и высушите перед использованием.
- Культивируйте интересующие линии раковых клеток в соответствующей культуральной среде в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C в присутствии 5% (v/v) CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь клетки рака предстательной железы U251-GFP и PC-3U-GFP культивировали в полной среде RPMI medium-RPMI с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (PS). - Спланируйте культуру раковых клеток таким образом, чтобы примерно 50 × 106 раковых клеток были готовы к сбору на 10-й день инкубации анализа CAM-Delam.
- Меняйте среду культивирования клеток каждые 2-3 дня или когда цвет среды меняется с розового на оранжевый/желтый.
- Необязательно: Индуцировать гипоксию путем лечения раковых клеток CoCl2 для исследования молекулярно-механистического воздействия на расслоение за 1 день до сбора клеток.
ВНИМАНИЕ: CoCl2 обладает умеренной токсичностью. Осторожно обращайтесь с вытяжным кожухом и следуйте инструкциям производителя.- Приготовить свежий 20 мМ CoCl2 стоковый раствор, растворив 0,0258 г в 10 мл стерилизованного дистиллированногоH20 в конической трубке объемом 15 мл, обернутой алюминиевой фольгой для защиты от света.
- В конической пробирке объемом 50 мл смешайте 250 мкл 20 мМ раствора CoCl2 в 25 мл среды RPMI, дополненной 1% (v/v) PS (но без FBS) на чашку для культивирования клеток диаметром 15 см. Вихрь осторожно.
- Удалите полную среду RPMI из посуды для клеточных культур.
- Промойте ячейки стерилизованным 1x PBS 2x.
- Добавьте 25 мл среды RPMI с трипсинизацией клетокCoCl2 200 мкМ (см. Шаг 5.6).
- На 10-й день инкубации яиц приготовьте 1 мл смеси коллаген/RPMI (соотношение 1:3), содержащей 250 мкл коллагена I типа (5 мг/мл) и 750 мкл клеточной культуры RPMI среды, дополненной 10% FBS и 1% (v/v) PS. Держите коллаген/RPMI-смесь на льду.
- Трипсинизировать раковые клетки, чтобы изолировать клетки, сначала удалив питательную среду клеток и промыв 2x с 1x PBS.
- Добавьте 3 мл раствора трипсина (0,05%) на чашку для культивирования клеток диаметром 15 см и инкубируйте в течение 2-3 мин в инкубаторе клеточной культуры до тех пор, пока клетки не отсоединятся. Используйте настольный инвертированный микроскоп, чтобы увидеть отсоединенные клетки. При необходимости осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы выбить оставшиеся сгруппированные или прикрепленные клетки.
- Инактивировать трипсин, добавляя 5 мл полной среды RPMI в каждую чашку для клеточной культуры и собирая клеточную суспензию из всех тарелок для клеточных культур в пробирку объемом 50 мл.
- Подсчитывайте раковые клетки методом исключения Trypan Blue, чтобы отличить живые клетки от мертвых, используя счетчик клеток. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии к 10 мкл 0,4% трипан синего пятна. Перемешайте образец путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, а затем загрузите 10 мкл клеточной смеси на камеру в слайд образца в счетчике ячеек. Повторите подсчет ячеек 3x, чтобы проверить номер ячейки/мл.
- Рассчитайте и центрифугируйте правильную объемную суспензию клеточной культуры, содержащую 50 х 106 живых раковых клеток в пробирке объемом 50 мл при 500 × г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и смешайте клеточную гранулу с 1 мл смеси коллаген/RPMI. Поскольку коллаген является желатиновым материалом, смешайте клетки очень медленно и осторожно с пипеткой 1 мл, чтобы избежать потери клеток при образовании пузырьков.
- Держите подготовленную клеточную суспензию на льду и поднесите ее в рабочую зону яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком долгого хранения подготовленных раковых клеток на льду. Подготовленные раковые клетки необходимо поместить на КАМ в течение 15-25 мин.
6. Посев раковых клеток на CAM
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения.
- На 10-й день инкубации выньте из инкубатора внутренние увлажненные камеры с инкубированными яйцами без скорлупы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 90% от первоначального числа инкубированных яиц может быть использовано; см. рисунок 2. - Откройте внутреннюю увлажненную камеру и поместите до шести силиконовых колец на CAM с помощью стерилизованных щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения силиконовых колец рядом друг с другом или близко к более крупным кровеносным сосудам. - Смешайте суспензию раковых клеток путем пипетирования, чтобы получить равномерное распределение раковых клеток, и добавьте 20 мкл (1 × 106 клеток) подготовленной суспензии раковых клеток внутри силиконового кольца (рисунок 1E). При добавлении ячеек держите наконечник пипетки над CAM, чтобы убедиться, что вы не повредили мембрану.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущим выводам7, различные раковые клетки могут быть посеяны в отдельные кольца на одном и том же CAM. - Закройте внутреннюю увлажненную камеру и поместите ее в инкубатор для яиц.
7. Выделение CAM с ассоциированными раковыми клетками
- Через 14 ч, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня инкубации вынимают примерно семь внутренних увлажненных камер и открывают крышки по одной.
- С помощью ножниц рассекните культивируемые раковые клетки, прикрепленные к CAM (так называемые образцы CAM-Delam), разрезав за пределы силиконового кольца (рисунок 1F).
- Немедленно перенесите изолированный образец CAM-Delam с помощью щипцов на 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ) в чашку Петри для фиксации ткани. Хранить на льду или при температуре 4 °C в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить 4% раствор PFA при 4 °C в течение максимум 5 дней. ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. При работе с порошком PFA и растворами PFA используйте вытяжной капюшон и носите маску для лица и перчатки. Избегайте вдыхания порошка или паров раствора. Следуйте инструкциям производителя. - Обезглавить куриные эмбрионы и выбросить как биологические отходы в определенные контейнеры.
- Удалите 4% раствор PFA и добавьте 30% сахарозы в 0,1 М ПБ в образцы CAM-Delam и уравновесьте при 4 °C в течение 1 ч.
- Под рассеченным микроскопом аккуратно снимите силиконовое кольцо с помощью щипцов. Ножницами вырежьте образец CAM-Delam в прямоугольной форме с раковыми клетками посередине (рисунок 1G).
- С помощью пары щипцов перенесите образцы CAM-Delam в замороженную среду в чашке Петри, чтобы удалить избыток сахарозы, а затем вставить формы в замороженную среду.
- Под рассеченным микроскопом расположите образец CAM-Delam в U-образной форме в вертикальном направлении во встраиваемых формах с помощью любого игольчатого инструмента (рисунок 1G).
- Заморозьте и храните образцы CAM-Delam при температуре −80 °C.
8. Секционирование образцов CAM-Delam
- Секционирование замороженных образцов CAM-Delam на 10 мкм на 5-6 последовательных слайдах с помощью криосекции.
- Храните слайды с разрезами при температуре −80 °C или используйте непосредственно для иммуногистохимического окрашивания.
9. Иммуногистохимическое окрашивание
- Доведите слайды от −80 °C до RT в течение 5 мин перед началом иммунопротокола.
- Сделайте линию гидрофобным маркером на слайдах, где заканчиваются участки. Дайте им высохнуть в течение нескольких минут.
- Поместите слайды в увлажненную (H2O) камеру и накройте участки ~200-500 мкл блокирующего раствора (10% сыворотки для телят плода и 0,1% азида натрия в трис-буферном физиологическом растворе с 0,1% Triton X-100 [TBST]) и инкубируйте в течение 15-30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, не позволяйте слайдам высохнуть в любое время. - Слейте блокирующий раствор и замените его 100-150 мкл интересующего первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, и инкубируют ON при 4 °C. Предпочтительно использовать антитело против ламинина-111 кролика для определения базальной пластинки вместе с маркером раковых клеток, если не используют GFP или другие флуоресцентно-помеченные линии раковых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь кролик анти-фон Виллебранд Фактор также использовался для обнаружения кровеносных сосудов в CAM. - Приготовьте три стеклянные кюветы, наполненные буфером TBST.
- Вылейте раствор первичного антитела, перенесите слайды в стеклянные кюветы и промыть не менее 3x в течение 5 мин каждый в TBST.
- Удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области с помощью мягкой бумажной салфетки.
- Накройте слайд 100-150 мкл подходящего вторичного флуоресцентного антитела, разведенного в блокирующем растворе в сочетании с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом, дигидрохлоридом (DAPI) и инкубатом в темноте при RT в течение 1 ч.
- Вылейте раствор вторичных антител, перенесите слайды в стеклянные кюветы и промыть не менее 3x в течение 5 минут каждый в TBST.
- Удалите излишки TBST с слайда и из гидрофобной барьерной области с помощью мягкой бумажной салфетки.
- Установите слайды, положив 1-2 капли флуоресцентной монтажной среды на слайд, и аккуратно поместите стеклянную крышку, избегая пузырьков воздуха.
- Дайте слайдам высохнуть в течение не менее 1 ч при 4 °C перед анализом и храните слайды при температуре 4 °C.
10. Микроскопическая визуализация и оценка расслоения
- Сфотографируйте участки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, предпочтительно с 10-кратным увеличением (рисунок 1H).
- Проанализируйте разделы, используя следующие категории оценки CAM-Delam (рисунок 3):
- Ищите неповрежденную базальную пластинку без видимых изменений.
- Ищите измененную, но неповрежденную базальную пластинку.
- Ищите поврежденную базальную пластинку без клеточной инвазии.
- Ищите поврежденную базальную пластинку с клеточной инвазией.
Representative Results
На рисунке 1 представлены ключевые этапы анализа CAM-Delam7. Использование внутренних увлажненных камер (Рисунок 1С) значительно улучшало выживаемость эмбрионов цыплят от <50% до 90% на 10-м инкубационном дне и от ~15% до 80% на 13-м инкубационном дне (Рисунок 2).
Рисунок 1: Ключевые этапы анализа CAM-Delam. (A) Инкубировать оплодотворенные куриные яйца горизонтально без ротации. (В,С) На 3-й день инкубации разбейте яйца и поместите их в стерильные весовые лодки (B), а лодки поместите во внутреннюю увлажненную камеру для дальнейшей инкубации (C). (D) Подготовьте силиконовые кольца. (E) На 10-й день инкубации поместите силиконовые кольца на CAM и посейте 1 x 106 раковых клеток внутри колец с помощью пипетки. (Ф,Г) В разные моменты времени (от часов до нескольких дней) рассекайте CAM с прикрепленными раковыми клетками, (F) фиксируйте в PFA, обрабатывайте сахарозой, позиционируйте в замороженной среде сечения (G) и замораживайте при -80 ° C. (H) Пример секционированного CAM с ассоциированными раковыми клетками GFP + (зеленый) и окрашиванием иммуногистохимии ламинина (красный). Шкала стержней = 2 мм (E,F), 1 мм (G) и 100 мкм (H). Эта цифра взята из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; PFA = параформальдегид; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выживаемость куриного эмбриона по отношению к методу инкубации. (A,B) На 10-й день инкубации выживаемость куриного эмбриона во внутренних ГК удвоилась (среднее значение 89,33; N = 105) по сравнению с инкубацией в чашках Петри (А; среднее значение 40; N = 64) и неувлажненные камеры (B; среднее значение 48,67; N = 46). (С,Г) На 13-й день инкубации по-прежнему наблюдалась высокая выживаемость при использовании HC (среднее значение 81,67; N = 105), тогда как значительное снижение выживаемости эмбрионов было отмечено с помощью БП (C; среднее значение 11,33; N = 64) и N-HC (D; среднее значение 18,33; N = 46). Статистическая значимость проверялась с помощью непарного двуххвостого т-теста. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: HC = увлажненная камера; PD = чашки Петри; N-HC = неувлажненная камера; E X = Инкубационный день X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализы различных линий раковых клеток, экспрессирующих GFP (U251 глиобластома, простата PC-3U, толстая кишка SW620 и легкие A549), с использованием этого протокола были ранее сообщены Palaniappan et al.7. Результаты анализа CAM-Delam включают различия в морфологии базальной пластинки, обнаруженной ламинином, и инвазию раковых клеток, определяемую как клетки, которые пересекли слой базальной пластинки цыпленка в мезодермальный слой цыпленка (рисунок 3). Эти результаты показывают, что способность раковых клеток к деградации базальной пластинки и вторжению в мезенхиму может быть оценена в одну из четырех категорий: 1) интактная базальная пластинка без видимых изменений (рисунок 3B), 2) измененная, но неповрежденная базальная пластина (рисунок 3C), 3) поврежденная базальная пластина без клеточной инвазии (рисунок 3D) и 4) поврежденная базальная пластинка с клеточной инвазией (рисунок 3E). ). Другое наблюдение заключалось в том, что, когда раковые клетки вызывали измененную или поврежденную базальную пластинку, CAM также утолщался с увеличением образования кровеносных сосудов, определяемым окрашиванием антител против фактора фон Виллебранда, который синтезируется в кровеносных сосудах8 (рисунок 4C-H). Эти два фенотипа, утолщенный CAM и повышенное образование кровеносных сосудов, не наблюдались, когда CAM был неповрежден (рисунок 4A, B).
Рисунок 3: Оценка CAM-Delam. (A-E) Пример оценки CAM-Delam, основанный на целостности базальной пластинки CAM, визуализированной антиламинином (красный), и потенциальной инвазии GFP-экспрессирующих раковых клеток (зеленый). (A) Контроль CAM без раковых клеток. (Б-Е) В ответах на раковые клетки можно оценить четыре категории, описывающие морфологию базальной пластинки: (B) интактный ламинин, (C) измененный, но неповрежденный ламинин (обозначенный звездочкой), (D) поврежденный ламинин, но без инвазии раковых клеток (стрелки), поврежденный ламинин с клеточной инвазией (наконечники стрел). Шкала стержня = 100 мкм (A-E). Эта цифра взята из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка утолщения CAM и образования кровеносных сосудов. (А-Н) Пример визуализации утолщения CAM и образования кровеносных сосудов, обнаруженных анти-фактором Виллебранда (красный), в ответ на пластинку различных типов раковых клеток. (А,Б) Контроль CAM без раковых клеток. (С,Г) В ответ на неметастатическую линию раковых клеток (оцененную как Intact) не было обнаружено явного утолщения мезенхимы или увеличения образования кровеносных сосудов. (Э-Н) В ответ на метастатические раковые клетки, приводящие к изменению или повреждению ламинина, мезенхима утолщалась (об этом указывали двойные наконечники стрел) и наблюдалось увеличение образования кровеносных сосудов (обозначено стрелками). Шкала шкалы = 100 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Клетки рака предстательной железы U251 и PC-3U являются двумя примерами линий раковых клеток с совершенно разными расслоенными способностями (рисунок 5). Клетки PC-3U индуцировали поврежденный ламинин через 1,5 дня, с явной инвазией через 2,5 дня (рисунок 5A). Напротив, клетки U251 индуцировали незначительные изменения ламинина только через 1,5-3,5 дня, но никогда не вызывали видимого повреждения ламинина (рисунок 5B).
Рисунок 5: Визуализация расслояющей способности раковых клеток предстательной железы (PC-3U) и глиобластомы (U251). (A) клетки PC-3U индуцировали незначительное изменение ламинина через 14 ч, повреждение ламинина через 1,5 дня (стрелка) и начало инвазии через 2,5 дня, которая была увеличена через 3,5 дня (наконечники стрел). (B) Клетки U251 вызывали незначительное изменение ламинина через 1,5-3,5 дня. На правых панелях показаны графики, представляющие оценку CAM-Delam. Ось Y указывает количество выборок, а ось X указывает временные точки культуры. Шкала = 100 мкм (A,B). Эта цифра была изменена по сравнению с Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализ CAM-Delam может быть использован для определения молекулярных механизмов, которые регулируют процесс расслоения. Одним из примеров является использование лечения CoCl2 для индуцирования гипоксии с или без комбинации ингибирующих матриксных металлопротеиназ (MMP) с использованием широкого ингибитора MMP GM6001 (рисунок 6). После лечения CoCl2 неметастатические раковые клетки U251 приобрели способность индуцировать расслоение и инвазивные клетки, которая подавлялась, когда лечение CoCl2 сочетали с ингибитором MMP GM6001 (рисунок 6). Таким образом, анализ CAM-Delam может быть полезен при определении молекул и молекулярных путей, которые влияют на процесс расслоения.
Рисунок 6: Паттерны расслоения в ответ на клетки U251, подвергшиеся воздействию CoCl2 отдельно или вместе с ингибитором MMP. (А-С) Клетки U251 культивируют в течение 3,5 дней на CAM в различных условиях. (А) Клетки U251, культивируемые в одиночку, не вызывали никакого повреждения ламинина. (B) Культивируемые клетки U251, предварительно подвергшиеся воздействию CoCl2 (24 ч) перед промывкой и посевом клеток на CAM-индуцированное повреждение ламинина и клеточную инвазию. (C) Предварительная обработка ингибитором MMP широкого спектра действия GM6001 (в течение 1 ч) с последующим воздействиемCoCl2 (24 ч) перед промывкой и посевом клеток U251 на CAM подавляла эффект леченияCoCl2, и не было обнаружено явного повреждения ламинина или инвазии раковых клеток. Шкала шкалы = 100 мкм (A-C). Панели (B) и (C) взяты из Palaniappan et al.7. Сокращения: CAM = хориоаллантоическая мембрана; GFP = зеленый флуоресцентный белок; CoCl2 = хлорид кобальта; MMP = матричная металлопротеиназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
В этой статье описывается анализ CAM-Delam для оценки метастатической агрессивности раковых клеток, определяемой путем оценки базальных ламинных модуляций и потенциальной инвазии клеток в мезенхиму в течение периода от нескольких часов до нескольких дней. Предыдущей технической проблемой для различных анализов CAM была низкая выживаемость эмбрионов цыплят. Этот вопрос был решен путем введения использования внутренней увлажненной камеры во время инкубации эмбриона, что увеличило выживаемость эмбриона с 10%-50% до 80%-90%7. Поэтому использование внутренней увлажненной камеры может быть полезным в CAM-анализах в целом, а также в других экспериментах ex ovo chick.
Представленные точки времени подсчета очков через 14 ч, 1,5 дня, 2,5 дня и 3,5 дня после посева 1 х 106 раковых клеток на КАМ основаны на строгой разработке метода с использованием шести различных линий раковых клеток и достаточны для того, чтобы отличить диапазон от нерасширяющихся до расслоивающихся с инвазией способностей раковых клеточных линий. Предлагается минимальное использование четырех яиц с тремя кольцами в каждой точке времени и на клеточную линию, и это должно быть повторено по крайней мере один раз или в соответствии с экспериментальными проектами и статистическими требованиями. Одним из преимуществ анализа CAM-Delam является получение информативных результатов относительно расслояющей способности раковых клеток в течение нескольких дней для оценки агрессивности раковых клеток и потенциального риска образования метастазов. Быстрой доставке результатов способствует мониторинг деградации базальной пластинки из-за вторжения раковых клеток и последующих микроопухол /опухолевых почек и метастазов в органы. Традиционно модели CAM использовались для анализа образования метастазов в органах, что занимает около 2 недель, чтобы определить9. Используя семь различных линий раковых клеток, мы ранее подтвердили7, что оценка расслоения связана со способностью раковых клеток образовывать метастазы в моделях грызунов 10,11,12,13,14, что подтверждает прогностическую ценность анализа CAM-Delam. Более того, мышиные модели требуют еще более длительного времени, от нескольких недель до месяцев, прежде чем метастазы могут быть исследованы15,16. Короче говоря, этот разработанный анализ CAM-Delam, ориентированный на оценку способности к расслоению, а не на изучение более позднего образования опухоли у эмбриона цыпленка, является, таким образом, хорошим дополнением к существующим моделям кумовской кам-инвазии и опухоли мыши.
Ограничением в анализе CAM-Delam может быть неясная визуализация базальной пластинки, если сами раковые клетки экспрессируют ламинин. Если это так, то можно использовать другие маркеры, указывающие на базальную пластинку, такие как E-кадгерин7. Другие исследования инвазии CAM использовали коллаген IV типа для визуализации CAM и пан-цитокератина и виментина для идентификации вторгающихся раковых клеток и образования микроопухол / опухолевых почек17,18.
Расслоение является нормальным клеточным процессом, как во время развития, так и в более позднем возрасте, что позволяет клеткам покидать эпителий и мигрировать в другие ткани. Примерами расслоения клеток во время развития являются нервный гребень и обонятельные новаторские нейроны19,20; в более позднем возрасте заживление ран зависит от расслоения21. Во время рака этот процесс регулируется в неправильных клетках и / или в неправильное время. Таким образом, метод CAM-Delam может быть полезен для разгадки молекулярных механизмов, регулирующих расслоение, что будет иметь важное значение как для базовых биологических знаний, так и для знаний о болезнях. Такие исследования расслоения будут включать добавление факторов, представляющих интерес для раковых клеток, посеянных на CAM, или изучение генетически модифицированных раковых клеток. Одним из примеров, представленных здесь, является предварительная обработкаCoCl2 неметастатической клеточной линии U251 для индуцирования гипоксии, что приводит к индукции метастатической агрессивной способности, которая может быть подавлена ингибитором MMP широкого спектра действия. Таким образом, нахождение ключевых молекул, контролирующих расслоение, увеличивает возможность разработки ингибиторов для подавления этого процесса. В связи с этим еще одно потенциальное применение протокола CAM-Delam заключается в скрининге лекарств для подавления расслоения и клеточной инвазии. Кроме того, в клинике оценка тяжести рака является критически важным компонентом для диагностики, планирования лечения и ухода. В настоящее время действует система стадий TNM (Т, размер опухоли; N, узел – распространился ли рак на лимфатические узлы; M, отдаленные метастазы) используется для оценки тяжести рака22. Анализ CAM-Delam определяет инновационный подход к оценке агрессивности раковых клеток и потенциального риска образования метастазов и может быть полезным дополнением к системе стадии TNM. Примечательно, что стадия TNM основана на анализе образцов фиксированных тканей, тогда как потенциальный клинический подход CAM-Delam будет исследовать свежую или свежезамороженную ткань в сочетании с методами восстановления замороженных клеток23.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим следующих исследователей из Университета Умео за их помощь с соответствующими линиями раковых клеток и антителами: Л. Карлссон (антитело к фактору фон Виллебранда), Й. Гилторп (U251) и М. Ландстрём (PC-3U). Мы также благодарим Хауке Холтузена в лаборатории Гилторпа за создание стабильной клеточной линии HEK293-TLR-AAVS1. Работа в лаборатории Gunhaga была поддержана Шведским онкологическим фондом (18 0463), биотехнологическим инкубатором Умео, Norrlands Cancerforskningsfond, Шведским исследовательским советом (2017-01430) и медицинским факультетом Университета Умео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
