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Artigo de método
Este protocolo descreve o enriquecimento de vesículas extracelulares derivadas de astrócitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Baseia-se na separação de EVs por precipitação de polímeros, seguida de imunocaptura de ADEVs baseada em ACSA-1. A análise de ADEVs pode oferecer pistas para estudar alterações nas vias inflamatórias de pacientes vivos, de forma não invasiva por biópsia líquida.
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas biológicas secretadas por todas as células para comunicação celular e eliminação de resíduos. Eles participam de uma vasta gama de funções, agindo e transferindo suas cargas para outras células em condições fisiológicas e patológicas. Dada a sua presença em biofluidos, os EVs representam um excelente recurso para o estudo de processos patológicos e podem ser considerados uma biópsia líquida para a descoberta de biomarcadores. Um aspecto atraente da análise de EV é que eles podem ser selecionados com base em marcadores de sua célula de origem, refletindo assim o ambiente de um tecido específico em sua carga. No entanto, uma das principais desvantagens relacionadas aos métodos de isolamento de VE é a falta de consensos metodológicos e protocolos padronizados. Os astrócitos são células gliais com papéis essenciais no cérebro. Em doenças neurodegenerativas, a reatividade dos astrócitos pode levar a uma carga EV alterada e comunicação celular aberrante, facilitando/aumentando a progressão da doença. Assim, a análise de EVs de astrócitos pode levar à descoberta de biomarcadores e potenciais alvos de doenças. Este protocolo descreve um método de 2 etapas de enriquecimento de EVs derivados de astrócitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Primeiro, os EVs são enriquecidos a partir de plasma desfibrinado por meio de precipitação à base de polímeros. Isso é seguido pelo enriquecimento de ADEVs por meio de imunocaptura baseada em ACSA-1 com microesferas magnéticas, onde EVs ressuspensos são carregados em uma coluna colocada em um campo magnético. Os EVs ACSA-1+ marcados magneticamente são retidos dentro da coluna, enquanto outros EVs fluem. Uma vez que a coluna é removida do ímã, os ADEVs são eluídos e estão prontos para armazenamento e análise. Para validar o enriquecimento de marcadores de astrócitos, a proteína glial fibrilar ácida (GFAP), ou outros marcadores astrocíticos específicos de origem intracelular, podem ser medidos no eluato e comparados com o fluxo. Este protocolo propõe um método fácil e eficiente em termos de tempo para enriquecer ADEVs a partir de plasma que pode ser usado como uma plataforma para examinar marcadores relevantes para astrócitos.
As vesículas extracelulares (VEs) são um grupo heterogêneo de nanopartículas membranosas secretadas por todos os tipos de células, carregando proteínas, lipídios e ácidos nucléicos1. Microvesículas (100-1000 nm), exossomos (30-100 nm) e corpos apoptóticos (1000-5000 nm) constituem os principais tipos de EV, distinguidos por seu local de origem 2,3. As EVs regulam processos fisiológicos importantes, como apresentação de antígenos e respostas imunes4, reciclagem de receptores, eliminação de metabólitos5 e co....
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A pesquisa descrita neste protocolo foi realizada com amostras de plasma humano de doadores adultos saudáveis de ambos os sexos (faixa etária de 65,9 a 81,3 anos, 45,5% do sexo feminino), da coorte Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN), Barcelona, Espanha36. Os participantes deram consentimento informado. O estudo foi realizado seguindo as diretrizes éticas internacionais para pesquisa médica contidas na declaração de Helsinque e na lei espanhola. O Comitê de Ética em Pesquisa de Sant Pau (CEIC) revisou e aprovou o protocolo para coleta e armazenamento de amostras de plasma humano da coorte SPIN (#16/2013).
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O isolamento de ADEVs do plasma coletado de doadores saudáveis foi realizado com sucesso. Um método de precipitação à base de polímero foi empregado para obter a fração EV total, seguido de uma imunocaptura com microesferas magnéticas para obter ADEVs.
A análise de Western blot da fração EV total antes da etapa de imunocaptura indicou a falta de calnexina (marcador de contaminação celular) e a presença de Alix e da proteína transmembrana CD9 nas preparações de EV (Figura 2.......
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Os EVs ganharam forte interesse na pesquisa biomédica devido ao seu potencial diagnóstico e terapêutico. Atualmente, uma das principais desvantagens relacionadas aos métodos de isolamento de VE é a falta de consenso metodológico e protocolos padronizados. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o enriquecimento de EVs de astrócitos a partir de plasma humano por meio de precipitação à base de polímero e imunocaptura de GLAST.
Existem diferentes.......
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O Dr. Belbin relatou ter recebido honorários pessoais da ADx NeuroSciences fora do trabalho enviado. O Dr. Alcolea relatou ter recebido honorários pessoais por serviços de conselho consultivo e/ou honorários de palestrante da Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. e Esteve fora do trabalho submetido. O Dr. Lleó atuou como consultor ou em conselhos consultivos da Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols e Nutricia fora do trabalho submetido. O Dr. Fortea relatou ter recebido honorários pessoais por serviços nos conselhos consultivos, comitês de adjudicação ou honorários de palestrantes da AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio e Biogen fora do trabalho enviado. Os Drs. Alcolea, Belbin, LLeó e Fortea relatam possuir uma patente para marcadores de sinaptopatia em doenças neurodegenerativas (licenciada para ADx, EPI8382175.0). Nenhuma outra divulgação foi relatada. Todos os outros autores não têm mais nada a divulgar.
Os autores gostariam de agradecer a ajuda de Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi e Oriol Sanchez Lopez para o manuseio e preparação das amostras. Agradecemos também a colaboração de José Amable Bernabé, do ICTS "NANBIOSIS", unidade 6 (Unidade de CIBER em Bioingineering, Biomateriais e Nanomedicina) do Instituto de Ciência dos Materiais de Barcelona, Marti de Cabo Jaume da Unidade de Microscopia Eletrônica da Universitat Autonoma de Barcelona, Dra. Marta Soler Castany e Lia Ros Blanco da Plataforma de Citometria de Fluxo do Instituto de Pesquisa Biomédica de Sant Pau (IIB-Sant Pau), bem como ao Dr. Joan Carles Escolà-Gil, do....
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo primário anti-Alix para EMD Western blotting | Millipore | ABC40 | |
| µ Separador MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | O µ O separador MACS é usado em combinação com µ Colunas e MicroBeads MACS. |
| Anticorpo primário anti-calnexina para Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
| Anticorpo primário anti-CD9 para Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
| Bloqueador BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
| Bransonic 1510E-MT Banho ultrassônico | Branson | ||
| COBAS 6000 autoanalisador | Roche Diagnostics | Analisador para determinação imunoturbidimétrica de ApoB; coquetel de | |
| inibidor de protease cOmplete (livre de EDTA) | Micrografia | 11873580001 | |
| 1.8 | software de micrografia | ||
| Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ livre 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
| EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
| Exoquick (solução de precipitação de exossomo 5 mL) + Trombina | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL também pode ser comprado (EXOQ20A-1) |
| Gatan 895 USC 4000 | câmera | ||
| GeneGnome XRQ sistema de imagem de quimioluminescência | Syngene | ||
| Antígeno CD81 humano (CD81) Kit ELISA | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
| Morte celular programada humana 6-proteína interativa (PDCD6IP) Kit ELISA | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
| Membrana Immun-Blot PVDF | BioRad | 1620177 | |
| Microscópio eletrônico de transmissão JEOL 2011 | JEOL LTD | Equipado com uma câmera CCD Gatan 895 USC 4000 (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, EUA) | |
| Tubos EDTA BD Vacutainer K2E Lavanda | Becton dickinson | 367525 | |
| Leica EM GP | Congelador de imersão comercial | Leica Microsystem | |
| Microtubos de baixa ligação 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
| MACS µ Colunas com êmbolos | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ As colunas com êmbolos são especialmente projetadas para isolamento de exossomos de fluidos corporais |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Leitor de placas MAGPIX | Luminex Corporation | 80-073 | Unidade de multiplexação xMAP da Luminex (software Luminex xPonent v 4.3) |
| MicroBead Kit100 μ L Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotina, humano, camundongo, rato – tamanho pequeno; 100 μ L Anti-Biotina MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
| MILLIPLEX MAP Kit Citocina humana/Quimiocina/Fator de Crescimento Painel Um painel de esferas magnéticas | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
| M-PER Reagente de Extração de Proteína de Mamíferos 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | Para certas aplicações como Western blot, tampões de lise mais agressivos podem ser usados (por exemplo, RIPA) |
| Espectrofotômetro de Microplacas MultiSkan SkyHigh | Thermofisher | A51119500C | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; versão 3.4 | |
| Inibidor de Protease e Fosfatase Pierce Halt Coquetel | Thermo Fisher | 78441 | |
| Seringa de polipropileno (G29) | Seringa PeroxFarma | 1mL; 0,33x12mm-G29x1/2" | |
| Secundário anti-coelho anticorpo | Thermo Fisher | 10794347 | |
| Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
| Simoa, instrumento SR-X | Quanterix | SR-X Sistema de Detecção de Biomarcadores Ultrassensíveis; tecnologia comercial de detecção de biomarcadores | |
| Teste de Proteína Específica Apolipoproteína B - APOB (100 graus) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
| SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Substrato HRP de quimioluminescência aprimorada ultra-sensível (ECL) |
| Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot | BioRad | 1704150 |
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