Summary
Dit artikel beschrijft de methodologie voor het radioactief labelen van een mensspecifiek anti-CD19 monoklonaal antilichaam en hoe het kan worden gebruikt om B-cellen in het centrale zenuwstelsel en perifere weefsels van een muismodel van multiple sclerose te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografiebenaderingen.
Abstract
Multiple sclerose (MS) is de meest voorkomende demyeliniserende ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die jonge volwassenen treft, wat vaak resulteert in neurologische stoornissen en invaliditeit naarmate de ziekte vordert. B-lymfocyten spelen een complexe en cruciale rol in de pathologie van MS en zijn het doelwit van verschillende therapieën in klinische onderzoeken. Momenteel is er geen manier om patiënten nauwkeurig te selecteren voor specifieke anti-B-celtherapieën of om de effecten van deze behandelingen op de B-celbelasting in het CZS en perifere organen niet-invasief te kwantificeren. Positronemissietomografie (PET)-beeldvorming heeft een enorm potentieel om zeer specifieke, kwantitatieve informatie te verschaffen over de in vivo spatiotemporele verdeling en belasting van B-cellen bij levende proefpersonen.
Dit artikel rapporteert methoden voor het synthetiseren en gebruiken van een PET-tracer die specifiek is voor menselijke CD19+ B-cellen in een gerenommeerd B-celgestuurd muismodel van MS, experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE), dat wordt geïnduceerd met humaan recombinant myeline-oligodendrocytglycoproteïne 1-125. Hier worden geoptimaliseerde technieken beschreven om CD19+ B-cellen in de hersenen en het ruggenmerg te detecteren en te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming. Daarnaast rapporteert dit artikel gestroomlijnde methoden voor ex vivo gammatelling van ziekterelevante organen, waaronder beenmerg, ruggenmerg en milt, samen met autoradiografie met hoge resolutie van CD19-tracerbinding in CZS-weefsels.
Introduction
MS is een immuungemedieerde neurologische aandoening; De unieke presentatie bij elke patiënt kan de behandeling uitdagend maken voor zowel patiënten als clinici. De ziekte zelf wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van demyeliniserende laesies en infiltratie van immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg, wat resulteert in fysieke en cognitievestoornissen. Het traditionele paradigma dat MS een T-cel-gemedieerde ziekte is, werd voor het eerst uitgedaagd in een baanbrekende fase II klinische studie van rituximab3, een therapie gericht op de CD20+ subset van B-cellen. Sindsdien zijn er aanvullende B-celtherapieën ontwikkeld die zich richten op CD194, een pan-B-celbiomarker die tot expressie wordt gebracht op een breder scala aan B-cellen, wat zowel diagnostisch als therapeutisch voordelig kan zijn. Bovendien bieden bestaande methoden om de werkzaamheid van de behandeling te beoordelen (d.w.z. het monitoren van het aantal recidieven en magnetische resonantiebeeldvorming [MRI]-activiteit) geen vroege metingen van respons, waardoor patiënten een aanzienlijk risico lopen op schade aan het CZS als gevolg van suboptimale therapieselectie en -optimalisatie. Daarom is er een kritieke behoefte aan strategieën om specifieke immuuncellen, zoals CD19+ B-cellen, in realtime te monitoren in het CZS en de periferie van MS-patiënten.
PET-beeldvorming is een robuuste beeldvormingstechniek die in vivo visualisatie van het hele lichaam mogelijk maakt van een bepaald doelwit dat van belang is, zoals CD19. Terwijl bloedafnames, registraties van terugvalpercentages en laesiemonitoring via MRI momentopnamen opleveren van de werkzaamheid van de behandeling, kan PET-beeldvorming onderzoekers en clinici in staat stellen de effectiviteit van een therapie over het hele lichaam te controleren. Deze proactieve benadering van therapeutische monitoring stelt clinici in staat om de effectiviteit van medicatie in realtime te beoordelen, waardoor snelle aanpassingen mogelijk zijn als dat nodig is. Het monitoren van de locatie en dichtheid van celpopulaties die geassocieerd zijn met ziekte maakt het ook mogelijk om de ernst van de ziekte longitudinaal te beoordelen met behulp van patiëntspecifieke anatomische informatie. Het is dus essentieel om reproduceerbare analysemethoden vast te stellen om op betrouwbare wijze het volledige potentieel van PET-beeldvorming in klinische en preklinische omgevingen te benutten.
Dit artikel beschrijft methoden (Figuur 1) voor het uitvoeren van PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografie (ARG) van CD19+ B-cellen met een 64 Cu-gelabeld anti-humaan CD19 monoklonaal antilichaam (mAb), bekend als 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), in het experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) muismodel van MS geïnduceerd in transgene muizen die humaan CD19 (hCD19) tot expressie brengen met behulp van humaan recombinant myeline-oligodendrocytglycoproteïne 1-125 (MOG1-125). We bieden ook methoden om de binding van radiotracers nauwkeurig en reproduceerbaar te beoordelen in de hersenen en het ruggenmerg, beide kritieke plaatsen van pathogenese die vaak ernstig worden aangetast in dit en andere neurodegeneratieve modellen. Deze technieken maken niet-invasief onderzoek naar de rol van B-cellen in ziektepathologie mogelijk en hebben het potentieel om klinisch te worden vertaald om de werkzaamheid van anti-B-celtherapieën bij MS te beoordelen.
Protocol
Figuur 1: Onderzoeksopzet. Een overzicht van de belangrijkste technieken in dit artikel. (A) Door de muizen op hun rug in het scanbed te plaatsen, wordt de beweging in de wervelkolom verminderd. (B) PET/CT-beeldvorming van de muizen. (C) Maak een incisie langs de dorsale zijde van het dier om de wervelkolom bloot te leggen. (D) Snijd de wervelkolom in cervicale/thoracale en lumbale delen en verwijder de secties volgens de vijf aangegeven sneden. (E) Gebruik een injectiespuit om het ruggenmerg uit de wervelkolom te verwijderen door een afdichting te maken met de spuit en de wervelkolom en te spoelen vanaf de schedel- en staartuiteinden van de wervelkolom, zoals afgebeeld. (F) Geïsoleerde cervicale/thoracale en lumbale ruggenmergsegmenten. Afkorting: PET/CT = Positron emissie tomografie/computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met het Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) aan de Stanford University, een programma dat is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Muizen werden ten minste 7 dagen voorafgaand aan het begin van het onderzoek aan het vivarium gewend om stress bij de muizen tot een minimum te beperken, aangezien stress de EAE-inductie kan beïnvloeden.
1. EAE-inductie bij vrouwelijke gehumaniseerde CD19-muizen
- Induceer gehumaniseerde CD19 C57BL/6J vrouwelijke muizen van 9-13 weken oud met EAE zoals eerder beschreven5 met behulp van MOG1-125.
2. Dierverzorging en scoring in EAE-muismodel
- Scoor ziekteprogressie en zorg voor de muizen zoals eerder beschreven5. In het kort, scoor dit model op een schaal van 1-5 als volgt: 1 is staartzwakte/slapheid, 2 is verzwakte achterpoten, 3 is achterpootverlamming, 4 is achterpootverlamming met zwakte van de voorpoten, 5 is stervende.
3. mAb-conjugatie, radiolabeling en karakterisering
- Conjugeer de bifunctionele chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur mono-N-hydroxysuccinimide-ester (DOTA-NHS-ester) tot hCD19-mAb om radioactief te labelen met 64Cu.
- Vervang met behulp van een ontziltingskolom de hCD19-mAb-opslagbuffer door HEPES-buffer (pH 8,5-9): conditioneer de ontziltingskolom(men) met HEPES. Bereken het aantal benodigde kolommen op basis van de capaciteit van het monstervolume van de ontziltingskolom en het benodigde volume mAb: 0,5 ml buisjes: 30-130 μL monstervolume, 300 μL wasgoed; Buisjes van 2 ml: monstervolume van 200-700 μl, 1 ml wassen.
- Koel de centrifuge af tot 4 °C voor bufferuitwisseling via de ontziltingskolom.
- Haal de ontziltingskolom uit de koelkast. Verwijder de onderkant van de ontziltingskolom, draai de dop los en plaats de kolom in een opvangbuis.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.500 × g om de bewaaroplossing te verwijderen; Gooi de doorstroom met de bewaaroplossing weg en hergebruik de opvangbuis. Markeer een lijn op de kolom waar het hoogste punt van de ontziltende samengeperste hars schuin naar boven staat.
- Voeg HEPES-buffer toe aan de onderkant van de ontziltingskolom. Plaats de ontziltingskolom in de centrifuge met de lijn naar buiten gericht; Centrifugeer op 1.500 × g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg en hergebruik de opvangbuis.
- Herhaal stap 3.1.4 en 3.1.5 2x met dezelfde opvangbuis en gooi de doorstroming tussen de stappen weg.
- Plaats de geconditioneerde ontzoutkolom in een nieuwe opvangbuis en etiketteer; dit buisje bevat de hCD19-mAb.
- Voeg hCD19-mAb toe aan de bovenkant van de geconditioneerde ontziltingskolom(men) en gebruik HEPES-buffer om de lege mAb-injectieflacon te spoelen; Voeg dit toe aan de bovenkant van de ontzoutingskolom (totaal volume volgens de aanbeveling van de fabrikant). Centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.500 × g om de hCD19-mAb te elueren. Bewaar de doorstroom met de hCD19-mAb.
- Meet de concentratie hCD19-mAb met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer en pas indien nodig aan op 0,5 μg/μL met HEPES-buffer.
- Voeg aan de hCD19-mAb-oplossing 1/50evan het volume van de mAb-oplossing van 0,5 M EDTA toe om de uiteindelijke concentratie EDTA 0,01 M in de hCD19-mAb-oplossing te verkrijgen. Laat de hCD19-mAb-EDTA-oplossing 15 minuten op kamertemperatuur staan.
- Haal de DOTA-NHS-ester uit de vriezer en laat op kamertemperatuur komen (10-15 min). Bereken het volume DMSO dat aan de DOTA-NHS-ester moet worden toegevoegd om een DOTA-concentratie te maken die de toevoeging van de gewenste DOTA/mAb-molaire verhouding mogelijk maakt (die meestal in de orde van grootte van 1-2 DOTA/mAb ligt).
OPMERKING: Het volume DMSO-DOTA-NHS-ester toegevoegd aan hCD19-mAb mag niet groter zijn dan 10% van het mAb-volume. Dit moet worden gedaan met behulp van een spreadsheet, zodat het snel en herhaaldelijk kan worden gedaan. - Bereken op basis van de gewenste verhouding van DOTA tot hCD19-mAb de hoeveelheid DOTA-NHS-ester die aan hCD19-mAb moet worden toegevoegd.
nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/ml DOTA/DMSO → ml DMSO → verdunningsfactor van DOTA/DMSO-oplossing - Weeg 1-2 mg van de DOTA-NHS-ester af en voeg zorgvuldig het juiste volume (berekend in stap 3.1.11) DMSO toe aan de DOTA-NHS-ester; Mengen en draaien.
- Pipeteer het berekende volume van de DOTA-NHS-esteroplossing (stap 3.1.12) in de hCD19-mAb-oplossing; veeg de buitenkant van de pipetpunt af voordat u deze toevoegt om er zeker van te zijn dat er geen extra DOTA-NHS-ester wordt toegevoegd (zonder de hoeveelheid in de pipet te veranderen). Meng voorzichtig en draai naar beneden.
- Zet in de koelkast (4 °C) om een nacht te reageren (12-16 uur).
- Zuivering en concentratie
- Koel de centrifuge af tot 4 °C voor de bufferwisselstappen van de centrifugaalconcentrator; plaats een metalen PCR-buisblok op droogijs om het geconjugeerde snel in te vriezen.
- Haal de DOTA-hCD19-mAb-reactie uit de koelkast en blus door TRIS-buffer van biologische kwaliteit toe te voegen: 10% van het totale reactievolume. Verwijder 10-20 μg van het monster voor massaspectrometrie-analyse.
- Conditioneer de ontziltingskolom(men) zoals hierboven beschreven (stappen 3.1.1-3.1.5) met 0,1 M ammoniumacetaatbuffer, pH 5,5.
- Buffervervang de DOTA-hCD19-mAb-oplossing door ammoniumacetaat (stappen 3.1.1-3.1.8).
- Concentreer de DOTA-hCD19-mAb-oplossing: voeg de oplossing toe aan een centrifugaalconcentrator met een molecuulgewicht van 50 kDa volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor volume. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 10 minuten (of totdat het volume met 80%-90% is verminderd); Gooi de doorstroom weg.
- Herhaal dit nog negen keer (10 in totaal): voeg voldoende ammoniumacetaat toe om het volume terug te brengen naar het maximaal aanbevolen volume.
OPMERKING: Het totaal moet zijn wat aanvankelijk is toegevoegd, inclusief wat er nog over is in de kolom, meestal 400-450 μL voor een centrifugaalconcentrator met een capaciteit van 500 μL.- Spoel de reactieflacon met ammoniumacetaatbuffer om eventuele resterende DOTA-hCD19-mAb op te halen; Voeg het wasgoed toe aan de centrifugaalconcentrator.
- Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 10 min.
NOTITIE: De centrifugetijd kan bij volgende spins worden verkort als het volume in minder tijd wordt verlaagd tot 80%-90%.
- Verwijder de eiwitoplossing uit de centrifugale concentrator. Let op het totale volume van de DOTA-hCD19-mAb.
- Voeg in centrifugaalconcentrator 2 voldoende ammoniumacetaatbuffer toe voor een totaal volume van 100 μL en pipet om te mengen. Sluit de centrifugaalconcentratorkolom af en keer om. Draai gedurende 2 minuten op 4.000 × g om de oplossing op te vangen. Overbrengen naar een nieuwe buis.
- Gebruik in centrifugaalconcentrator 500 een pipet om de mAb-oplossing uit de centrifugaalconcentrator op te vangen; Voeg toe aan een nieuwe tube.
- Meet de concentratie met behulp van een UV-VIS spectrofotometer. Als de concentratie hoger is dan 2 mg/ml, verdunnen met ammoniumacetaat tot 2 mg/ml.
- Aliquot 100 μg per PCR-buis (ongeveer 50 μL); label de buisjes met DOTA-hCD19-mAb, datum, massa en concentratie. Draai de flesjes naar beneden.
- Vries de DOTA-hCD19-mAb snel in op het gekoelde PCR-blok op droogijs (of vries in op droogijs). Zodra alle monsters zijn ingevroren, plaatst u ze in een vriezer van -80 °C.
- Meet het aantal DOTA per hCD19-mAb met behulp van massaspectrometrie. Bewaar een monster van ongeconjugeerd (zuiver) antilichaam van elke conjugatie om de verhouding te berekenen. Gebruik vergelijking (1) hieronder; molecuulgewicht wordt afgekort als MW.
(1)
- Radioactieve etikettering
NOTITIE: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor het omgaan met radioactiviteit, inclusief een laboratoriumjas, handschoenen en een persoonlijke lichaams- en ringdosismeter, volgens de institutionele voorschriften. Onderzoek en vervang handschoenen regelmatig om radioactieve besmetting te voorkomen. Gebruik loodafscherming en vergroot de afstand tot de radioactieve bron door deze indien mogelijk met een tang te hanteren.- Breng radioactiviteit over van de transportflacon naar een nieuwe injectieflacon met behulp van een pipet. Meet de radioactiviteit.
- Verwijder een aliquot voor de eerste radiolabelingreactie. Voeg 50 μL ammoniumacetaat (pH 5,5) per 1 mCi van 64Cu-CuCl3 toe. Meet de pH door 1 μL te pipetteren op een pH-strip met een bereik dat 5,5 opvangt met voldoende resolutie om onderscheid te maken tussen 5 en 6.
- Als de pH niet 4-5,5 is, verander deze dan met 1 M NaOH of 0,1 M HCl. Voeg kleine hoeveelheden toe, 1-5 μL, van 1 M NaOH als de pH lager is dan 4 of 0,1 M HCl als de pH hoger is dan 5,5 totdat de juiste pH is bereikt. Meng bij elke toevoeging grondig, draai naar beneden en meet de pH zoals hierboven beschreven. Noteer elke toevoeging en verwijdering van een oplossing (inclusief het controleren van de pH) zodat het uiteindelijke volume kan worden berekend.
- Zodra de optimale pH is bereikt, voegt u 10 μg DOTA-hCD19-mAb toe per 1 mCi van 64Cu-CuCl3. Meng voorzichtig en draai kort om.
- Plaats de reactieflacon op een thermomixer die is ingesteld op 37 °C en 400 omwentelingen per minuut (rpm).
- Blus na 30 minuten de reactie: deel het totale reactievolume door 50 en voeg dat volume van 0,5 M EDTA toe aan het reactiemengsel.
- Bepaal de etiketteringsefficiëntie met behulp van instant dunnelaagchromatografie (ITLC) om het percentage gebonden en vrij koper in de oplossing te meten.
- Knip stroken TLC-papier van 1 cm breed. Markeer 1 cm van de boven- en onderkant van de strip en maak een buis (conische kolf van 50 ml) met mobiele fase van minder dan 1 cm citroenzuur van 0,1 M (het niveau van de mobiele fase moet lager zijn dan de markering van 1 cm op de strip wanneer deze in de buis wordt geplaatst).
- Pipetteer 1 μl van de reactieoplossing op de strip aan de onderste 1 cm markering (oplosmiddelvoorkant) en plaats de strip in de buis. Kijk totdat het oplosmiddelfront de bovenste markering van 1 cm bereikt, verwijder de strip en wikkel deze in een stuk plasticfolie.
- Plaats de strip op het platform en haal deze door een radio-TLC-beeldscanner. Zoek naar de radioactief gelabelde mAb aan de oorsprong en de vrije 64Cu die meereist met het mobiele fasefront (Figuur 2). Als het percentage vrij koper minder dan 5% is (95% etiketteringsefficiëntie), ga dan verder met injectie bij dieren. Als het percentage vrij koper groter is dan 5%, ga dan verder met zuiveren.
OPMERKING: Het percentage vrij koper hangt over het algemeen af van de verhouding DOTA-mAb tot 64Cu, reactietijd, pH en temperatuur. De reactieomstandigheden moeten door elke gebruiker worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe mAb om consistente resultaten te garanderen.
- Zuivering via een wegwerp zwaartekrachtkolom van DNA-kwaliteit
- Conditioneer een wegwerpbare zwaartekrachtstroomkolom van DNA-kwaliteit (ontzoutings-/bufferuitwisselingskolom) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Plaats de wegwerpbare zwaartekrachtkolom van DNA-kwaliteit op een ringstandaard of ander instrument achter voldoende loden afscherming; Zorg ervoor dat het apparaat stabiel en gemakkelijk verplaatsbaar is. Plaats de buis onder de kolom.
- Pipeteer het ruwe reactiemengsel op de hars van de zwaartekrachtstroomkolom. Wacht tot alle vloeistof in de hars is gestroomd. Pipetteer voldoende PBS om het volledige volume (ruw product plus PBS) op 500 μl te brengen.
- Plaats de kolom over centrifugebuisjes van 1.5 ml met het label 1-10. Voeg 1 ml PBS toe aan de kolom. Verzamel vijf druppels in elke buis totdat de stroom is gestopt.
NOTITIE: Er kunnen minder dan 10 buizen nodig zijn. - Sluit de onderkant van de kolom af en meet de resterende radioactiviteit. Meet elke injectieflacon met doorstroom. Maak voor elke injectieflacon met meer dan 50 μCi een ITLC per stap 3.3.7 om het percentage gebonden koper in elke fractie te meten.
OPMERKING: De eerste één of twee breuken bevatten alleen de mobiele fase; de radioactief gelabelde mAb zal als eerste elueren (meestal fracties 2 of 3 tot en met 5 of 6) en de vrije 64Cu zal als laatste elueren (sommige zullen aan de kolom blijven plakken). Het percentage gebonden 64Cu kan variëren tussen fracties. - Combineer de fracties met een binding van meer dan 95% (minder dan 5% vrij koper); Gebruik de oplossing voor injectie. Voer desgewenst HPLC uit om radiolabeling5 te bevestigen en de molaire activiteit te berekenen. Bewaar een aliquot om de concentratie op een UV-VIS spectrofotometer te meten nadat deze 10 halfwaardetijden (127 uur of 5,3 dagen) is vervallen.
(1)4. Bereiding van de dosis
OPMERKING: Draag voordat u de dosis hanteert de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder laboratoriumjassen, lichaams- en vingerdosimeters en handschoenen.
- Injecteer 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 uur voorafgaand aan de PET-scan, om een adequate circulatie van de radiotracer in het lichaam mogelijk te maken.
- Plaats de loodcontainer met de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb direct achter de loodafscherming. Schakel de geigerteller in om mogelijke besmetting te controleren.
NOTITIE: Wissel regelmatig van handschoenen bij het hanteren van radioactief materiaal. Het wordt aanbevolen om tijdens het trekken van de doses dubbele handschoenen aan te trekken om snel van handschoen te kunnen wisselen. Plaats verontreinigde scherpe voorwerpen en afval altijd in de daarvoor bestemde afgeschermde afvalruimte. - Verdun de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb tot een geschikte concentratie in een plastic centrifugebuisje met een lage binding van 1,5 ml.
OPMERKING: De 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bindt zich aan plastic als deze niet laag bindt; 64 okt.Cu bindt zich aan glas.- Verdun de radiotracer in zoutoplossing om radiolyse te voorkomen en het trekken van consistente doses te vereenvoudigen.
- Bereid doses voor om indien mogelijk tussen 75 en 150 μCi in 100 μL toe te dienen. Zorg ervoor dat het maximale totale geïnjecteerde volume niet hoger is dan 10% van het lichaamsgewicht van de muis.
- Gebruik een insulinespuit van 500 μl (50 cc) om de dosis uit de plastic buis met lage binding op te zuigen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten, aangezien deze intraveneus wordt geïnjecteerd.
- Etiketteer de spuiten vooraf met de bijbehorende diernummers.
- Noteer de dosisactiviteit en -tijd in een laboratoriumnotitieboekje voor gegevensanalyse.
- Houd de doses klaar voor injectie zodra de dieren zijn gekatheteriseerd om de tijd onder narcose te verkorten.
- Nadat de doses zijn voorbereid, bereidt u een standaard (fantoom) voor om te scannen om een kalibratiefactor te genereren.
- Vul een conische buis van 15 ml met 50-75 μCi activiteit verdund in water (of PBS).
NOTITIE: Zorg voor een grondige menging van de oplossing. De standaard kan vrij zijn 64Cu die overblijft na etikettering.- Meet de hoeveelheid activiteit in de norm en noteer de tijd.
- Vul een conische buis van 15 ml met 50-75 μCi activiteit verdund in water (of PBS).
5. Canulatie en injectie
OPMERKING: Zie eerder beschreven methoden 6 voor intraveneuze canulatie van muizen voor injectie van de radiotracer6.
- Weeg en scoor de muizen op ernst van de ziekte zoals beschreven in rubriek 2.1 voordat de muizen worden verdoofd in een knockdown-doos gevuld met 1,5-3% isofluraan ter voorbereiding op toediening van radiotracer.
OPMERKING: Deze muizen worden geïnjecteerd op het tafelblad, niet op de PET-scanner zoals eerder beschreven. Het is niet nodig om de katheters op hun plaats te lijmen voor injectie, omdat de muizen niet worden verplaatst tussen canulatie en injectie. - Zodra een muis is gecanuleerd, steekt u de naald in het uiteinde van de katheter en injecteert u langzaam. Na de injectie volgt met een kleine spoeling met zoutoplossing door de katheter om ervoor te zorgen dat de volledige dosis wordt geïnjecteerd.
OPMERKING: Het volume moet ongeveer gelijk zijn aan het dode volume van de katheter, dat 50 μL is voor de katheters die door de auteurs worden gebruikt.- Injecteer over een stuk laboratoriumdoekje om eventuele druppels radiotracer op te vangen; Neem dit mee bij het meten van de restdosis.
- Noteer het tijdstip van injectie in een laboratoriumnotitieboekje.
- Verwijder de canule onmiddellijk na de injectie. Meet de canule, doseerspuit en het weefsel met behulp van een dosiskalibrator om de resterende dosis te bepalen die niet in de muis is geïnjecteerd.
- Noteer de activiteit en tijd in een labnotitieboek.
- Nadat de muizen zijn geïnjecteerd, labelt u hun kooien met een kooikaart die aangeeft dat de muizen radioactief zijn. Registreer en log de kooien volgens de richtlijnen van de instelling. Plaats de muizen vervolgens in een aangewezen radioactieve opslagplaats.
6. PET/CT-beeldvorming
- Voer PET-beeldvorming uit 18-24 uur na de injectie van 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Weeg en scoor de muizen voordat ze worden gescand.
OPMERKING: De gebruiksaanwijzing van de scanner is afhankelijk van de scanner die wordt gebruikt.- Zorg ervoor dat de röntgencomponent van de PET/CT-scanner is opgewarmd en klaar is voor opname.
- Open de software voor het verwerven van PET-scanners op de computer.
- Klik in het vervolgkeuzemenu Investigator Login op de juiste laboratoriuminformatie.
- Maak op de pagina Project een nieuw project aan of selecteer een bestaand project in het vervolgkeuzemenu.
- Wanneer de initialisatieprompt automatisch op het scherm verschijnt, klikt u op Home Bed en wacht u tot het bed naar huis gaat. Klik vervolgens op Opwarmen CT.
- Zorg ervoor dat de CT-afschermingsdeur gesloten is om de CT op te warmen.
- Terwijl de scanner aan het opwarmen is, scoor je de EAE-muizen en injecteer je ze subcutaan met 0,2-0,4 ml warme zoutoplossing in de flank voor hydratatie.
- Nadat de scanner is opgewarmd, gaat u terug naar de computer om de PET-scans voor het onderzoek in te stellen.
OPMERKING: Deze kunnen voorafgaand aan de dag van de scan worden ingesteld.- Klik onder het kopje Recente onderzoeken op Nieuw onderzoek maken. Vul de naam van het onderzoek, het protocol, de verbinding en de informatie over de proefpersoon in.
- Als u een PET/CT uitvoert, selecteert u eerst PET-protocol en selecteert u vervolgens CT-protocol.
OPMERKING: Doorgaans is een standaard CT voldoende voor het scannen van het EAE-muismodel. Een CT-scan duurt 1 minuut en wordt verkregen met binning op 2 x 2 bij een spanning van 80 kVp, een stroom van 150 μA en 720 projecties. CT-beelden worden gereconstrueerd met behulp van een Modified Feldkamp Algorithm. - Kies voor het PET-protocol een statische scan van 10-15 minuten met 64 koperen. Als deze scan nog niet in de lijst met beschikbare protocollen staat, voeg deze dan toe door te klikken op het tabblad Protocollen in het menu Standaard , Nieuw protocol maken | Vervolgkeuzemenu Isotopen . Staat de gewenste isotoop er niet bij, klik dan op Meer | Voeg toe vanuit de bibliotheek en voeg de gewenste isotoop toe. Definieer de scanduur, klik op het keuzerondje voor Static Scan, geef het protocol een naam en klik op Opslaan.
- Ga terug naar het tabblad Studies en ga verder met het benoemen en instellen van alle gewenste scans voor de dag.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ook één "CT-test"-scan op te zetten met alleen een standaard CT om de bedpositionering van de eerste scan te controleren om een optimale plaatsing te garanderen. Dit zou de eerste scan moeten zijn die voor het onderzoek wordt uitgevoerd.
- Als u een PET/CT uitvoert, selecteert u eerst PET-protocol en selecteert u vervolgens CT-protocol.
- Klik onder het kopje Recente onderzoeken op Nieuw onderzoek maken. Vul de naam van het onderzoek, het protocol, de verbinding en de informatie over de proefpersoon in.
- Zodra de scanner klaar is, verdooft u de muizen in een knockdown-doos om ze voor te bereiden op de scan.
OPMERKING: In dit stadium zijn de muizen waarschijnlijk erg ziek; Het is een goede gewoonte om de tijd onder narcose tot een minimum te beperken.- Breng ooggel aan.
- Zorg ervoor dat het scanbed met vier muizen is uitgerust met verwarmingselementen, zoals verwarmingskussens of verwarmde lucht, met isofluraan ingesteld op 1.5%-2% en verwarmingskussen ingeschakeld (Afbeelding 3). Leg de muizen in rugligging op het scanbed.
- Naarmate de EAE-ziekte vordert, wordt de wervelkolom van de muis ernstig gebogen. Scan de muizen terwijl ze op hun rug liggen om de ruggengraat zoveel mogelijk te strekken, waardoor de analyse stroomafwaarts wordt verbeterd. Trek voorzichtig aan de staart van de muis om te helpen bij het strekken van de ruggengraat.
- Eenmaal in rugligging, plakt u elke muis stevig op zijn plaats met zachte microscooptape. Gebruik een strook tape over het hoofd en een andere voorzichtig over de buik om beweging als gevolg van ademhaling te minimaliseren.
- Noteer in een labnotitieboekje welke muis zich in welke scanpositie bevindt.
- Zodra de muizen zijn vastgezet, keert u terug naar de scancomputer om de scanner te bedienen.
- Open het menu Motion Controller . Klik op het gezichtsveld van het PET-centrum om de muizen op het scanbed in de PET-ring te verplaatsen. Voor de eerste scan van de dag klikt u op CT Center FOV. Eenmaal in positie, voert u de CT-testscan uit om er zeker van te zijn dat de positie correct is; Herhaal dit totdat de bedpositie bevredigend is.
- Plak een klein stukje witte tape op het scanbed om de juiste plaatsing van het bed voor de rest van het onderzoek te markeren.
- Zodra het bed op zijn plaats staat voor de PET-scan, start u de scanreeks door op Uitvoeren te klikken.
- Wacht tot de scanner automatisch van de PET-ring naar de CT gaat.
- Controleer altijd visueel of de dieren in de juiste positie zijn gekomen voor zowel PET als CT.
- Noteer de starttijd van de scan in een laboratoriumnotitieboekje voor vervalcorrectie van de dosis die tijdens de gegevensanalyse wordt geïnjecteerd.
- Nadat de scan is voltooid, laat u de afbeelding reconstrueren. Controleer de gegevens voordat u de dieren verwijdert.
OPMERKING: 3D-geordende reconstructie van subsets verwachtingsmaximalisatie (OSEM) duurt ongeveer 5 minuten voor een statische scan. - Controleer en keur de gegevens visueel goed, waarbij u de milt als positieve controle gebruikt, aangezien dit weefsel een groot aantal B-cellen bevat. Haal de dieren uit het scanbed en plaats ze in een met isofluraan gevulde knockdown-doos ter voorbereiding op perfusie en daaropvolgende dissectie.
- Herhaal stap 6.5-6.12 voor de overige muizen in het onderzoek.
- Wanneer alle muizen zijn gescand of bij het scannen van een groep die een open plek in het scanbed heeft, scant u de standaard die in stap 4.6 is voorbereid.
7. Dissectie voor ex vivo gammatelling en autoradiografie
- Zorg ervoor dat alle gammatellings- en centrifugebuisjes vooraf zijn gewogen voordat u gaat ontleden.
- Voer euthanasie uit via perfusie, zoals eerder beschreven6, met PBS en thoracotomie terwijl de muizen diep verdoofd zijn (continue inhalatie van 4% isofluraan, 2 L/min 100% O2).
- Om het beenmerg te verwijderen, snijdt u beide dijbenen bij de knie en het bekken door. Zorg ervoor dat beide koppen van het dijbeen zijn verwijderd.
- Plaats beide dijbenen in een centrifugebuis van 0,5 ml met een gat aan de onderkant (met een naald van 20 G) en waarvan het deksel is afgesneden.
- Plaats het buisje van 0,5 ml met de dijbenen in een centrifugebuisje van 1,5 ml met het deksel eraf.
- Plaats de hele buisopstelling in een minicentrifuge. Centrifugeer gedurende 4 minuten op 4.500 × g.
OPMERKING: Het beenmerg moet door het gat in de 0.5 ml centrifugebuis worden losgemaakt en op de bodem van de 1.5 ml centrifugebuis bezinken.- Scheid de buizen. Weeg de lege dijbenen in de centrifugebuis van 0,5 ml. Weeg het beenmerg in de centrifugebuis van 1,5 ml. Plaats elk centrifugebuisje in gammatelbuisjes.
- Verwijder de hersenen met een tang en schaar en zorg ervoor dat de hersenstam intact blijft. Plaats de hersenen in een gamma-telbuis. Noteer het droge gewicht, spoel het met PBS en bewaar het op ijs totdat het klaar is om te tellen.
- Voer de volgende stappen uit om het ruggenmerg te verwijderen.
- Verwijder de huid en vacht door een incisie te maken langs de dorsale zijde van het dier om de wervelkolom bloot te leggen (Figuur 1).
- Scheid de lumbale (L) van de cervicale (C) en thoracale regio's door langs drie dwarsvlakken rond en door de wervelkolom te snijden: aan de basis van de nek (C1-wervel) (Figuur 1D, nummer 1); aan de basis van de ribbenkast (L1-wervel) (figuur 1D, nummer 2); aan de basis van het bekken (L5-wervel) (Figuur 1D, nummer 3).
- Snijd onder de ribbenkast (Figuur 1D, nummer 2).
- Snijd direct boven het heiligbeen om het lumbale ruggengraatgebied te scheiden. Knip de wervelkolom voorzichtig af vanaf het bekkenuiteinde totdat het lumbale ruggenmerg zichtbaar is (Figuur 1D, nummer 3). Snijd de omliggende weefsels af om de lumbale en cervicale/thoracale gebieden van de wervelkolom te isoleren (Figuur 1D, nummers 4 en 5).
- Om het ruggenmerg te verdrijven, gebruikt u een injectiespuit met schuifpunt (3-10 ml) gevuld met PBS. Maak met duim en wijsvinger een afdichting tussen de spuit en de wervelkolom.
- Duw de PBS voorzichtig door de spuit om het ruggenmerg op een absorberend kussentje te verdrijven (Figuur 1E); Herhaal dit voor beide spinale regio's. Plaats de ruggenmergweefsels in een gammatelbuis.
- Noteer het drooggewicht en voeg PBS toe om ervoor te zorgen dat het weefsel zich op de bodem van de buis bevindt om uitdroging te voorkomen. Plaats de buis op ijs totdat hij klaar is om te tellen.
- Verdrijf het cervicale/thoracale ruggenmerg uit het craniale uiteinde en het lumbale ruggenmerg uit het caudale uiteinde van de wervelkolom (figuur 1E).
8. Ex vivo gammatelling
- Open de gammatellersoftware. Navigeer naar de werklijst en selecteer het gewenste protocol, zoals een 30 s telprotocol voor 64Cu.
- Bereid ten minste drie standaarden voor in afzonderlijke buizen. Voer ze nu uit voor gebruik in de analyse (stap 10.2). Streef ernaar om drie replicavolumes en hoeveelheden activiteit te maken in drie afzonderlijke buizen.
OPMERKING: Een volume van 500 μL geeft goede resultaten. Hoewel de activiteit wordt bepaald door de gebruikte machine, werkt 10 μCi over het algemeen goed. - Plaats de normen in een rek met de streepjescode die overeenkomt met het gewenste protocol dat moet worden uitgevoerd. Plaats het rek op de gammateller.
- Plaats na het noteren van de orgaangewichten de buisjes met de organen op het gammatelrek na de buisjes met de standaarden.
OPMERKING: Organen die van belang zijn voor dit model kunnen axiale lymfeklieren, bloed, beenmerg, hersenen, cervicale lymfeklieren, dijbeen, hart, lever, lumbaal ruggenmerg, spier, milt, staart en cervicaal/thoracaal ruggenmerg zijn. - Zet een rek met een stopbarcode achterin de gammateller.
- Druk op de afspeelknop op de computer. Druk indien mogelijk pas op Play als er meerdere rekken of organen moeten worden gebruikt, zodat alle buizen continu in één bestand kunnen worden geteld. Zorg ervoor dat er voor elke run een rek met een stopbarcode achter in de gammateller staat.
- Ren totdat alle monsters zijn geteld. Sla het bestand op en exporteer het.
9. Ex vivo autoradiografie (ARG) van CZS-weefsel
- Volg eerder gepubliceerde stappen voor zowel hersen- als ruggenmerg-ARG (met uitzondering van stappen 2-6 beschreven door Chaney et al., aangezien de muizen al zijn geïnjecteerd met radiotracer van de PET-scan)6.
NOTITIE: Specifieke instructies voor het voorbereiden van de ARG-cassette van het ruggenmerg staan hiervermeld 6. - Nadat de gammatelling voor het lumbale en cervicale/thoracale ruggenmerg is voltooid, plaatst u de buisjes onmiddellijk op ijs totdat alle CZS-weefsels zijn geteld.
OPMERKING: Raadpleeg de eerder gepubliceerde methode voor ARG van de hersenen6. - Kantel de buisjes voorzichtig zodat het ruggenmerg op een absorberend kussentje kan vallen. Als het ruggenmerg aan de zijkant van de buis plakt, spoel dan voorzichtig met koude PBS en kantel de buis opnieuw. Droog elk ruggenmerg zorgvuldig af door voorzichtig te deppen met een laboratoriumdoekje. Leg de gedroogde ruggenmerg op een georganiseerde manier op een dik zwart stuk papier.
- Label naast het ruggenmerg met een witte pen voor gemakkelijke identificatie.
- Laat ruimte in de hoeken en in het midden van het zwarte papier om stapels van drie microscoopglaasjes te plaatsen om als afstandhouders te fungeren om compressie van het ruggenmerg te voorkomen wanneer de ARG-cassette gesloten is. Gebruik 5-7 stapels.
- Zodra alle lumbale en cervicale/thoracale ruggenmerg op het zwarte papier zijn geplaatst en gelabeld, plaatst u het stuk papier voorzichtig in de ARG-cassette. Plaats de open cassette op een dienblad met droogijs om het ruggenmerg te bevriezen.
- Eenmaal bevroren, plaatst u voorzichtig plasticfolie tussen het digitale fosforopslagscherm en het ruggenmerg en plaatst u het scherm bovenop de monsters. Sluit de cassette onmiddellijk en plaats deze in de vriezer van -20 °C gedurende ongeveer 10 halfwaardetijden (~127 uur).
- Wanneer de belichtingstijd is verstreken, scant u de film met een fosforimager. Analyseer het resulterende digitale beeld (zie sectie 12 voor instructies).
10. Analyse van biodistributiegegevens
- Stel een "Dose Correction"-spreadsheet op om de tijdcorrectie voor het radioactieve verval wiskundig te bepalen, waardoor stralingsdoses worden genormaliseerd en vergelijkingen tussen proefpersonen mogelijk worden.
- Corrigeer alle doses naar de injectietijd, rekening houdend met de resterende activiteit die na de injectie in de spuit en katheter achterblijft.
- Gebruik de standaarden die in stap 8.2 zijn opgesteld, neem het gemiddelde van de activiteitshoeveelheid (μCi) en het genormaliseerde aantal per minuut (CPM). Deel de gemiddelde CPM door het gemiddelde standaard activiteitsbedrag om CPM/μCi te krijgen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de activiteitshoeveelheid voor elke norm vervalgecorrigeerd is voor het tijdstip waarop de gammateller de CPM van de normen telt. De gammateller moet alle CPM-waarden normaliseren naar de starttijd van het protocol.
- Stel de spreadsheet "Resultaten" in om het uiteindelijke percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel (%ID/g) voor elk monster te berekenen.
- Corrigeer de genormaliseerde CPM van de gammateller voor elk geteld monster naar de injectietijd van het dier.
OPMERKING: Vervalcorrectie kan op elk tijdstip plaatsvinden; zorg ervoor dat alle doses en CPM-waarden worden gecorrigeerd voor verval tot hetzelfde tijdstip. - Normaliseer de voor verval gecorrigeerde CPM naar de massa van elk monster om de CPM per monster te bepalen. Bereken de totale geïnjecteerde CPM door de CPM in de staart af te trekken van de berekende geïnjecteerde CPM.
OPMERKING: De staart hoeft niet massagecorrigeerd te worden, aangezien deze CPM-waarde gewoon wordt afgetrokken van de totale geïnjecteerde CPM om rekening te houden met eventuele extraveneuze tracer van injectie. - Deel de CPM per massa door de totale geïnjecteerde CPM om %ID/g te berekenen.
- Corrigeer de genormaliseerde CPM van de gammateller voor elk geteld monster naar de injectietijd van het dier.
- Stel een "Samenvatting"-spreadsheet in om de uiteindelijke resultaten weer te geven voor invoer in grafische software en daaropvolgende gegevensvisualisatie en statistische analyse.
11. Analyse van PET-afbeeldingen
- Open de PET-analysesoftware. lik op Bestand |Open lokale data | DICOM. Zoek het gewenste bestand (DICOM-formaat). Open zowel de PET als de CT.
- Stel in de Data Manager het PET- en CT-contrast in op de gewenste niveaus.
- Registreer en snijd individuele muizen bij.
- Selecteer in het navigatiemenu het tabblad Heroriëntatie/registratie.
- Ga naar het menu Rigide op dit tabblad. Wijs de CT-scan (0) aan als de Vaste scan en de PET-scan (1) als de Bewegende scan.
- Kies voor Rigid Transformation en Fast Quality. Klik op Registreren.
- Nadat de registratie is voltooid (5-10 min), klikt u op het vinkje om de registratie op te slaan.
- Inspecteer de gegevens visueel om er zeker van te zijn dat de registratie is geslaagd. Exporteer de sessie door te klikken op Bestand | Sessie | Exporteren.
- Snijd vervolgens elke muis bij in een volledige lichaamsuitsnede: ga naar het navigatiemenu en klik op Bijsnijden. Sleep de zijkanten van elke doorsnede vanaf de buitenrand naar binnen.
- Zodra de gewenste muis strak is bijgesneden, klikt u op het vinkje en exporteert u de sessie om op te slaan.
- Snijd vervolgens de hoofden van elke muis bij en zet ze recht voor hersenanalyse met behulp van de handmatige vertaling, rotaties en spiegels in het menu Registratie/heroriëntatie . Exporteren om op te slaan.
- Analyseer het ruggenmerg.
- Om te beginnen met de analyse van interessegebieden (ROI's) in het ruggenmerg, opent u de 3D ROI-tool vanuit het navigatiemenu .
- Gebruik onder het kopje ROI's het plusteken onder aan het menu om zes ROI's te maken: lumbale ROI, cervicale/thoracale ROI, lumbaal skelet, thoracaal skelet, lumbale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg.
OPMERKING: De lumbale en cervicale/thoracale ROI's zijn gegeneraliseerde grote ROI's die zullen worden gebruikt om de skelet-ROI's te maken (Figuur 4). - Om visuele interferentie van het PET-signaal bij deze stap te voorkomen, klikt u op F3 om de PET uit te schakelen.
- Ga naar de bovenkant van de 3D ROI Tool Operator. Klik op de ononderbroken stip rechts van het cursorsymbool om de 3D-tekenmodus en het menu Erode/Dilate te openen.
- Selecteer Bol en verander de grootte in 20 pixels. Stel Dilate in op +5.
- Ga voordat u verder gaat naar de onderkant van het menu. Zorg ervoor dat de lumbale ROI is geselecteerd, aangezien dit de eerste ROI is die moet worden getrokken.
- Zoek op de CT de L6-wervel van de wervelkolom (waar de wervelkolom de heupen ontmoet). Begin met één wervel boven L6 en teken een ruwe ROI Lumbale ROI over de vijf wervels boven de heupen (L1-L5 wervels). Schakel vervolgens over naar Cervicale/Thoracale ROI en traceer de rest van de wervelkolom naar de basis van de schedel.
OPMERKING: Dit hoeft niet nauwkeurig te zijn, omdat het wordt gebruikt om aan te geven waar Otsu-drempels moeten plaatsvinden in stap 11.4.8. - Nadat u de algemene ROI's hebt getekend, gaat u naar de bovenkant van de operator. Selecteer het menu Segmentatie-algoritmen .
- Selecteer in het vervolgkeuzemenu Otsu-drempels. Selecteer voor de invoer Lumbale ROI. Zorg ervoor dat onder aan het menu Lumbaal skelet is geselecteerd. Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu naast Afbeelding de CT-scan is geselecteerd en klik op Toepassen. Herhaal dit voor cervicale/thoracale ROI en thoracaal skelet.
- Als de Otsu-drempel de wervelkolom niet voldoende benadrukt, gebruik dan globale drempels en verander de Min-waarde in 350 en de Max in 3,500 voor handmatige drempels en pas indien nodig aan om de wervels te isoleren.
- Nadat u Otsu-drempels hebt gebruikt om de Skeleton-ROI's te maken, keert u terug naar het menu Navigatie (cursorpictogram). Verwijder of vink de H-kolom (verbergen) aan voor zowel de ruwe lumbale als cervicale/thoracale ROI's om ze te verbergen. Vink de kolom I (onveranderlijk) aan voor beide skelet-ROI's, zodat ze niet kunnen worden bewerkt.
- Keer ten slotte terug naar de bovenkant van de 3D ROI Tool Operator en ga naar het 3D Paint-menu om de ROI's van het ruggenmerg te tekenen.
- Selecteer het gereedschap Bol opnieuw en traceer het ruggenmerg in het skelet voor zowel lumbaal als thoracaal, waarbij u ervoor zorgt dat de juiste ROI onder aan het menu wordt geselecteerd.
- Om een ROI te wissen, klikt u op Command/Control en tekent u over het te wissen onderdeel.
- Controleer de ROI van het ruggenmerg van alle drie de vlakken om er zeker van te zijn dat er geen ROI buiten de wervelkolom wordt getrokken.
- Exporteer de resultaten van de ruggenmerganalyse.
- Als het PET-signaal is uitgeschakeld in stap 11.4.3, drukt u op F3 nadat de ROI's van het ruggenmerg zijn getekend om de PET weer in te schakelen, of selecteert u de Visual Controller (VC) en klikt u op de PET-balk.
- Ga terug naar het menu Navigatie (cursorpictogram). Klik op het rasterpictogram om Tabel weer te geven. Kopieer de tabel naar spreadsheetsoftware en sla deze op.
- Exporteer ten slotte het bestand in PET-analysesoftware, zoals hierboven beschreven, om de getrokken ROI's op te slaan.
- Analyseer de hersenen met behulp van een semi-geautomatiseerde 3D-atlas.
- Open het hoofdbijsnijdbestand. Importeer de hersenatlas van de muis door naar het menu Geavanceerde modules te gaan en de 3D Brain Atlas Tool te selecteren. Zorg ervoor dat de referentie is ingesteld op CT en dat de bijsnijdoptie niet is aangevinkt. Stel een pad in voor de uitvoermap.
- Wijzig in Geavanceerde instelling Transformeren in Versor-Affine. Behoud alle andere standaardinstellingen. Klik op Uitvoeren.
- Pas de atlas handmatig aan in het menu Heroriëntatie/Registratie en gebruik de CT van de schedel als richtlijn voor het passen van de atlas.
- Wees zeer voorzichtig als schaalvergroting nodig is, omdat dit de volumes van de hersenstructuur sterk kan beïnvloeden. Klik op het vinkje wanneer de aanpassing is voltooid.
- Voer de atlas opnieuw uit met 3D-ROI's importeren geselecteerd.
- Exporteer het bestand om de atlas op te slaan die op de bijgesneden kop is gemonteerd.
- Na het tekenen en exporteren van alle ROI's van de gewenste organen, berekent u een standaard bindingscorrectiewaarde. Corrigeer alle gegevens en converteer naar %ID/g zoals eerder beschreven6. Normaliseer naar het orgaan dat past bij het diermodel, zoals het hart, om te normaliseren naar radiotracer aanwezig in de bloedpool.
12. Ex vivo autoradiografie-analyse
- Open het digitale beeldbestand (.gel) met behulp van de beeldanalysesoftware. Pas de helderheid en het contrast aan tot de gewenste drempelwaarde. Pas desgewenst een geschikte kleuropzoektabel toe.
OPMERKING: Koninklijke of grijze tinten worden aanbevolen voor het gemak van visualisatie.
Representative Results
De hCD19-mAb was DOTA-geconjugeerd en radioactief gelabeld met 64Cu, zoals weergegeven in figuur 2. EAE en naïeve muizen ondergingen 18-24 uur na injectie een PET/CT-scan (Figuur 3) met 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. PET/CT-beelden werden mede geregistreerd met behulp van de PET-analysesoftware en de CZS-weefsels werden geanalyseerd met behulp van handmatige ROI's of een semi-geautomatiseerde 3D-hersenatlas. De binding aan radiotracers in ROI's (figuur 4) was hoger bij EAE-muizen dan bij naïeve muizen. Ex vivo gammatelling en ARG toonden een verhoogde binding in het ruggenmerg (zowel lumbale als cervicale thoracale segmenten) en hersenen (alleen ARG) van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen (Figuur 5 en Figuur 6). Ex vivo gammatelling van geperfuseerde muizen toonde ook een verminderde radiotracerbinding in perifere organen, waaronder milt, dijbeen en beenmerg (Figuur 5), consistent met B-cellen die de periferie verlaten en het CZS infiltreren in dit EAE-model.
Figuur 2: Conjugatie- en radiolabelingschema voor het genereren van 64 Cu-gelabeld mensspecifiek CD19 monoklonaal antilichaam, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), naast kwaliteitscontrolegegevens. (A) Reactie van DOTA-NHS-ester met hCD19 monoklonaal antilichaam om hCD19-DOTA-conjugaat te produceren (niet op schaal) en radiolabeling met 64 Cu-CuCl3 om 64Cu-DOTA-hCD19-mAb te produceren. (B) Representatieve ITLC-chromatograaf. De piek op 40-60 cm is het radioactief gelabelde antilichaam; ongebonden 64Cu-CuCl3 reist met de mobiele fase mee en zou aanwezig zijn van 200 tot 240 cm. Er is geen detecteerbare vrije 64Cu-CuCl3 in deze chromatograaf. (C) De specificaties voor kwaliteitscontrole van het radioactief gelabelde antilichaam. Afkortingen: DOTA-NHS-ester = 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur mono-N-hydroxysuccinimide-ester; ITLC/HPLC = onmiddellijke dunnelaagchromatografie/hoogwaardige vloeistofchromatografie; MALDI/LC-MS = matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie/vloeistofchromatografie-massaspectrometrie; CPM = aantal per minuut. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Foto's die laten zien hoe muizen in een 3D-geprint bed in de PET-scanner kunnen worden vastgezet om hoogwaardige beeldvorming van het ruggenmerg en de hersenen mogelijk te maken en tegelijkertijd beweging te minimaliseren. (A) 3D-geprint scannerbed met vier muizen (ook bekend als "muizenhotel") uitgerust met verwarmingselementen en anesthesieslangen. (B) Verdoofde muizen in rugligging om de rechtheid van de wervelkolom te maximaliseren; De bedpositie van elke muis wordt geregistreerd. (C) Muizen stevig over hun hoofd geplakt om beweging in de hersenen en over de buik te minimaliseren om beweging van de ademhaling te minimaliseren, zonder de ademhaling te beïnvloeden. (D) Muisbed dat in de scanner is geplaatst en op het scanbed is geplakt. De anesthesieslang werd van de scanner naar het bed gebracht en de isofluraan werd op 2% gezet. De ademhaling van de muis werd gecontroleerd om zeker te zijn van het juiste isofluraanniveau voordat de scannerdeur werd gesloten. Afkorting: PET = Positron emissie tomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ruggenmergbeeld en hersenanalyse en resultaten met behulp van PET-analysesoftware . (A) i) ROI's (roze en bruin ) getekend op de wervelkolom om lumbale van de borst- en halswervels te scheiden en het beeld voor te bereiden op Otsu-drempels. ii ) Ruggenwervels (turkoois en rood) werden gesegmenteerd met behulp van Otsu-drempels. iii ) Wervels werden vervolgens onveranderlijk gemaakt in het 3D ROI-menu en het ruggenmerg werd verdeeld in cervicale/thoracale (paarse) en lumbale (marine) ROI's. iv) De vertebrale ROI werd verwijderd, waardoor de ROI's van het ruggenmerg en de representatieve hersenatlas werden toegepast. (B) Representatieve analyse van PET-resultaten van verschillende CZS-regio's weergegeven als %ID/g genormaliseerd naar de ROI van het hart in elk dier. PET-acquisitie was een statische scan van 10 minuten via PET/CT-beeldvorming. Hersengebieden gekwantificeerd met behulp van een semi-geautomatiseerde hersenatlasbenadering, weergegeven in paneel A. iv) Representatieve resultaten tonen een significante of tendens in de richting van een significante toename van tracerbinding in de hersenen en het thoracale ruggenmerg. Statistieken uitgevoerd met behulp van de t-toets van de student (*: p < 0,0332). Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; ROI's = regio's van belang; CZS = centraal zenuwstelsel; CT = computertomografie; %ID/g = percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve kwantificering van ex vivo gammatelling in verschillende organen bij EAE en naïeve muizen, uitgedrukt als %ID/g. Na de PET-scan werden muizen geperfundeerd met PBS om de radiotracer in het bloed te verwijderen, vrij of gebonden aan in het bloed levende CD19 + B-cellen, en organen werden snel ontleed en gewogen om een nauwkeurig gewicht van elk orgaan te hebben. Tracerbinding is significant verminderd in de milt en het beenmerg bij EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen. Verhoogde radiotracerbinding wordt waargenomen in zowel de lumbale als de cervicale/thoracale ruggenmergsegmenten van EAE-muizen. De hersenen vertonen geen significante toename van het radiotracersignaal, hoewel het neigt naar een significante toename. Statistieken uitgevoerd met behulp van de t-toets van de student (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; %ID/g = percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Ex vivo ARG-beelden tonen 64Cu-DOTA-hCD19-mAb-binding in sagittale hersensecties en hele ruggenmerg van EAE in vergelijking met naïeve muizen. Digitale fosforopslagfilms werden gescand met behulp van een fosforimager nadat ze waren blootgesteld aan radioactieve weefselmonsters gedurende ongeveer 10 halfwaardetijden (127 uur of 5 dagen). De resulterende beelden onthullen een visueel hoger signaal in de hersenen van EAE-muizen in vergelijking met hersensecties van naïeve muizen, wat te verwachten is vanwege de regio's waarvan bekend is dat ze B-cellen bevatten in dit model5. In het bijzonder is er een verhoogd tracersignaal in de hersenstam, het cerebellum en de ventrikels van de hersensecties van EAE-muizen. Deze toename van het signaal voor EAE-hersensecties van muizen weerspiegelt wat werd gevonden in de hierboven beschreven PET-kwantificering van het hele brein. Evenzo is er een toename van radiotracerbinding in zowel de cervicale/thoracale als lumbale ruggenmergsegmenten in vergelijking met naïeve ruggenmerg, wat een weerspiegeling is van wat werd gevonden met behulp van ex vivo gammatelling. Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; Vent = ventrikels; Cb = cerebellum; BS = hersenstam; TSc = thoracale en cervicale ruggenmerg gecombineerd; LSc = lumbaal ruggenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Kleuring van CZS-weefsels van naïef en EAE-muizenhersenweefsel met CD45R/B220. B-cellen worden waargenomen in hersenstam, hersenvliezen en witte stof van EAE-muizen (n = 7 EAE, n = 5 naïeve muizen, gemiddeld vier plakjes per dier). Dit cijfer is van 5. Schaalbalken = 5 mm (lage vergroting [1x]) in sagittale hersenbeelden, 100 μm (hoge vergroting [20x]) in hersenstam, hersenvliezen en cerebellaire witte stof. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit artikel beschrijft een gestroomlijnde methode voor het afbeelden van humane CD19+ B-cellen in een muismodel van MS met behulp van CD19-PET. Vanwege de heterogene presentatie van MS en de verschillende reacties op behandelingen, kan het beheer ervan in de kliniek een uitdaging zijn en zijn nieuwe benaderingen voor therapieselectie en monitoring hard nodig. PET-beeldvorming zou kunnen dienen als een krachtig hulpmiddel voor het monitoren van ziekteprogressie en individuele respons op B-celafbrekende therapie. Naast MS kan CD19-PET-beeldvorming worden gebruikt om B-celdepletie na behandeling te monitoren bij subtypes van lymfomen en leukemie of andere B-celgemedieerde ziekten. Dit protocol en representatieve gegevens tonen het nut aan van beeldvorming van B-cellen bij neurologische aandoeningen.
Om menselijke CD19+ B-cellen in de context van MS te bestuderen, kozen we voor het B-celafhankelijke MOG1-125 EAE-model 7. Net als andere EAE-modellen vertoont dit model symptomen van progressieve verlamming en infiltratie van immuuncellen in het CZS. Het MOG1-125-model is echter uniek omdat het een B-celgestuurd model is: muizen bevatten verschillende aantallen B-cellen in de subarachnoïdale ruimte in de hersenvliezen, hersenstam, parenchym en ventrikels. Deze lymfocyten kunnen dun verspreid zijn over deze regio's en/of follikelachtige structuren vormen, die ook worden waargenomen bij mensen met MS 8,9. Naast het gebruik van naïeve muizen als controles, kan een complete inductiekit met alleen adjuvans (CFA) van Freund worden gebruikt (d.w.z. een identieke inductie-emulsie als wat wordt gegeven aan EAE-muizen zonder het MOG-eiwit). In het EAE-muismodel is de bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctioneel en kunnen grotere entiteiten, zoals antilichamen, passeren. De CD19-mAb radiotracer zal alleen binden en in het CZS blijven als er B-cellen aanwezig zijn; de tracer zal terug in de bloedpool circuleren als er geen B-cellen aanwezig zijn. We hebben dit aangetoond met behulp van gammatelling en ex vivo autoradiografie van CZS-weefsels door perfusie voordat de radioactiviteitsniveaus in de weefsels worden gemeten. We hebben dit ook aangetoond in eerdere publicaties over het gebruik van mAb-gebaseerde PET-radiotracers (d.w.z. immunoPET-beeldvormingsbenaderingen) voor het detecteren van B-cellen in het CZS 1,2.
De DOTA-chelator werd gebruikt omdat deze is gebruikt in klinische PET-beeldvorming met koper-64-gelabelde peptiden en antilichamen, en we streven ernaar de hCD19-mAb te vertalen voor klinische beeldvorming van MS-patiënten. DOTA heeft voldoende bindingsaffiniteit met koper-64 in vivo. De in vivo stabiliteit is erg belangrijk omdat vrij 64Cu naar de lever gaat en het signaal van gebonden radiotracer kan verdoezelen; Het is dus belangrijk om het signaal in de lever te meten om het relatieve signaal ten opzichte van andere organen te berekenen. Spieren worden meestal als controleweefsel beschouwd, maar in het geval van EAE kan er een ontsteking in de spieren aanwezig zijn. De halfwaardetijd van 64Cu is 12,7 uur, wat de DOTA-hCD19-mAb voldoende tijd geeft om zich aan zijn doel te binden en ervoor te zorgen dat het signaal door PET kan worden gemeten. Bij de bereiding van het conjugaat moeten kleinschalige (75-125 μg) testreacties worden uitgevoerd om de hoeveelheid DOTA te bepalen die aan mAb moet worden toegevoegd om de gewenste DOTA/mAb-verhouding te produceren (bijv. een reactie van 6-10-voudig overtollig DOTA-NHS-ester per mol mAb kan een conjugaat van 1-2 DOTA/mAb opleveren). De reactietijd en temperatuur (bijv. 2-4 uur of 's nachts bij 4 °C of kamertemperatuur) hebben ook invloed op de DOTA/mAb-verhouding en moeten worden geoptimaliseerd. Een titratie met niet-radioactief koper kan worden uitgevoerd om het aantal DOTA's per mAb te berekenen; we raden echter aan om MALDI-MS en/of LC-MS uit te voeren voor betrouwbaardere en nauwkeurigere resultaten.
De berekende DOTA/mAb-verhouding is een gemiddelde waarde voor een bepaald monster en er wordt enige variatie verwacht. Voor MALDI worden meerdere shots per monster genomen voor de geconjugeerde en ongeconjugeerde mAbs. Vervolgens berekenen we de verhouding tussen geconjugeerd en ongeconjugeerd om het gemiddelde aantal DOTA/mAb te bepalen. De DOTA/mAb-verhouding is belangrijk omdat te veel chelatoren de binding van antilichamen zullen verstoren en te weinig zal leiden tot inconsistente radiolabeling en een laag signaal. De verhouding tussen batches geconjugeerde batches moet zeer dicht bij elkaar liggen om een consistente signaalintensiteit en bindingskinetiek te behouden; Idealiter zou dezelfde partij conjugaat moeten worden gebruikt voor alle experimenten binnen een bepaald onderzoek. Een veelbelovende techniek om mogelijke effecten op de immunoreactiviteit als gevolg van mogelijke overconjugatie te verminderen, is het gebruik van plaatsspecifieke conjugatie10 waarbij de chelatorconjugatie plaatsselectief is op de zware ketenglycanen van het antilichaam, waardoor de toevoeging van 1 chelator per mAb wordt gegarandeerd.
De reactieomstandigheden voor radioactief labelen moeten worden geoptimaliseerd om de hoogste labelefficiëntie en -opbrengst te garanderen, aangezien verschillen in onder andere antilichaam, DOTA/mAb-ratio en 64Cu-molaire activiteit van invloed zijn op radiolabeling. Door gebruik te maken van de optimale 64Cu tot mAb geconjugeerde verhouding kan de radiotracer zonder zuivering worden gebruikt, waardoor de tijd die nodig is voor radiolabeling en verlies als gevolg van de zwaartekrachtstroomkolom en radioactief verval wordt verkort. Een consistente en betrouwbare molaire activiteit kan ook worden bereikt wanneer dezelfde 64Cu tot mAb-geconjugeerde verhouding wordt gebruikt, wat vooral belangrijk is bij het vergelijken van resultaten tussen meerdere cohorten muizen of beeldvormende onderzoeken. De ITLC-voorwaarden kunnen ook worden aangepast aan elke gebruiker. Indien zuivering noodzakelijk is, moet een aliquot worden opgeslagen voor HPLC- en/of UV/Vis-spectrofotometrie, zodat de molaire activiteit kan worden berekend.
Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van radioactief gelabelde antilichamen voor beeldvorming een uitdaging kan zijn. Het is van essentieel belang dat het antilichaam dat voor de radiotracer wordt gebruikt, biologisch inert is om geen fysiologisch effect te hebben. Bovendien, aangezien antilichamen een lange bloedresidentie hebben, moet men lang genoeg wachten op circulatie, binding en klaring van een bepaalde mAb om een geschikt signaal-naar-achtergrond te garanderen zonder afbreuk te doen aan de beeldkwaliteit. Doorgaans is 20-48 uur wachten op een 64 Cu-gelabelde mAb voldoende, maar men moet 2, 4, 6, 12, 24, 48 uur na injectie beelden maken bij het beoordelen van een nieuwe mAb PET-tracer om het beste tijdstip voor beeldvorming in een bepaald knaagdiermodel te bepalen. Hetzelfde geldt voor het verkrijgen van ARG-afbeeldingen met de hoogste signaal-achtergrondverhouding. De representatieve beelden in dit protocol zijn 18-20 uur na injectie genomen, hoewel andere tijdstippen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de gebruikte radio-isotoop. Verschillende antilichamen die binden aan verschillende epitopen van CD19 zullen verschillende resultaten opleveren en moeten rigoureus worden gekarakteriseerd.
Bij het analyseren van het ruggenmergsignaal is het belangrijk om muizen op hun rug in het scanbed te plaatsen om beweging veroorzaakt door ademhaling te verminderen. Bovendien kan plaatsing op de rug helpen de wervelkolom recht te trekken bij muizen met een verhoogde kromming van de wervelkolom als gevolg van de progressie van EAE-ziekte. Een ander belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het detecteren van signalen in de wervelkolom en het ruggenmerg, is het vermijden van het injecteren van MOG1-125 op de flank, aangezien de injectieplaatsen de tracer kunnen binden vanwege de bijbehorende immuunrespons in die gebieden. De nabijheid van de injectieplaats kan de analyse van het ruggenmerg verstoren; Injecties in de borst hebben dus de voorkeur voor de toepassing die hierin wordt beschreven.
De gebruikte beeldanalysetechnieken zijn specifiek voor beeldvorming van het CZS. Een hersenatlastool binnen de beeldanalysesoftware levert reproduceerbare en betrouwbare resultaten op, zolang de registratie van PET en CT nauwkeurig is. Door de semi-geautomatiseerde 3D-hersenatlas te gebruiken en aan te passen aan de schedel van elke muis, kunnen consistente ROI's tussen dieren worden behaald. Aangezien er momenteel geen geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde aanpak is voor het analyseren van het signaal in het ruggenmerg, moeten handmatige ROI's worden opgesteld. Met name bij het kwantificeren van CD19+ B-cellen (of elk celtype dat aanwezig is in zowel het beenmerg als het ruggenmerg), is het van cruciaal belang om het signaal dat afkomstig is van de wervelkolom en het beenmerg zoveel mogelijk te elimineren. De reden hiervoor is dat van naïeve muizen bekend is dat ze meer CD19+ B-cellen in hun beenmerg bevatten dan EAE-muizen, waarbij B-cellen de periferie verlaten om het CZS 5,11 te infiltreren. Dit beenmergsignaal kan het ware signaal in het ruggenmerg verdoezelen.
Om het echte ruggenmergsignaal af te bakenen en tegelijkertijd de bijdrage van het signaal van de wervelkolom en het beenmerg te minimaliseren, kan Otsu-drempel van het CT-beeld worden gebruikt om een onveranderlijke ROI voor de wervelkolom te maken. Een aparte ROI van het ruggenmerg kan dan gemakkelijk binnen de wervelkolom worden getrokken. Dezelfde techniek kan ook worden toegepast om het beenmerg in het dijbeen te meten. Dit is een zeer nuttige methode om inzicht te krijgen in de tracerbinding in het ruggenmerg. Vanwege de relatief lage ruimtelijke resolutie van PET en problemen met betrekking tot het gedeeltelijke volume-effect bij het scannen van kleine anatomische gebieden van muizen, maakt het gebruik van aanvullende ex vivo bevestigingstechnieken (bijv. gammatelling, ARG) de validatie van radiotracerbinding in het ruggenmerg mogelijk zonder de aanwezigheid van bloed, hersenvocht of spillover-signaal van de wervelkolom.
Het signaal in het cervicale/thoracale ruggenmerg heeft de neiging om te variëren in de EAE-muizen, afhankelijk van de ernst van de ziekte en het aantal B-cellen dat infiltreert tijdens de adaptieve immuunrespons. Deze variatie in het aantal B-cellen dat infiltreert, evenals de kleine hoeveelheid B-cellen in het CZS in vergelijking met die in het bekken/ruggenmergmerg van naïeve muizen, kan in vivo kwantificering van ruggenmergweefsel bij muizen een uitdaging maken. Gezien de ruimtelijke resolutie van PET in beeldvorming van kleine dieren, kan het signaal van het beenmerg overlopen op het ruggenmergsignaal. Ex vivo biodistributie en autoradiografie die hier zijn voltooid, helpen bij het valideren van het PET-signaal van de wervels versus ruggenmergweefsel. Muizen worden voorafgaand aan dissectie geperfundeerd om eventuele ongebonden tracers in de bloedpool te verwijderen, zodat de resultaten van gammatelling en autoradiografie de tracer weerspiegelen die daadwerkelijk in elk orgaan is gebonden in plaats van de tracer die zich in de bloedpool in dat orgaan bevindt.
Radiotracers circuleren door het bloed, en met name bij antilichaamtracers is er vaak ongebonden radiotracer in het bloed aanwezig gedurende weken na de eerste injectie. Aangezien we de hersenen en het ruggenmerg in beeld brengen, die veel bloedvaten hebben, is het belangrijk om te begrijpen welk deel van het signaal echt te wijten is aan tracerbinding in de hersenen/weefsel van belang versus dat in de bloedpool. Het is dus noodzakelijk om het hersensignaal te delen door het signaal in de hart/bloedpool. In de klinische setting kunnen dezelfde beeldanalysetechnieken van Otsu-drempel van wervels en ROI's van ruggenmergweefsels worden gebruikt voor kwantificering. Gezien de grotere weefselvolumes bij mensen in vergelijking met muizen, zou er aanzienlijk minder impact moeten zijn van gedeeltelijke volume-effecten, wat leidt tot een verbeterde nauwkeurigheid en de noodzaak van ex-vivotechnieken om in-vivobevindingen te bevestigen, teniet doet. Het gebruik van PET in de kliniek stelt clinici in staat om de therapie voor elke patiënt te personaliseren, afhankelijk van hun individuele B-celbelasting.
ARG is met name nuttig voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie om een nauwkeurigere afbakening mogelijk te maken van de ruimtelijke locatie van tracerbinding in kleine regio's zoals hersenstam en cerebellum. Dezelfde secties en/of aangrenzende secties kunnen worden opgeslagen voor immunohistochemische kleuringen om de aanwezigheid van B-cellen te bevestigen. We hebben eerder CZS-weefsels gekleurd met CD45R/B220 (aanvullende figuur S1) om het aantal B-cellen te correleren met PET- en ARG-signaal 5,9. De kleuring kan vervolgens ruimtelijk worden vergeleken met de ARG-resultaten om te verifiëren dat het radiotracersignaal overeenkomt met het kleuringspatroon. B-cellen kunnen aanwezig zijn in clusters of diffuus door de hersenstam; De PET-gevoeligheid is voldoende hoog om het signaal te meten, wat bemoedigend is voor klinische vertaling. Voor ARG van het ruggenmerg zorgt het verwijderen van het ruggenmerg van de wervels ervoor dat het gemeten signaal het gevolg is van tracerbinding in het ruggenmergweefsel in plaats van het beenmerg en/of bloed, wat PET-beelden kan verdoezelen als gevolg van gedeeltelijke volume-effecten.
Net als ARG maakt ex vivo gammatelling het mogelijk om radioactieve signalen in individuele organen te kwantificeren. Voor deze specifieke techniek is het belangrijk om het natte gewicht van weefsels te meten en ervoor te zorgen dat ze zich op de bodem van hun respectievelijke buizen bevinden voordat de buizen in de gammateller worden geplaatst. De buisjes moeten worden gelabeld met het muisnummer en weefsel, zodat het juiste buisje wordt gebruikt; De buis wordt vervolgens gewogen op een gekalibreerde balans en organen worden ingebracht tot op een tiende van een microgram (0,0001 mg). Sommige weefsels zijn extreem klein en het verschil in de buismassa ervoor en erna zal in de orde van grootte van 0,0001 mg liggen. De weefsels moeten onmiddellijk na dissectie worden gewogen om vochtverlies te voorkomen, wat resulteert in een lagere massa. Na het wegen moeten de hersenen en de ruggenmergbuizen worden gevuld met PBS om te voorkomen dat ze uitdrogen voordat deze weefsels worden ingevroren voor ARG.
Disclosures
Het CD19-antilichaam werd geleverd door Horizon Therapeutics.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de steun van de SCi3-beeldvormingsfaciliteit voor kleine dieren in Stanford en Dr. Frezghi Habte voor zijn technische assistentie met de PET/CT. LC-MS wordt uitgevoerd door het kernpersoneel van de Stanford University Mass Spectrometry (SUMS) kernfaciliteit en we waarderen het personeel voor het leveren van deze service. Wij danken Horizon Therapeutics voor het zeer vriendelijk ter beschikking stellen van de hCD19-mAb en Jodi Karnell in het bijzonder voor haar technische begeleiding en ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter | MiliporeSigma | UFC505008 | centrifugal filter |
| 64Cu-CuCl3 | Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor | ||
| AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
| Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
| Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only |
| Butterfly Needle Catheter | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
| DOTA-NHS-ester | Macrocyclics | B-280 | |
| EAE Induction Kit | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
| Geiger Counter | Ludlum | 14C | |
| GNEXT PET/CT Scanner | Sofie | GNEXT | |
| Hidex Automatic Gamma Counter | Hidex | AMG | |
| HPLC Column | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm |
| Illustra NAP-5 column | Cytiva | 17085301 | DNA gravity column |
| Image J | NIH | ARG analysis software | |
| Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | PI90410 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840281400 | UV-Vis micro/nano-spectrophotometer |
| PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade | Eppendorf | 30124707 | |
| Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
| VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | Desalting column |
References
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).
- Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies. Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107 (2016).
- Stevens, M. Y., et al. Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275 (2020).
- Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Visualized Experiments. (136), e57243 (2018).
- Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein. European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).
- Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor. Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).
- James, M. L., et al. Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).
- Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
- Lyons, J. -A., et al. B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide. European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).
