Summary
この論文では、ヒト特異的抗CD19モノクローナル抗体の放射性標識法と、 in vivo PETイメージング、 ex vivo ガンマカウント、およびオートラジオグラフィーアプローチを用いて、多発性硬化症のマウスモデルの中枢神経系および末梢組織のB細胞を定量する方法について詳しく説明します。
Abstract
多発性硬化症(MS)は、若年成人が罹患する最も一般的な脱髄性中枢神経系(CNS)疾患であり、疾患が進行するにつれて神経学的欠損や障害を引き起こすことがよくあります。Bリンパ球は、多発性硬化症の病理学において複雑かつ重要な役割を担っており、臨床試験においていくつかの治療薬の標的となっています。現在、特定の抗B細胞療法の患者を正確に選択する方法や、これらの治療が中枢神経系および末梢臓器のB細胞負荷に及ぼす影響を非侵襲的に定量化する方法はありません。陽電子放射断層撮影(PET)イメージングは、生体内のB細胞の時空間分布と負荷に関する非常に特異的で定量的な情報を提供する大きな可能性を秘めています。
この論文では、ヒト組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質1-125で誘導されるMS、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の確立されたB細胞駆動マウスモデルにおいて、ヒトCD19 + B細胞に特異的なPETトレーサーを合成および使用する方法を報告します。ここでは、in vivo PETイメージングを用いて、脳および脊髄のCD19+ B細胞を検出および定量するための最適化された技術について説明します。さらに、この論文では、骨髄、脊髄、脾臓などの疾患関連臓器のex vivoガンマカウントの合理化された方法と、CNS組織におけるCD19トレーサー結合の高解像度オートラジオグラフィーについて報告します。
Introduction
多発性硬化症は免疫介在性神経障害です。各患者のユニークな症状は、患者と臨床医の両方にとって管理を困難にする可能性があります1。この疾患自体は、脱髄病変の存在と脳および脊髄における免疫細胞浸潤を特徴とし、身体的および認知的障害をもたらす2。多発性硬化症がT細胞媒介性疾患であるという従来のパラダイムは、B細胞のCD20+サブセットを標的とする治療法であるリツキシマブ3の画期的な第II相臨床試験で初めて挑戦されました。その後、より広い範囲のB細胞に発現する汎B細胞バイオマーカーであるCD194を標的とする追加のB細胞療法が開発されており、診断的にも治療的にも有利です。さらに、治療効果を評価する既存の方法(すなわち、再発回数と磁気共鳴画像法[MRI]活動のモニタリング)では、反応の早期測定ができないため、患者は最適ではない治療法の選択と最適化により、CNS損傷の重大なリスクにさらされます。したがって、中枢神経系およびMS患者の末梢において、CD19+ B細胞などの特定の免疫細胞をリアルタイムで監視する戦略が決定的に必要とされています。
PETイメージングは、CD19などの特定の標的を in vivoで 全身に可視化できる堅牢なイメージング技術です。採血、再発率の記録、MRI による 病変モニタリングは、治療効果のスナップショットを提供しますが、PETイメージングにより、研究者や臨床医は全身で治療の有効性を監視できます。治療モニタリングに対するこの積極的なアプローチにより、臨床医は投薬効果をリアルタイムで評価し、必要に応じて迅速な調整が可能になります。疾患に関連する細胞集団の位置と密度をモニタリングすることで、患者固有の解剖学的情報を使用して重症度の縦断的評価も可能になります。したがって、臨床および前臨床の現場でPETイメージングの可能性を確実に最大限に引き出すために、再現性のある分析法を確立することが不可欠です。
この論文では、ヒト組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質1-125(MOG1-125)を用いて、ヒトCD19(hCD19)を発現するトランスジェニックマウスで誘導されたMSの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルにおいて、16C4-TM(64 Cu-hCD19-mAb)として知られる64Cu標識抗ヒトCD19モノクローナル抗体(mAb)を用いてCD19+ B細胞のPETイメージング、ex vivoガンマカウント、およびオートラジオグラフィー(ARG)を行う方法(図1)について説明します).また、脳と脊髄における放射性トレーサーの結合を正確かつ再現性よく評価する方法も提供しており、このモデルや他の神経変性モデルでしばしば深刻な影響を受ける病因の重要な部位です。これらの技術は、疾患の病理学におけるB細胞の役割の非侵襲的な研究を可能にし、MSにおける抗B細胞療法の有効性を評価するために臨床的に翻訳される可能性を秘めています。
Protocol
図1:試験デザイン。 この記事の主な手法の概要。(A)マウスを仰向けでスキャニングベッドに置くと、脊椎の動きが軽減されます。(B)マウスのPET/CT画像。(C)動物の背側を切開して脊柱を露出させます。(D)脊柱を頸部/胸部と腰部に二等分し、示された5つの切り傷に続く切片を取り除きます。(E)シリンジを使用して、シリンジと脊柱でシールを作り、図のように脊柱の頭蓋端と尾端から洗い流すことにより、脊柱から脊髄を取り除きます。(F)孤立した頸椎/胸椎および腰椎の脊髄セグメント。略称:PET/CT = 陽電子放射断層撮影法/コンピュータ断層撮影法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
すべての動物実験は、Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International) によって認定されたプログラムであるスタンフォード大学の実験動物ケアに関する管理委員会 (APLAC) に従って実施されました。ストレスはEAE誘導に影響を与える可能性があるため、マウスへのストレスを最小限に抑えるために、マウスは研究開始の少なくとも7日前からビバリウムに順応しました。
1. 雌性ヒト化CD19マウスにおけるEAE誘導
- MOG1-125を用いて、前述のようにEAEを投与した9〜13週齢のヒト化CD19 C57BL / 6J雌マウスを誘導する。
2. EAEマウスモデルにおける動物のケアとスコアリング
- 前述のように、病気の進行とマウスのケアをスコアリングします5.簡単に言うと、このモデルを 1 から 5 のスケールでスコアリングします: 1 は尾の脱力/ぐったり、2 は後肢の弱体化、3 は後肢の麻痺、4 は前肢の脱力を伴う後肢の麻痺、5 は瀕死の状態です。
3. モノクローナル抗体の結合、放射性標識、特性評価
- 二官能性キレート剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸モノ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(DOTA-NHS-エステル)をhCD19-mAbに 64Cuで放射性標識に結合します。
- 脱塩カラムを使用して、hCD19-mAb保存バッファーをHEPESバッファー(pH 8.5-9)と交換し、脱塩カラムをHEPESでコンディショニングします。脱塩カラムのサンプル容量と必要なモノクローナル抗体の量に基づいて、必要なカラム数を計算します:0.5 mLチューブ:30〜130 μLのサンプル量、300 μLの洗浄液。2 mLチューブ:サンプル量200〜700 μL、洗浄液1 mL。
- 遠心分離機を4°Cに冷却し、脱塩カラム を介して バッファーを交換します。
- 冷蔵庫から脱塩カラムを取り出します。脱塩カラムの底部を取り外し、キャップを緩め、カラムをコレクションチューブに入れます。
- 1,500 × g で2分間遠心分離し、保存溶液を除去します。保存溶液を含むフロースルーを廃棄し、収集チューブを再利用します。脱塩圧縮樹脂の最高点が上向きに傾いている線をカラムに印をつけます。
- 脱塩カラムの下側にHEPESバッファーを添加します。脱塩カラムをラインを外側に向けて遠心分離機に入れます。1,500 × g で2分間泳いでいます。フロースルーを廃棄し、コレクションチューブを再利用します。
- 手順3.1.4と3.1.5を同じコレクションチューブを使用して2回繰り返し、ステップ間のフロースルーを破棄します。
- コンディショニングした脱塩カラムを新しいコレクションチューブとラベルに入れます。このチューブには hCD19-mAb が含まれます。
- hCD19-mAb をコンディショニング脱塩カラムの上部に添加し、HEPES バッファーを使用して空のモノクローナル抗体バイアルをすすぎます。これを脱塩カラムの上部に追加します(メーカーの推奨による総量)。1,500 × g で 2 分間遠心し、hCD19-mAb を溶出します。hCD19-mAbを含むフロースルーを保管してください。
- hCD19-mAbの濃度をUV/Vis分光光度計で測定し、必要に応じてHEPES緩衝液で0.5 μg/μLに調整します。
- hCD19-mAb溶液に、モノクローナル抗体溶液の体積の1/50の0.5 M EDTAを加えて、hCD19-mAb溶液中のEDTAの最終濃度を0.01 Mにします。hCD19-mAb-EDTA溶液を室温で15分間静置します。
- DOTA-NHS-エステルを冷凍庫から取り出し、室温に戻します(10〜15分)。DOTA-NHS-エステルに添加するDMSOの体積を計算して、目的のDOTA/mAbモル比(通常は1〜2 DOTA/mAbのオーダー)を添加できるDOTA濃度を作成します。
注:hCD19-mAb に添加する DMSO-DOTA-NHS-エステルの量は、モノクローナル抗体の容量の 10% を超えてはなりません。これは、スプレッドシートを使用して実行し、すばやく繰り返し実行できるようにする必要があります。 - hCD19-mAb に対する DOTA の所望の比率に基づいて、hCD19-mAb に添加する DOTA-NHS-エステルの量を計算します。
nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg の DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL の DMSO → DOTA/DMSO 溶液の希釈係数 - 1〜2 mgのDOTA-NHS-エステルを秤量し、正しい量(ステップ3.1.11で計算)のDMSOをDOTA-NHS-エステルに慎重に加えます。ミックスしてスピンダウンします。
- 計算した量のDOTA-NHS-エステル溶液(ステップ3.1.12)をhCD19-mAb溶液にピペットで移します。添加前にピペットチップの外側を拭き、余分なDOTA-NHS-エステルが添加されていないことを確認します(ピペット内の量を変更せずに)。静かに混ぜてスピンダウンします。
- 冷蔵庫(4°C)に入れて一晩(12〜16時間)反応させます。
- 精製と濃縮
- 遠心分離機を4°Cに冷却し、遠心濃縮器の緩衝液交換ステップを行います。金属製のPCRチューブブロックをドライアイスの上に置き、コンジュゲートを急速凍結します。
- DOTA-hCD19-mAb反応液を冷蔵庫から取り出し、生物学的グレードのTRISバッファー(総反応量の10%)を添加してクエンチします。質量分析のために10〜20μgのサンプルを除去します。
- 0.1 M酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.5)を使用して、上記のように脱塩カラムをコンディショニングします(ステップ3.1.1-3.1.5)。
- DOTA-hCD19-mAb溶液を酢酸アンモニウムに緩衝液交換します(ステップ3.1.1-3.1.8)。
- DOTA-hCD19-mAb溶液の濃縮:メーカーの推奨容量に従って、分子量50 kDaのカットオフ遠心濃縮装置に溶液を添加します。4,000 × g で10分間(または容量が80%〜90%減少するまで)遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- さらに9回(合計10回)繰り返します:容量を最大推奨容量に戻すのに十分な酢酸アンモニウムを追加します。
注:合計は、カラムに残っているものを含め、最初に添加したもの(容量500 μLの遠心濃縮機では通常400〜450 μL)である必要があります。- 反応バイアルを酢酸アンモニウム緩衝液ですすぎ、残留DOTA-hCD19-mAbを回収します。遠心濃縮機に洗浄液を追加します。
- 4,000 × g で10分間遠心分離します。
注:より短い時間でボリュームが80%〜90%に減少すると、後続のスピンでスピン時間が短縮される場合があります。
- 遠心濃縮機からタンパク質溶液を取り出します。DOTA-hCD19-mAbの総容量に注意してください。
- 遠心濃縮装置 2 に、総容量 100 μL になるのに十分な酢酸アンモニウムバッファーを加え、ピペットで混合します。遠心濃縮カラムにキャップをして反転させます。4,000 × g で2分間スピンし、溶液を回収します。新しいチューブに移します。
- 遠心濃縮器500において、ピペットを使用して遠心濃縮器からモノクローナル抗体溶液を回収し、新しいチューブに追加します。
- 紫外可視分光光度計を使用して濃度を測定します。濃度が2 mg/mLを超える場合は、酢酸アンモニウムで2 mg/mLに希釈します。
- PCRチューブあたり100μg(約50μL)を分注します。チューブにDOTA-hCD19-mAb、日付、質量、濃度を標識します。バイアルを回転させます。
- DOTA-hCD19-mAb をドライアイス上で冷やした PCR ブロックで急速凍結します (またはドライアイス上で凍結します)。すべてのサンプルが凍結したら、-80°Cの冷凍庫に入れます。
- 質量分析により、hCD19-mAbあたりのDOTA数を測定します。各コンジュゲーションから非コンジュゲート(純粋)抗体のサンプルを採取して、比率を計算します。以下に示す式(1)を使用します。分子量はMWと略される。
(1)
- 放射性標識
注意: 施設の規制に従って、白衣、手袋、個人体線量計、リング線量計など、放射能を取り扱うための適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。放射能汚染防止のため、定期的に手袋の調査と交換を行ってください。鉛遮蔽を使用し、可能であればトングで取り扱って放射性源からの距離を広げてください。- ピペットを使用して、輸送用バイアルから新しいバイアルに放射能を移します。放射能を測定します。
- 最初の放射性標識反応のアリコートを除去します。 64Cu-CuCl3 の 1 mCi あたり 50 μL の酢酸アンモニウム (pH 5.5) を添加します。5.5 を捕捉する範囲の pH ストリップに 1 μL をピペッティングし、5 と 6 を区別するのに十分な分離能で pH を測定します。
- pHが4〜5.5でない場合は、1 M NaOHまたは0.1 M HClを使用して変更します。 pHが4未満の場合は1〜5 μL、pHが5.5を超える場合は0.1 M HClを、正しいpHに達するまで少量の1〜5 M NaOHを追加します。添加するたびに、よく混合し、スピンダウンし、上記のようにpHを測定します。溶液の添加と除去(pHの確認を含む)ごとにメモして、最終的な容量を計算できるようにします。
- 最適な pH が得られたら、 64Cu-CuCl3 の 1 mCi あたり 10 μg の DOTA-hCD19-mAb を添加します。穏やかに混ぜ、軽く回転させます。
- 反応バイアルを37°C、毎分400回転(rpm)に設定されたサーモミキサーに置きます。
- 30分後、反応を急冷します:総反応容量を50で割り、その容量の0.5 M EDTAを反応混合物に加えます。
- インスタント薄層クロマトグラフィー(ITLC)を使用して標識効率を測定し、溶液中の結合銅と遊離銅の割合を測定します。
- TLC紙を1cm幅にカットします。ストリップの上下から 1 cm のところに印を付け、移動相が 0.1 M クエン酸の 1 cm 未満のチューブ(50 mL コニカルフラスコ)を準備します(チューブに入れる場合、移動相のレベルはストリップの 1 cm マーク未満である必要があります)。
- 反応液1μLを底部1cmのマーク(溶媒前面)のストリップにピペットで移し、ストリップをチューブに入れます。溶剤の前面が上部1cmのマークに達するまで観察し、ストリップを取り外し、ラップで包みます。
- ストリップをプラットフォームに置き、無線TLCイメージングスキャナーに通します。放射性標識モノクローナル抗体が起点にあり、移動相フロントとともに移動する遊離 64Cu を探します(図 2)。遊離銅の割合が5%未満(標識効率95%)の場合は、動物への注入に進みます。遊離銅の割合が5%を超える場合は、精製に進みます。
注:遊離銅の割合は、通常、DOTA-mAb と 64Cu の比率、反応時間、pH、および温度によって異なります。反応条件は、一貫した結果が得られるように、新しいモノクローナル抗体ごとにユーザーごとに最適化する必要があります。
- ディスポーザブルDNAグレードの重力カラム による 精製
- ディスポーザブルDNAグレードの重力フローカラム(脱塩/バッファー交換カラム)は、メーカーの指示に従ってコンディショニングします。使い捨てDNAグレードの重力カラムを、適切な鉛シールドの後ろにあるリングスタンドまたはその他の機器に置きます。装置が安定していて、簡単に移動できることを確認してください。チューブをカラムの下に置きます。
- 粗反応混合物を重力流塔樹脂にピペットで移します。すべての液体が樹脂に流れ込むまで待ちます。全容量(粗精製物とPBS)を500 μLにするのに十分なPBSをピペットで吸い上げます。 フロースルーを廃棄します。
- 1-10とラベル付けされた1.5 mLの遠心チューブの上にカラムを置きます。1 mL の PBS をカラムに加えます。流れが止まるまで、各チューブに5滴ずつ集めます。
注:必要なチューブは10本未満です。 - カラムの底にキャップをして、残留放射能を測定します。各バイアルをフロースルーで測定します。50 μCi を超えるバイアルごとに、ステップ 3.3.7 に従って ITLC を調製し、各フラクションの銅バウンド率を測定します。
注:最初の 1 つまたは 2 つのフラクションには移動相のみが含まれます。放射性標識モノクローナル抗体が最初に溶出し(通常はフラクション 2、3 からフラクション 5、6)、遊離 64Cu が最後に溶出します(一部はカラムに付着します)。パーセントバウンド 64Cuは、分数間で異なる場合があります。 - 結合率が95%を超える(遊離銅が5%未満)画分を結合します。注射液に使用してください。必要に応じて、サイズ排除HPLCを実施して放射性標識5 を確認し、モル活性を計算します。アリコートを保存して、10半減期(127時間または5.3日)後にUV-Vis分光光度計で濃度を測定します。
(1)4.用量の準備
注:用量を取り扱う前に、白衣、体線量計、指線量計、手袋など、適切なPPEを着用してください。.
- PETスキャンの18〜24時間前に 64Cu-DOTA-hCD19-mAbを注入して、体内の放射性トレーサーを適切に循環させます。
- 64Cu-DOTA-hCD19-mAb の入った鉛容器を直ちに鉛シールドの後ろに置きます。ガイガーカウンターをオンにして、潜在的な汚染を監視します。
注意: 放射性物質を取り扱うときは、手袋を頻繁に交換してください。線量を描画している間は、迅速な手袋交換を容易にするために二重手袋を着用することをお勧めします。.汚染された鋭利物やゴミは、常に指定されたシールドされたゴミ箱エリアに置いてください。 - 64Cu-DOTA-hCD19-mAb を低結合 1.5 mL プラスチック遠心チューブで適切な濃度に希釈します。
注: 64Cu-DOTA-hCD19-mAbは、低結合でない場合、プラスチックに結合します。 64名Cuはガラスに結合します。- 放射性トレーサーを生理食塩水で希釈して、放射線分解を防ぎ、一貫した用量の描画を簡素化します。
- 可能であれば、100μLに75〜150μCiを投与する用量を準備します。.最大総注入量がマウスの体重の10%を超えないようにしてください。.
- 500 μL(50 cc)のインスリン注射器を使用して、低結合プラスチックチューブから用量を引き出します。シリンジは静脈内注射されるため、気泡がないことを確認してください。.
- シリンジには、対応する動物番号を事前にラベル付けします。
- 線量活性と時間を実験ノートに記録し、データ分析に役立てます。
- 麻酔下の時間を短縮するために、動物がカテーテル挿入されたらすぐに注射の準備をしてください。.
- 線量が調製されたら、スキャン用の標準試料(ファントム)を準備して校正係数を生成します。
- 15 mLのコニカルチューブに、水(またはPBS)で希釈した50〜75 μCiの活性を充填します。
注意: 溶液を完全に混合してください。標準は、ラベリングから残った 64Cuを解放することができます。- 標準試料の活動量を測定し、時間を記録します。
- 15 mLのコニカルチューブに、水(またはPBS)で希釈した50〜75 μCiの活性を充填します。
5. カニューレ挿入と注射
注:放射性トレーサー6の注射のためのマウスの静脈内カニューレ挿入については、前述の方法6を参照してください。
- 放射性トレーサー投与の準備として、1.5〜3%イソフルランで満たされたノックダウンボックスでマウスを麻酔する前に、セクション2.1に記載されているようにマウスの疾患の重症度を計量し、スコアを付けます。.
注:これらのマウスは、前述のPETスキャナーではなく、ベンチトップに注射されます。マウスはカニューレ挿入と注射の間を移動しないため、注射のためにカテーテルを接着する必要はありません。 - マウスにカニューレを挿入したら、針をカテーテルの端に挿入し、ゆっくりと注入します。注射後、カテーテルを通して少量の生理食塩水を洗い流して、全用量が注入されるようにします。
注:容量は、カテーテルのデッドボリューム(著者が使用したカテーテルでは50μL)とほぼ同じである必要があります。- 実験室用ワイプを注入して、放射性トレーサーの滴りを収集します。残量を測定する際にはこれを含めてください。
- ラボノートに注入時間を記録します。
- 注射後すぐにカニューレを抜去します。用量キャリブレーターを使用してカニューレ、線量注射器、および組織を測定し、マウスに注射されなかった残留線量を決定します。
- アクティビティと時間をラボノートに記録します。
- マウスを注射した後、マウスが放射性であることを示すケージカードでケージにラベルを付けます。施設のガイドラインに従ってケージを記録し、記録します。次に、指定された放射性物質保持エリアにマウスを置きます。
6. PET/CTイメージング
- 64 Cu-DOTA-hCD19-mAb の注入後 18 時間から 24時間後に PET イメージングを実行します。スキャンする前にマウスの重量を量り、スコアリングします。
注意: スキャナーの操作手順は、使用しているスキャナーによって異なります。- PET/CTスキャナーのX線コンポーネントがウォームアップされ、取得の準備ができていることを確認します。
- パソコンでPETスキャナー取得ソフトウェアを開きます。
- [治験責任医師ログイン]ドロップダウンメニューから、適切なラボ情報をクリックします。
- [プロジェクト] ページで、新しいプロジェクトを作成するか、ドロップダウン メニューから既存のプロジェクトを選択します。
- 初期化プロンプトが画面に自動的に表示されたら、[ホームベッド]をクリックして、ベッドが帰宅するのを待ちます。次に、Warm up CTをクリックします。
- CTがウォームアップできるように、CTシールドドアが閉じていることを確認してください。
- スキャナーがウォームアップしている間に、EAEマウスにスコアを付け、水分補給のために脇腹に0.2〜0.4 mLの温かい生理食塩水を皮下に注射します。
- スキャナーがウォームアップされたら、コンピューターに戻り、研究のPETスキャンを設定します。
注:これらは、スキャン日の前に設定できます。- [Recent Studies] ヘッダーで、[Create New Study] をクリックします。試験名、プロトコル、化合物、および被験者情報を記入します。
- PET/CTを実行する場合は、最初に PET プロトコルを選択し、次に CTプロトコルを選択します。
メモ:通常、EAEマウスモデルのスキャンには標準CTで十分です。CTスキャンは1分間で、電圧80kVp、電流150μA、720投影で2 x 2のビニングで取得されます。CT画像は、修正フェルドカンプアルゴリズムを使用して再構成されます。 - PETプロトコルの場合は、10〜15分の静的64銅線スキャンを選択します。このスキャンが使用可能なプロトコルのリストにまだない場合は、[標準]メニューの[プロトコル]タブをクリックし、[新しいプロトコルの作成]をクリックして追加します。[同位体]ドロップダウンメニュー。目的の同位体がリストにない場合は、[その他]をクリックします。ライブラリから追加し、目的の同位体を追加します。スキャン期間を定義し、静的スキャンのラジオボタンをクリックし、プロトコルに名前を付けて、[保存]をクリックします。
- [調査]タブに戻り、その日に必要なすべてのスキャンに名前を付けて設定し続けます。
注意: また、標準CTのみを使用して1回の「CTテスト」スキャンを設定し、最初のスキャンのベッド位置を確認して、最適な配置を確保することをお勧めします。これは、調査の最初のスキャン実行である必要があります。
- PET/CTを実行する場合は、最初に PET プロトコルを選択し、次に CTプロトコルを選択します。
- [Recent Studies] ヘッダーで、[Create New Study] をクリックします。試験名、プロトコル、化合物、および被験者情報を記入します。
- スキャナーの準備ができたら、ノックダウンボックスでマウスに麻酔をかけ、スキャンの準備をします。
注:この段階では、マウスは非常に病気である可能性があります。麻酔下の時間を最小限に抑えることがベストプラクティスです。- アイジェルを塗ります。
- 4匹のマウスを装着できるスキャニングベッドに、イソフルランを1.5%〜2%に設定し、加熱パッドをオンにした状態で、加熱パッドや加熱空気などの発熱体が装備されていることを確認します(図3)。マウスをスキャニングベッドの上で仰臥位に置きます。
- EAE疾患が進行すると、マウスの脊椎はひどく湾曲します。マウスが仰向けになった状態でスキャンして、背骨をできるだけまっすぐにし、下流の分析を改善します。背骨をまっすぐにするために、マウスの尾をそっと引っ張ります。
- 仰臥位になったら、柔らかい顕微鏡テープで各マウスを所定の位置にしっかりと固定します。1枚のテープを頭に、もう1枚を腹部にそっと貼って、呼吸による動きを最小限に抑えます。
- どのマウスがどのスキャン位置にあるかを実験ノートに記録します。
- マウスが固定されたら、スキャンコンピュータに戻り、スキャナーを操作します。
- モーション コントローラー メニューを開きます。PETセンターFOVをクリックして、スキャンベッド上のマウスをPETリングに移動します。その日の最初のスキャンでは、CTセンターFOVをクリックします。所定の位置に配置されたら、CTテストスキャンを実行して、位置が正しいことを確認します。ベッドの位置が満足のいくものになるまで繰り返します。
- スキャニングベッドに小さな白いテープを貼って、研究の残りの部分の正しいベッド配置をマークします。
- PETスキャン用のベッドが設置されたら、[ 実行]をクリックしてスキャンシーケンスを開始します。
- スキャナーがPETリングからCTに自動的に移動するのを待ちます。
- PETとCTの両方で、動物が適切な位置に移動しているかどうかを常に目視で確認してください。
- スキャン開始時刻を実験ノートに記録し、データ解析中に注入した用量の減衰補正を行います。
- スキャンが完了したら、イメージを再構築します。動物を駆除する前にデータを確認してください。
注:3D順序サブセットの期待値最大化(OSEM)の再構成には、静的スキャンに約5分かかります。 - この組織には多数のB細胞が含まれているため、脾臓をポジティブコントロールとして使用して、データを視覚的に確認して承認します。動物をスキャニングベッドから取り出し、灌流とその後の解剖に備えて、イソフルランを充填したノックダウンボックスに入れます。
- 研究の残りのマウスについて、手順6.5〜6.12を繰り返します。
- すべてのマウスをスキャンする場合、またはスキャンベッドに空き場所があるグループをスキャンする場合は、手順4.6で準備した標準をスキャンします。
7. ex vivo ガンマカウントとオートラジオグラフィーのための解剖
- 解剖する前に、すべてのガンマ計数チューブと遠心分離チューブが事前に計量されていることを確認してください。
- マウスに深く麻酔をかけている間に、前述の6ように、PBSと開胸術による灌流による安楽死を行います(4%イソフルラン、2L / min、100%O2の連続吸入)。
- 骨髄を切除するには、膝と骨盤の両方の大腿骨を切断します。両方の頭が大腿骨から取り外されていることを確認してください。
- 両方の大腿骨を、底に穴が開いた0.5 mLの遠心チューブに入れ(20 Gの針を使用)、蓋を切り取ります。
- 大腿骨を含む0.5 mLチューブを、蓋を切った状態で1.5 mL遠心チューブに入れます。
- チューブセットアップ全体をミニ遠心分離機に入れます。4,500 × gで4分間回転させます。
注:骨髄は、0.5 mL遠心チューブの穴から取り除き、1.5 mL遠心チューブの底に落ち着く必要があります。- チューブを分離します。0.5 mL遠心チューブで空の大腿骨の重量を量ります。1.5 mL遠心チューブで骨髄の重量を量ります。各遠心分離管をガンマ計数管に入れます。
- 鉗子とハサミを使用して脳を切除し、脳幹を無傷に保つように注意します。脳をガンマカウントチューブに入れます。乾燥重量を記録し、PBSで洗い流し、カウントの準備が整うまで氷の上に置いておきます。
- 脊髄を切除するには、次の手順を実行します。
- 動物の背側を切開して脊柱を露出させ、皮膚と毛皮を取り除きます(図1)。
- 脊柱の周りと脊柱を通る3つの横面に沿って切断することにより、腰椎(L)を頸部(C)および胸部領域から分離します:首の付け根(C1椎骨)(図1D、番号1)。胸郭の基部(L1椎骨)(図1D、番号2)。骨盤の基部(L5椎骨)(図1D、番号3)。
- 胸郭の下に切り込みを入れます(図1D、番号2)。
- 仙骨の真上を切って、腰椎領域を分離します。腰椎脊髄が見えるまで、骨盤端から脊柱を慎重にトリミングします(図1D、番号3)。脊柱の腰椎および頸部/胸部領域を分離するために、周囲の組織を切り取ります(図1D、番号4および5)。
- 脊髄を排出するには、PBSで満たされたスリップチップシリンジ(3〜10 mL)を使用します。.親指と人差し指を使用して、シリンジと脊柱の間にシールを作成します。
- PBSをシリンジにそっと通し、脊髄を吸収パッドに排出します(図1E)。両方の脊椎領域について繰り返します。脊髄組織をガンマカウントチューブに入れます。
- 乾燥重量を記録し、PBSを添加して、乾燥を防ぐために組織がチューブの底にあることを確認します。カウントの準備ができるまでチューブを氷の上に置きます。
- 頭蓋端から頸椎/胸椎を排出し、脊柱の尾端から腰椎脊髄を排出します(図1E)。
8. Ex vivo ガンマカウンティング
- ガンマカウンターソフトウェアを開きます。作業リストに移動し、 64Cu の 30 秒カウントプロトコルなど、目的のプロトコルを選択します。
- 別々のチューブに少なくとも 3 つの標準試料を調製します。解析で使用するために、ここで実行します(ステップ10.2)。3つの別々のチューブで3つの反復量と活性量を作ることを目指します。
注:500 μLの容量で良好な結果が得られます。活性は使用するマシンによって決まりますが、一般的には10 μCiが適切です。 - 標準試料を、実行するプロトコルに対応するバーコードがラベル付けされたラックに入れます。ラックをガンマカウンターに置きます。
- 臓器の重量を記録した後、臓器の入ったチューブをガンマカウントラックの標準物質の入ったチューブの後に置きます。
注:このモデルの対象となる臓器には、軸性リンパ節、血液、骨髄、脳、頸部リンパ節、大腿骨、心臓、肝臓、腰椎脊髄、筋肉、脾臓、尾部、および頸部/胸部脊髄が含まれます。 - ガンマカウンターの後ろにストップバーコード付きのラックを置きます。
- コンピューターの 再生 ボタンを押します。可能であれば、すべてのチューブを1つのファイルに連続的にカウントできるように、複数のラックまたはオルガンが実行されるまで 再生 を押さないでください。停止バーコード付きのラックが、実行ごとにガンマカウンターの背面にあることを確認します。
- すべてのサンプルがカウントされるまで実行します。ファイルを保存してエクスポートします。
9.中枢神経系組織の Ex vivo オートラジオグラフィー(ARG)
- 脳と脊髄の両方のARGについて、以前に発表された手順に従います(ただし、マウスにはPETスキャンから放射性トレーサーがすでに注射されているため、Chaneyらによって記述された手順2〜6は除外されます)6。
注:脊髄ARGカセットを準備するための具体的な手順は、ここにリストされています6. - 腰椎および頸椎/胸部脊髄のガンマカウントが完了したら、すべてのCNS組織がカウントされるまで、すぐにチューブを氷上に置きます。
注:脳6のARGについては、以前に公開された方法を参照してください。 - チューブをそっと傾けて、脊髄が吸収パッドに落ちるようにします。脊髄がチューブの側面にくっついている場合は、冷たいPBSで静かに洗い流し、チューブを再び傾けます。ラボティッシュでやさしく吸い取り、各脊髄を慎重に乾かします。乾燥した脊髄を厚手の黒い紙の上に整理整頓して置きます。
- 脊髄の横に白いペンでラベルを付け、簡単に識別できるようにします。
- 黒い紙の角と中央にスペースを残して、ARGカセットを閉じたときに脊髄が圧迫されるのを防ぐためのスペーサーとして機能する3枚の顕微鏡スライドのスタックを配置します。5〜7スタックを使用します。
- すべての腰椎と頸椎/胸部の脊髄を黒い紙の上に置き、ラベルを付けたら、紙片をARGカセットに慎重に置きます。開いたカセットをドライアイスのトレイに置き、脊髄を凍結します。
- 凍結したら、デジタル蛍光体保存スクリーンと脊髄の間にラップをそっと置き、サンプルの上にスクリーンを置きます。すぐにカセットを閉じ、-20°Cの冷凍庫に約10半減期(~127時間)入れます。
- 露光時間が完了したら、蛍光体イメージャーを使用してフィルムをスキャンします。結果のデジタル画像を分析します(手順についてはセクション12を参照してください)。
10. 生体内分布データの解析
- 放射性崩壊の時間補正を数学的に決定するための「線量補正」スプレッドシートを設定することで、放射線量を正規化し、被験者間の比較を可能にします。
- 注射後にシリンジとカテーテルに残った残留活性を考慮して、すべての用量を注射時間まで減衰補正します。.
- ステップ 8.2 で調製した標準試料を用いて、活性量(μCi)と正規化カウント/分(CPM)を平均します。平均CPMを平均標準アクティビティ量で割って、CPM/μCiを求めます。
注:各標準試料の活性量が、ガンマカウンターが標準試料の CPM をカウントする時間まで減衰補正されていることを確認します。ガンマカウンターは、すべてのCPM値をプロトコルの開始時刻に正規化する必要があります。
- 「結果」スプレッドシートを設定して、各サンプルの組織グラムあたりの最終的な注入量の割合(%ID/g)を計算します。
- カウントされた各サンプルのガンマカウンターから動物の注入時間まで、正規化されたCPMを減衰補正します。
注:減衰補正は任意の時点にすることができます。すべての用量とCPM値が同じ時点に減衰補正されていることを確認します。 - 減衰補正されたCPMを各サンプルの質量に正規化して、サンプルあたりのCPMを決定します。計算された挿入 CPM から末尾の CPM を差し引いて、注入された合計 CPM を計算します。
注:このCPM値は、注入による静脈外トレーサーを考慮して、注入された合計CPMから差し引かれるだけなので、テールを質量補正する必要はありません。 - 質量あたりの CPM を注入された合計 CPM で割って、%ID/g を計算します。
- カウントされた各サンプルのガンマカウンターから動物の注入時間まで、正規化されたCPMを減衰補正します。
- 「サマリー」スプレッドシートを設定して、グラフ作成ソフトウェアへの入力と、その後のデータの視覚化と統計分析のための最終結果を表示します。
11. PET画像解析
- PET解析ソフトウェアを開きます。ファイルをリックする |ローカルデータを開く |DICOMです。目的のファイル(DICOM形式)を見つけます。PETとCTの両方を開きます。
- データマネージャで、PETとCTのコントラストを希望のレベルに調整します。
- 個々のマウスを登録してトリミングします。
- ナビゲーション・メニューで、「方向変更/登録」タブを選択します。
- このタブ内の [リジッド ]メニューに移動します。 CT スキャン(0)を 固定 スキャン、 PETスキャン(1) を ムービング スキャンに指定します。
- リジッド変換(Rigid Transformation)と高速品質(Fast Quality)を選択します。「登録」をクリックします。
- 登録が完了したら(5〜10分)、 チェック マークをクリックして登録を保存します。
- データを目視検査して、登録が成功したことを確認します。セッションをエクスポートするには、[ ファイル] |セッション |[エクスポート] をクリックします。
- 次に、各マウスを全身の切り抜きで切り抜きます: ナビゲーション メニューに移動し、[ 切り抜き]をクリックします。各断面の側面を外側のエッジから内側にドラッグします。
- 目的のマウスがしっかりとトリミングされたら、 チェック マークをクリックし、セッションをエクスポートして保存します。
- 次に、Registration/Reorientation(レジストレーション/方向変更)メニューの手動のTranslation(移動)、Rotations(回転)、Flips(反転)を使用して、脳分析のために各マウスの頭を切り抜き、まっすぐにします。エクスポートして保存します。
- 脊髄を分析します。
- 脊髄の関心領域 (ROI) の解析を開始するには、ナビゲーション メニューから 3D ROI ツールを開きます。
- ROI ヘッダーの下で、メニューの下部にあるプラス記号を使用して、腰椎 ROI、頸椎/胸部 ROI、腰椎骨格、胸部骨格、腰椎脊髄、胸部脊髄の 6 つの ROI を作成します。
注:腰椎および頸椎/胸部のROIは、骨格ROIの作成に使用される一般化された大きなROIです(図4)。 - この手順でPET信号からの視覚的な干渉を回避するには、 F3 をクリックしてPETをオフにします。
- 3D ROIツールオペレーターの上部に移動します。カーソル記号の右側にある実線の点をクリックして、3D Paint Mode(3Dペイントモード)とErode/Dilate(侵食/拡張)メニューを開きます。
- [球体] を選択し、サイズを 20 ピクセルに変更します。[Dilate] を +5 に設定します。
- 先に進む前に、 メニューの下部に移動してください。Lumbar ROIは最初に描画されるため、 Lumbar ROI が選択されていることを確認します。
- CTで、脊柱のL6椎骨(脊椎が股関節と出会う場所)を見つけます。L6より上の1つの椎骨から始めて、股関節の上の5つの椎骨(L1-L5椎骨)に大まかなROI腰 椎ROI を描きます。次に、 頸椎/胸部ROI に切り替えて、脊椎の残りの部分を頭蓋骨の基部までトレースします。
注:これは、手順11.4.8でOtsuしきい値が発生する場所を示すために使用されるため、正確である必要はありません。 - 一般化された ROI を描画した後、 演算子の上部に移動します。「 セグメンテーションアルゴリズム 」メニューを選択します。
- ドロップダウンメニューから、[ Otsu Thresholding]を選択します。入力に Lumbar ROIを選択します。メニューの下部で、 腰椎スケルトン が選択されていることを確認します。 [画像]の横のドロップダウンメニューで、 CTスキャン が選択されていることを確認し、[ 適用]をクリックします。 頸椎/胸部ROI と 胸部骨格について繰り返します。
- Otsu Thresholding(大津閾値)で脊柱が十分にハイライトされない場合は、 Global Thresholding(グローバル閾値) を使用し、手動閾値設定の 最小 値を 350 に、 最大 値を 3,500 に変更し、必要に応じて調整して椎骨を分離します。
- Otsu Thresholding を使用してスケルトン ROI を作成した後、ナビゲーション メニュー (カーソル アイコン) に戻ります。大まかな腰椎と頸椎/胸部の両方のROIのH(非表示)列を削除するかチェックマークを付けて非表示にします。両方のスケルトンROIのI(不変)列にチェックマークを付けて、編集できないようにします。
- 最後に、 3D ROI ツール オペレータ の上部に戻り、[ 3D ペイント]メニュー に移動して脊 髄 ROI を描画します。
- スフィアツールを再度選択し、腰椎と胸部の両方の骨格内の脊髄をトレースし、メニューの下部で正しいROIが選択されていることを確認します。
- ROIを 消去 するには、 Command/Control をクリックし、消去する部分に描画します。
- 3 つの平面すべてから脊髄 ROI をチェックして、脊柱の外側に ROI が描画されていないことを確認します。
- 脊髄解析結果をエクスポートします。
- 手順11.4.3でPET信号がオフになった場合は、脊髄ROIが描画された後に F3 を押してPETをオンに戻すか、 ビジュアルコントローラー(VC) を選択して PETバーをクリックします。
- ナビゲーションメニュー(カーソルアイコン)に戻ります。グリッドアイコンをクリックしてテーブルを表示します。表を表計算ソフトにコピーして保存します。
- 最後に、上記のようにPET解析ソフトウェアでファイルをエクスポートし、描画したROIを保存します。
- 半自動の3Dアトラスを使用して脳を分析します。
- ヘッドクロップファイルを開きます。マウスの脳アトラスをインポートするには、 Advanced Modules メニューから 3D Brain Atlas Tool を選択します。 参照 が CT に設定され、 切り抜き オプションが オフになっていることを確認します。出力ディレクトリの 経路を設定します 。
- [Advanced Setting] で [Transform] を [Versor-Affine] に変更します。その他の設定はすべてデフォルト設定のままにします。[実行]をクリックします。
- Reorientation/Registrationメニューでアトラスを手動で調整し、頭蓋骨のCTをアトラスをフィッティングするためのガイドラインとして使用します。
- スケーリングが必要な場合は、脳の構造のボリュームに大きな影響を与える可能性があるため、細心の注意を払ってください。調整が完了したら、 チェックマーク をクリックします。
- Import 3D ROIsを選択した状態でアトラスを再実行します。
- ファイルをエクスポートして、クロップされた頭部にフィットしたアトラスを保存します。
- 目的の臓器からすべてのROIを描画してエクスポートした後、標準結合補正値を計算します。前述したように、すべてのデータを減衰補正し、%ID/g に変換します6.血液プールに存在する放射性トレーサーに正規化する心臓などの動物モデルに適した臓器に正規化します。
12. Ex vivo オートラジオグラフィー解析
- 画像解析ソフトウェアを使用してデジタル画像ファイル(.gel)を開きます。 明るさ と コントラスト を希望のしきい値に調整します。必要に応じて、適切な色の ルックアップ テーブル を適用します。
注:見やすくするために、ロイヤルまたはグレーをお勧めします。
Representative Results
hCD19-mAb は、図 2 に示すように、DOTA 標識され、64Cu で放射性標識されました。EAEおよびナイーブマウスは、64 Cu-DOTA-hCD19-mAbを注入してから18〜24時間後にPET/CTスキャン(図3)を受けました。PET/CT画像はPET解析ソフトウェアを用いて同時登録し、中枢神経系組織は手動ROIまたは半自動3D脳アトラスを用いて解析した。ROIにおける放射性トレーサーの結合(図4)は、ナイーブマウスよりもEAEマウスの方が高かった。Ex vivoガンマカウントとARGは、ナイーブマウスと比較して、EAEマウスの脊髄(腰椎と頸部の両方の胸部セグメント)と脳(ARGのみ)での結合の増加を示しました(図5および図6)。灌流マウスのex vivoガンマカウントでは、脾臓、大腿骨、骨髄などの末梢臓器における放射性トレーサー結合の減少も示され(図5)、このEAEモデルではB細胞が末梢を離れて中枢神経系に浸潤することと一致しています。
図2:品質管理データに加えて、64個のCu標識ヒト特異的CD19モノクローナル抗体である16C4-TM mAb(64Cu-DOTA-hCD19-mAb)を生成するための標識および放射性標識スキーム。 (A)DOTA-NHS-エステルとhCD19モノクローナル抗体の反応によるhCD19-DOTAコンジュゲート(スケールではない)の産生、および64 Cu-CuCl3による放射性標識による64Cu-DOTA-hCD19-mAbの産生。(B)代表的なITLCクロマトグラフ。40〜60cmのピークは放射性標識抗体です。非結合の 64Cu-CuCl3 は移動相とともに移動し、200 〜 240 cm で存在します。このクロマトグラフには、検出可能な遊離 64Cu-CuCl3 は含まれていません。(C)放射性標識抗体の品質管理仕様。略語:DOTA-NHSエステル= 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸モノ-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル;ITLC / HPLC =インスタント薄層クロマトグラフィー/高速液体クロマトグラフィー。MALDI/LC-MS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化/液体クロマトグラフィー-質量分析;CPM = 1分あたりのカウント数。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:PETスキャナー内の3Dプリントベッドにマウスを固定し、動きを最小限に抑えながら脊髄と脳の高品質イメージングを可能にする方法を示す写真。 (A)発熱体と麻酔チューブを備えた3Dプリントされた4匹のマウススキャナーベッド(「マウスホテル」とも呼ばれる)。(b)脊椎の真直度を最大化するために仰臥位で麻酔をかけたマウス、各マウスのベッド位置が記録されます。(C)マウスは、頭部にテープを貼って脳内の動きを最小限にし、腹部を横切って呼吸に影響を及ぼすことなく呼吸による動きを最小限にした。(D)マウスベッドをスキャナー内に配置し、スキャンベッドにテープで固定します。麻酔チューブはスキャナーからベッドに接続され、イソフルランは2%に設定されました。マウスの呼吸をモニターし、適切なイソフルラン濃度を確認してからスキャナーのドアを閉めました。略語:PET = 陽電子放出断層撮影法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:PET解析ソフトを用いた脊髄画像と脳の解析結果。 (A) i) 腰椎を胸椎および頸椎から分離し、大津閾値処理用の画像を準備するために脊椎に描画された ROI (ピンクと黄褐色)。 ii )脊椎(ターコイズブルーと赤)は、Otsu Thresholdingを使用してセグメント化されました。 iii) 次に、椎骨を3D ROIメニューで不変にし、脊髄を頸椎/胸椎(紫色)と腰椎(海軍)のROIに分割しました。 iv) 脊髄ROIを除去し、脊髄ROIと代表的な脳アトラスを適用した。(B)各動物の心臓のROIに正規化された%ID/gとして表されるさまざまなCNS領域からのPET結果の代表的な分析。PET取得は、PET/CTイメージング による 10分間の静的スキャンでした。半自動脳アトラスアプローチを用いて定量化された脳領域(パネル A)。 iv) 代表的な結果は、脳および胸部脊髄におけるトレーサー結合の有意な増加または有意な増加傾向のいずれかを示しています。スチューデントの t検定(*:p < 0.0332)を使用して統計量を算出します。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;ROI = 関心領域;CNS = 中枢神経系;CT = コンピュータ断層撮影;%ID / g =組織のグラムあたりの注射量の割合。EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:EAEおよびナイーブマウスのさまざまな臓器における ex vivo ガンマカウントの代表的な定量は、%ID/gで表されます。 PETスキャン後、マウスにPBSを灌流して、血液中に存在する放射性トレーサー(遊離細胞または血液常在性CD19+ B細胞に結合)を除去し、臓器を迅速に解剖して、各臓器の正確な重量を持つように重量を量りました。EAEマウスの脾臓および骨髄におけるトレーサー結合は、ナイーブマウスと比較して有意に低下する。放射性トレーサー結合の増加は、EAEマウスの腰椎および頸椎/胸部脊髄セグメントの両方で観察されます。脳は放射性トレーサー信号の有意な増加を示しませんが、有意な増加傾向にあります。スチューデントの t検定(*:p < 0.0332; ****: p < 0.0001)を使用して統計量を算出します。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;%ID / g =組織のグラムあたりの注射量の割合。EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;PBS = リン酸緩衝生理食塩水。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6: Ex vivo ARG画像は、ナイーブマウスと比較したEAEの矢状脳切片および脊髄全体における 64個のCu-DOTA-hCD19-mAb結合を示しています。 デジタル蛍光体記録フィルムは、放射性組織サンプルに約10半減期(127時間または5日)曝露した後、蛍光体イメージャーを使用してスキャンしました。得られた画像は、ナイーブマウスの脳切片と比較して、EAEマウスの脳内の信号が視覚的に高いことを示しており、これは、このモデル5でB細胞を含むことが知られている領域のために予想される。具体的には、EAEマウスの脳切片の脳幹、小脳、および心室でトレーサーシグナルが増加しています。EAEマウスの脳切片に対するシグナルのこの増加は、上記の全脳PET定量で見出されたものを反映しています。同様に、ナイーブな脊髄と比較して、頸椎/胸部および腰椎の両方の脊髄セグメントで放射性トレーサー結合が増加しており、ex vivo γカウントを使用して発見されたことを反映しています。略語:PET =陽電子放出断層撮影法;EAE = 実験的自己免疫性脳脊髄炎;ベント=心室;Cb =小脳;BS =脳幹;TSc = 胸部脊髄と頸部脊髄の組み合わせ。LSc = 腰椎脊髄。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:ナイーブマウスおよびEAEマウス脳組織のCNS組織をCD45R/B220で染色 。B細胞は、EAEマウスの脳幹、髄膜、および白質で観察されます(n = 7 EAE、n = 5 naive マウス、1匹あたり平均4スライス)。この図は 5のものです。スケールバー = 矢状脳画像では 5 mm (低倍率 [1x])、脳幹、髄膜、小脳白質では 100 μm (高倍率 [20x])。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
本稿では、CD19-PETを用いたMSマウスモデルにおけるヒトCD19+ B細胞のイメージングの合理化された方法について説明します。多発性硬化症の症状は不均一であり、治療に対する反応も異なるため、診療所でのその管理は困難な場合があり、治療法の選択とモニタリングのための新しいアプローチが非常に必要とされています。PETイメージングは、疾患の進行とB細胞枯渇療法に対する個々の反応をモニタリングするための強力なツールとして役立つ可能性があります。MSに加えて、CD19-PETイメージングは、リンパ腫および白血病または他のB細胞媒介性疾患のサブタイプにおける治療後のB細胞枯渇のモニタリングに使用できる。このプロトコルと代表的なデータは、神経疾患におけるイメージングB細胞の有用性を示しています。
MSの文脈でヒトCD19+ B細胞を研究するために、我々はB細胞依存性MOG1-125 EAEモデル7を選択しました。他のEAEモデルと同様に、このモデルは進行性の麻痺と中枢神経系への免疫細胞の浸潤の症状を示します。しかし、MOG1-125モデルは、髄膜、脳幹、実質、および心室のくも膜下腔にさまざまな数のB細胞を含むB細胞駆動モデルであるという点で独特です。これらのリンパ球は、これらの領域全体にまばらに散在したり、卵胞のような構造を形成したりすることがあり、MS 8,9のヒトでも観察されます。ナイーブマウスをコントロールとして使用することに加えて、完全なフロイントアジュバント(CFA)のみの誘導キットを使用できます(すなわち、MOGタンパク質を含まないEAEマウスに投与されるものと同じ誘導エマルジョン)。EAEマウスモデルでは、血液脳関門(BBB)が機能不全に陥っており、抗体などのより大きな実体が通過することを可能にしています。CD19-mAb放射性トレーサーは、B細胞が存在する場合にのみ結合してCNSに留まります。トレーサーは、B細胞が存在しない場合、血液プールに循環して戻ります。これは、ガンマカウントと、組織内の放射能レベルを測定する前に灌流することにより、CNS組織のex vivoオートラジオグラフィーを使用して実証しました。また、中枢神経系のB細胞を検出するためのモノクローナル抗体ベースのPET放射トレーサー(免疫PETイメージングアプローチ)の使用を報告した以前の論文でも、このことを実証しています1,2。
DOTAキレート剤は、銅-64標識ペプチドおよび抗体を用いた臨床PETイメージングに使用されてきたため、MS患者の臨床画像にhCD19-mAbを翻訳することを目指しています。DOTAは、in vivoで銅-64に十分な結合親和性を持っています。遊離64Cuが肝臓に行き、結合した放射性トレーサーのシグナルを不明瞭にする可能性があるため、in vivoの安定性は非常に重要です。したがって、肝臓の信号を測定して、他の臓器と比較した相対的な信号を計算することが重要です。筋肉は通常、対照組織として摂取されますが、EAEの場合、筋肉に炎症が存在する可能性があります。64Cu の半減期は 12.7 時間であり、DOTA-hCD19-mAb がターゲットに結合するのに十分な時間を確保しながら、PET でシグナルを測定できます。コンジュゲートを調製する場合は、小規模(75-125 μg)の試験反応を実施して、目的のDOTA/mAb比を生成するためにmAbに添加するDOTAの量を決定する必要があります(たとえば、mol mAbあたり6〜10倍の過剰DOTA-NHS-エステルの反応により、1〜2 DOTA/mAbのコンジュゲートが得られます)。反応時間と温度(例:2〜4時間、または4°Cまたは室温で一晩)もDOTA/mAb比に影響を与えるため、最適化する必要があります。非放射性銅による滴定を実施して、モノクローナル抗体あたりの DOTA の数を計算できます。ただし、より信頼性が高く正確な結果を得るためには、MALDI-MSおよび/またはLC-MSを実行することをお勧めします。
計算された DOTA/mAb 比は、特定のサンプルの平均値であり、多少の変動が予想されます。MALDIの場合、標識モノクローナル抗体と非標識モノクローナル抗体について、サンプルごとに数回のショットが撮影されます。次に、結合型と非結合型の比率を計算して、DOTA/mAb の平均数を決定します。キレート剤が多すぎると抗体結合が阻害され、少なすぎると放射性標識に一貫性がなく、シグナルが低下するため、DOTA/mAb 比は重要です。この比率は、一貫したシグナル強度と結合速度を維持するために、コンジュゲートのバッチ間で非常に近いものでなければなりません。理想的には、特定の研究内のすべての実験に同じコンジュゲートのバッチを使用する必要があります。過剰結合の可能性による免疫反応性への潜在的な影響を低減する有望な手法は、キレート剤結合が抗体の重鎖糖鎖に対して部位選択的であり、mAbあたり1つのキレート剤の添加を保証する部位特異的結合10 を使用することです。
抗体、DOTA/mAb比、 64Cuモル活性の違いなどが放射性標識に影響を与えるため、放射性標識反応条件は、最高の標識効率と収率を確保するために最適化する必要があります。最適な 64の Cu 対 mAb コンジュゲート比を使用すると、放射性トレーサーを精製せずに使用でき、放射性標識に必要な時間や、重力流塔や放射性崩壊による損失を削減できます。また、同じ 64Cuとモノクローナル抗体のコンジュゲート比を用いることで、一貫した信頼性の高いモル活性が得られることがあり、これは、マウスの複数のコホートやイメージング研究で結果を比較する場合に特に重要です。ITLC条件は、各ユーザーに合わせて変更することもできます。精製が必要な場合は、モル活性を計算できるように、HPLCおよび/またはUV/Vis分光光度法用にアリコートを保存する必要があります。
放射性標識抗体をイメージングに使用することは困難な場合があることに注意することが重要です。放射性トレーサーに使用される抗体は、生理学的効果を及ぼさないように生物学的に不活性であることが不可欠です。さらに、抗体は血液中の滞留時間が長いため、画質を損なうことなく適切なシグナル/バックグラウンドを確保するためには、特定のモノクローナル抗体の循環、結合、クリアランスを十分に待つ必要があります。通常、64 Cu標識モノクローナル抗体は20〜48時間待つだけで十分ですが、新しいモノクローナル抗体PETトレーサーを評価する場合は、注入後2、4、6、12、 24、48時間で画像化して、特定のげっ歯類モデルでのイメージングに最適な時点を決定する必要があります。S/B/バックグラウンド比が最も高いARG画像を取得する場合も同様です。このプロトコルの代表的な画像は、注射後18〜20時間で撮影されましたが、使用する放射性同位元素に応じて他の時点を使用できます。CD19の異なるエピトープに結合する抗体が異なれば、結果も異なるため、厳密に特性評価する必要があります。
脊髄信号を解析する際には、マウスをスキャニングベッドに仰向けに寝かせて、呼吸による動きを抑えることが重要です。さらに、仰臥位は、EAE疾患の進行により脊椎の湾曲が増加したマウスの脊椎をまっすぐにするのに役立つ可能性があります。脊椎と脊髄のシグナルを検出することを目指す際に考慮すべきもう一つの重要な側面は、注射部位がこれらの領域に関連する免疫応答のためにトレーサーに結合する可能性があるため、脇腹にMOG1-125 を注入することを避けることです。注射部位が近接していると、脊髄分析が妨げられる可能性があります。したがって、胸部への注射は、本明細書に記載の用途にとって好ましい。
使用される画像解析技術は、CNSイメージングに特化しています。画像解析ソフトウェア内の脳アトラスツールは、PETとCTのレジストレーションが正確である限り、再現性と信頼性の高い結果を提供します。半自動の3D脳アトラスを使用し、各マウスの頭蓋骨に合うように調整することで、動物間で一貫したROIを得ることができます。現在、脊髄の信号を分析するための自動または半自動のアプローチはないため、手動のROIを描画する必要があります。特に、CD19+ B細胞(または骨髄と脊髄の両方に存在する任意の細胞タイプ)を定量する場合、脊柱と骨髄から生じるシグナルを可能な限り排除することが重要です。その理由は、ナイーブマウスはEAEマウスよりも多くのCD19+ B細胞を骨髄に含んでいることが知られており、B細胞は末梢を離れて中枢神経系に浸潤するためである5,11。この骨髄信号は、脊髄の真の信号を不明瞭にする可能性があります。
脊柱と骨髄からの信号の寄与を最小限に抑えながら、真の脊髄信号を描写するために、CT画像のOtsu閾値を使用して、脊柱の不変のROIを作成できます。その後、別の脊髄ROIを脊柱内に容易に描くことができる。同じ手法を大腿骨の骨髄測定にも適用できます。これは、脊髄におけるトレーサー結合に関する洞察を得るのに非常に有用な方法です。しかし、PETの空間分解能は比較的低く、マウスの小さな解剖学的領域をスキャンする際の部分体積効果に関する問題があるため、追加の ex vivo 確認技術(ガンマカウント、ARGなど)を使用すると、血液、脳脊髄液、または脊柱からの漏れ出るシグナルの存在なしに、脊髄における放射性トレーサー結合の検証が可能になります。
EAEマウスでは、子宮頸部/胸部脊髄のシグナルは、疾患の重症度や獲得免疫応答中に浸潤するB細胞の数によって変化する傾向があります。浸潤するB細胞の数のこの変動、およびナイーブマウスの骨盤/脊髄骨髄のB細胞と比較してCNSのB細胞の量が少ないため、マウスでは脊髄組織の in vivo 定量が困難になる可能性があります。小動物イメージングにおけるPETの空間分解能を考えると、骨髄からの信号が脊髄信号にこぼれる可能性があります。ここで完了した生体 外生体 内分布とオートラジオグラフィーは、椎骨と脊髄組織のPET信号を検証するのに役立ちます。マウスは解剖前に灌流され、血液プール中の結合していないトレーサーを除去し、ガンマカウントとオートラジオグラフィーの結果が、臓器の血液プールにあるトレーサーではなく、各臓器に実際に結合しているトレーサーを反映するようにします。
放射性トレーサーは血液中を循環し、特に抗体トレーサーでは、最初の注射後数週間は血液中に結合していない放射性トレーサーが存在することがよくあります。多くの血管を持つ脳や脊髄を画像化しているため、信号のどの部分が本当に目的の脳/組織でのトレーサー結合によるものか、血液プールに存在するものかを理解することが重要です。したがって、脳信号を心臓/血液プールの信号で分割する必要があります。臨床現場では、脊椎の大津閾値や脊髄組織のROIと同じ画像解析技術を定量化に用いることができます。ヒトではマウスに比べて組織体積が大きいため、部分的な体積効果による影響は大幅に少なくなり、精度が向上し、in vivo所見を確認するためのex vivo技術の必要性がなくなります。クリニックでのPETの使用により、臨床医は個々のB細胞負荷に応じて各患者の治療をパーソナライズすることができます。
ARGは、脳幹や小脳などの小さな領域におけるトレーサー結合の空間的位置をより正確に描写できる高解像度画像の取得に特に有用です。同じ切片および/または隣接する切片を免疫組織化学的染色のために保存し、B細胞の存在を確認することができます。我々は以前、中枢神経系組織をCD45R/B220(補足図S1)で染色し、B細胞の数をPETおよびARGシグナルと相関させた5,9。次に、染色をARGの結果と空間的に比較して、放射性トレーサーシグナルが染色パターンと一致することを確認できます。B細胞は、脳幹全体にクラスター状に存在することもあれば、びまん性に存在することもあります。PET感度はシグナルを測定するのに十分高く、臨床翻訳に有利です。脊髄ARGの場合、椎骨から脊髄を取り除くことで、測定された信号が骨髄や血液ではなく、脊髄組織でのトレーサー結合によるものであることが保証されます。
ARGと同様に、 ex vivo ガンマカウンティングは、個々の臓器における放射性シグナルの定量化を可能にします。この特定の技術では、チューブをガンマカウンターに配置する前に、組織の湿重量を測定し、それらがそれぞれのチューブの底にあることを確認することが重要です。チューブには、正しいチューブが使用されるように、マウス番号と組織をラベル付けする必要があります。次に、チューブを校正された天びんで計量し、臓器をマイクログラム(0.0001 mg)の最も近い10分の1まで挿入します。組織によっては極端に小さく、前後のチューブ質量の差は0.0001mg程度になります。解剖後すぐに組織を計量して、水分の損失を防ぎ、質量を減少させる必要があります。計量後、脳と脊髄の管をPBSで満たして乾燥を防ぎ、これらの組織をARG用に凍結する必要があります。
Disclosures
CD19抗体はHorizon Therapeutics社から提供されました。
Acknowledgments
スタンフォード大学のSCi3小動物イメージング施設と、PET/CTに関する技術支援をしてくれたFrezghi Habte博士に感謝しています。 LC-MSは、スタンフォード大学質量分析(SUMS)コア施設のコアスタッフによって行われており、このサービスを提供してくれたスタッフに感謝します。hCD19-mAbを提供してくださったHorizon Therapeutics社、特に技術指導とサポートをいただいたJodi Karnell社に感謝します。この研究は、NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1) から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter | MiliporeSigma | UFC505008 | centrifugal filter |
| 64Cu-CuCl3 | Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor | ||
| AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
| Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
| Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only |
| Butterfly Needle Catheter | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
| DOTA-NHS-ester | Macrocyclics | B-280 | |
| EAE Induction Kit | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
| Geiger Counter | Ludlum | 14C | |
| GNEXT PET/CT Scanner | Sofie | GNEXT | |
| Hidex Automatic Gamma Counter | Hidex | AMG | |
| HPLC Column | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm |
| Illustra NAP-5 column | Cytiva | 17085301 | DNA gravity column |
| Image J | NIH | ARG analysis software | |
| Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | PI90410 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840281400 | UV-Vis micro/nano-spectrophotometer |
| PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade | Eppendorf | 30124707 | |
| Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
| VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | Desalting column |
References
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