Estimando o rendimento de compostos na placa TLC através da técnica de iluminação Blue-LED

A cromatografia em camada fina (TLC) é amplamente utilizada como técnica qualitativa e quantitativa no campo da química orgânica ^1,2,3. As principais vantagens do TLC são que ele fornece detecção rápida, requisitos de amostra flexíveis e não requer equipamentos especializados⁴. Até o momento, embora muitas abordagens avançadas tenham sido estabelecidas, o TLC ainda é o principal método para identificar amostras desconhecidas em uma mistura. No entanto, o desafio dessa abordagem é a falta de equipamentos seguros e baratos para quantificar o rendimento da amostra, especialmente para o desenvolvimento de laboratórios com orçamentos limitados. O presente estudo, portanto, teve como objetivo desenvolver um método eficiente, seguro e barato de combinação com CPT para estimar o rendimento das amostras.

Ao contrário do TLC de alta eficiência (HPTLC), da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e da cromatografia gasosa (GC) com requisitos rigorosos de amostra, demorado e envolvimento de várias etapas para o preparo da amostra^1,5, o TLC mostrou várias vantagens. Em primeiro lugar, para a preparação da amostra, a HPLC e a CG não podem detectar o extracto bruto porque o extracto bruto pode ligar a coluna de HPLC e GC. Em segundo lugar, quando as amostras não são adequadas aos raios UV (importante para a análise por HPLC) ou com baixa volatilidade (importante para a análise de CG), o TLC pode ser aplicado a essas amostras, e o uso de reagente de visualização torna as amostras isoladas visíveis em camadas finas ^6,7,8. Em terceiro lugar, para usuários em geral, HPLC e GC geralmente exigem um pré-treinamento de tempo relativamente longo antes de trabalhar de forma independente, em comparação com o TLC. Além disso, a análise quantitativa de TLC, conhecida como TLC de alto desempenho (HPTLC), pode digitalizar as informações em uma placa TLC com um scanner altamente sensível. No entanto, o custo do sistema HPTLC é relativamente caro. Como tal, o desenvolvimento de uma abordagem econômica e rápida para quantificar amostras na placa TLC é um tópico importante.

Métodos semelhantes foram desenvolvidos para quantificação do rendimento de TLC; por exemplo, Johnson⁹ relatou uma técnica que permite a quantificação das amostras em uma placa TLC usando um scanner de mesa conectado a um computador. Em 2001, El-Gindy et al.10 desenvolveram o método densitométrico TLC-, que foi utilizado para detectar o composto com densidade óptica, e a técnica também foi aplicada por Elkady et ^al.11. Em 2007, Hess² apresentou o método digitalmente aprimorado-TLC (DE-TLC) aplicado para detectar o rendimento de um composto em uma placa TLC usando uma câmera digital combinada com luz UV. Hess também comparou as diferenças de custo entre o método HPTLC e DE-TLC e concluiu que o método DE-TLC poderia ser usado em laboratórios de ensino médio e universitário devido ao seu custo acessível². No entanto, o custo do método densitométrico TLC ainda era caro, e a operação da luz ultravioleta requer pré-treinamento adequado no caso de os usuários ficarem expostos à radiação ultravioleta. Portanto, compatível com TLC, é desejável o desenvolvimento de um método eficiente, seguro e barato para quantificar o rendimento da amostra.

O presente estudo descreveu um protocolo para detecção da amostra em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED, e desenvolveu um modelo de regressão com alta confiabilidade (alto valor R-quadrado) para medir as dimensões das bandas e, em seguida, determinar o rendimento do composto. Finalmente, verificou-se que o método de iluminação azul-LED é relativamente seguro (vs. Método de detecção UV), barato (vs. GC, HPLC e HPTLC) e abordagem eficaz (vs. método de bioensaio) para quantificação do rendimento.

O presente protocolo é descrito usando lovastatina como exemplo. A lovastatina foi extraída de Aspergillus terreus de uma semana de idade.

1. Extração composta

NOTA: Para obter detalhes sobre a extração de compostos, consulte a Figura 1.

1. Cultura de Aspergillus terreus no meio de ágar batata-dextrose (PDA, ver Tabela de Materiais) a 30 °C.
2. Secar a cultura a 40 °C durante 24 h. Transfira a cultura seca para um tubo de 50 mL usando pinças esterilizadas e adicione 15 mL de acetato de etila.
3. Agitar vigorosamente a mistura por vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C com agitação a 200 rpm.
4. Sonicate a mistura usando um banho ultra-sônico de 40 kHz (ver Tabela de Materiais) a 40 °C por 1 h.
5. Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e filtrar através de um papel de filtro de 11 μm.
6. Extrair o filtrado com um volume igual de água estéril numa ampola separatória.
7. Após a separação de fases, recolha a camada orgânica e, em seguida, evapore num evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais). Dissolver o resíduo em 2 mL de acetato de etila.

2. Separação do extracto bruto por coluna de adsorção de fase normal (NP)

1. Embale a coluna com sílica gel NP como fase estacionária e use n-hexano:acetato de etila:ácido trifluoroacético (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) como fase móvel.
2. Carregar 2 ml do extracto (passo 1) na coluna e adicionar o solvente de fase móvel a um caudal de 1 ml/min para eluír o extracto.
   NOTA: A taxa de fluxo foi controlada manualmente usando uma torneira.
3. Verificar o efluente por TLC para confirmar a presença de lovastatina e, em seguida, evaporar num evaporador rotativo a 45 °C até que o solvente seja removido. Este passo leva aproximadamente 20-25 min.
4. Dissolva o resíduo em 1 mL de acetato de etila e, em seguida, misture com um volume igual de ácido trifluoroacético a 1%.
5. Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e recolher a camada orgânica num novo tubo de vidro.

3. Preparação e carregamento de placas de cromatograma de camada fina (TLC)

1. Colocar 5 μL de amostras e padrões de lovastatina (ver Tabela de Materiais) na linha de base da placa TLC usando uma pipeta capilar, deixando uma borda de 1 cm nas laterais da placa TLC.
2. Seque a placa TLC em um exaustor por 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Coloque a placa suavemente por pinça em uma câmara de vidro saturada contendo o solvente de fase móvel. Cubra a câmara com uma tampa de vidro e deixe a placa se desenvolver completamente.
4. Remova a placa da câmara quando a linha de solvente atingir 1 cm do topo da placa.

4. Análise pelo iluminador azul-LED

1. Marque a linha de solvente com um lápis. Seque a placa no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Após a secagem, mergulhe imediatamente a placa em 10% de solvente H₂SO₄ e, em seguida, seque no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
3. Coloque a placa no painel de aquecimento até que as manchas marrons apareçam. Certifique-se de que a placa não esteja superaquecida, pois isso pode dificultar a visualização da lovastatina.
4. Transfira a placa para o iluminador de LED azul e digitalize usando um freeware compatível (MiBio Fluo) (consulte a Tabela de Materiais).

5. Estimativa de rendimento pelo modelo de regressão

1. Meça a dimensão das bandas usando o software ImageJ (consulte Tabela de materiais).
2. Estabeleça um modelo de regressão usando software de análise de dados e gráficos (ver Tabela de Materiais) com base nas concentrações decrescentes dos padrões de lovastatina, incluindo 1 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL.
3. Aplicar o modelo de regressão para estimar o rendimento das amostras.

Este estudo apresentou o método de iluminação azul-LED para estimar o rendimento de compostos, e este método foi validado e comparado com os métodos de bioensaio e UV-detectados (Tabela 1). Os modelos de regressão foram desenvolvidos com base nas dimensões das bandas e concentração dos padrões para três métodos, respectivamente, para predizer o rendimento das amostras. Primeiramente, nos resultados do método de bioensaio, o R-quadrado entre as dimensões da zona de inibição e os padrões de lovastatina foi de 0,99, e o rendimento da amostra foi de 0,56 mg previsto pelo modelo de regressão (Figura 2). Em segundo lugar, no método de detecção de UV, o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão das bandas na placa TLC foi de 0,97, e o rendimento da amostra previsto pelo modelo de regressão foi de 0,53 mg (Figura 3). Notavelmente, as bordas da banda estavam borradas, e bandas de intensidade de sinal relativamente baixas foram observadas (Figura 3A). Em terceiro lugar, no método de iluminação azul-LED, o quadrado R entre os padrões de lovastatina e a dimensão das bandas na placa TLC foi de 0,98, e o rendimento da amostra foi de 0,54 mg previsto pelo modelo de regressão (Figura 4). O rendimento previsto usando o iluminador de LED azul foi mais próximo do método de bioensaio (definido como controle). A dimensão da faixa foi proporcional à quantidade de lovastatina, e as faixas claras foram obtidas pelo método de iluminação azul-LED. Além disso, as horas de trabalho dos métodos de bioensaio, UV-detectado e azul-LED foram de aproximadamente 24 h, 2 h e 1 h, respectivamente; (Nota: hora de trabalho significa o tempo total gasto no exame de rendimento da lovastatina).

Figura 1: O fluxo de trabalho do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Método de bioensaio. (A) Bioensaio de lovastatina contra Neurospora crassa (incubado por 24 h a 30 °C). No final do ensaio, as placas de ágar de 90 mm foram fotografadas sob luz visível. (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão da zona de inibição das normas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) exposta à luz UV. (A) O acetato de n-hexano:etila (2:3 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi exposta à luz UV (365 nm) após imersão no revelador (10% H2SO4). (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de lovastatina na placa TLC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) digitalizada pelo iluminador de LED azul. (A) O acetato de n-hexano:etila (2:3 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi digitalizada pelo iluminador de LED azul. (B) As concentrações de seis padrões de lovastatina foram: nº 1 (1 mg/mL), nº 2 (0,75 mg/mL), nº 3 (0,5 mg/mL) e nº 4 (0,25 mg/mL). A amostra nº 5 foi diluída a 0,25× (1:4). A amostra nº 6 foi diluída a 0,5× (1:2). A dimensão da zona de inibição (mm2) foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de lovastatina na placa TLC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação dos três métodos de detecção utilizados neste estudo.

Tabela 2: Comparação dos métodos anteriores com o presente estudo.

Figura suplementar 1: A placa de cromatograma de camada fina (TLC) com ampicilina foi digitalizada pelo método de iluminação LED-azul. (A) Acetato de etila:metanol (9:13 v/v) foi utilizado como fase móvel na análise de TLC, e a placa de TLC foi escaneada pelo iluminador de LED azul. (B) A concentração de quatro padrões de ampicilina foi: nº 1 (100 mg/mL), nº 2 (75 mg/mL), nº 3 (50 mg/mL) e nº 4 (25 mg/mL). A dimensão das bandas foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de ampicilina na placa TLC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Placa de cromatograma de camada fina (TLC) com apramicina digitalizada pelo método de iluminação LED azul. (A) Metanol:água (6:5 v/v) foi utilizada como fase móvel na análise de TLC e a placa de TLC foi escaneada pelo iluminador de LED azul. (B) A concentração de quatro padrões de apramicina foi: nº 1 (50 mg/mL), nº 2 (40 mg/mL), nº 3 (30 mg/mL) e nº 4 (20 mg/mL). A dimensão das bandas foi medida pelo software de imagem. (C) Um modelo de regressão foi desenvolvido utilizando software de análise de dados e gráficos baseado na dimensão das bandas padrão de apramicina na placa TLC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.