O presente protocolo desenvolveu um método para estimar o rendimento de compostos na placa TLC utilizando a técnica de iluminação azul-LED. As vantagens dessa abordagem são que ela é segura, eficaz, barata e permite que o pesquisador meça várias amostras simultaneamente.
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Artigo de método
Estimando o rendimento de compostos na placa TLC através da técnica de iluminação Blue-LED
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica analítica acessível que tem sido amplamente utilizada em pesquisas em química orgânica para quantificar o rendimento de amostras desconhecidas. O presente estudo desenvolveu um método eficaz, barato e seguro para estimar o rendimento de amostras em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED. A lovastatina extraída de Aspergillus terreus foi o composto de exemplo utilizado no presente estudo. Modelos de regressão baseados no padrão de lovastatina foram utilizados para avaliar o rendimento de lovastatina. Três métodos foram comparados: bioensaio, detecção de UV e iluminação azul-LED. O resultado mostrou que o método de iluminação azul-LED é significativamente mais eficaz no tempo do que os métodos de detecção UV e bioensaio. Além disso, a iluminação LED-azul foi uma opção relativamente segura devido à preocupação com os riscos biológicos no método de bioensaio (por exemplo, infecção microbiana) e a exposição ultravioleta no método de detecção UV. Em comparação com os métodos caros que exigem instrumentos especializados e treinamento de longo prazo antes de trabalhar de forma independente, como GC, HPLC e HPTLC, o uso do iluminador blue-LED foi uma opção econômica para estimar o rendimento de amostras de uma placa TLC.
Introdução
A cromatografia em camada fina (TLC) é amplamente utilizada como técnica qualitativa e quantitativa no campo da química orgânica 1,2,3. As principais vantagens do TLC são que ele fornece detecção rápida, requisitos de amostra flexíveis e não requer equipamentos especializados4. Até o momento, embora muitas abordagens avançadas tenham sido estabelecidas, o TLC ainda é o principal método para identificar amostras desconhecidas em uma mistura. No entanto, o desafio dessa abordagem é a falta de equipamentos seguros e baratos para quantificar o rendimento da amostra, especialmente para o desenvolvimento de laboratórios com orçamentos limitados. O presente estudo, portanto, teve como objetivo desenvolver um método eficiente, seguro e barato de combinação com CPT para estimar o rendimento das amostras.
Ao contrário do TLC de alta eficiência (HPTLC), da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e da cromatografia gasosa (GC) com requisitos rigorosos de amostra, demorado e envolvimento de várias etapas para o preparo da amostra1,5, o TLC mostrou várias vantagens. Em primeiro lugar, para a preparação da amostra, a HPLC e a CG não podem detectar o extracto bruto porque o extracto bruto pode ligar a coluna de HPLC e GC. Em segundo lugar, quando as amostras não são adequadas aos raios UV (importante para a análise por HPLC) ou com baixa volatilidade (importante para a análise de CG), o TLC pode ser aplicado a essas amostras, e o uso de reagente de visualização torna as amostras isoladas visíveis em camadas finas 6,7,8. Em terceiro lugar, para usuários em geral, HPLC e GC geralmente exigem um pré-treinamento de tempo relativamente longo antes de trabalhar de forma independente, em comparação com o TLC. Além disso, a análise quantitativa de TLC, conhecida como TLC de alto desempenho (HPTLC), pode digitalizar as informações em uma placa TLC com um scanner altamente sensível. No entanto, o custo do sistema HPTLC é relativamente caro. Como tal, o desenvolvimento de uma abordagem econômica e rápida para quantificar amostras na placa TLC é um tópico importante.
Métodos semelhantes foram desenvolvidos para quantificação do rendimento de TLC; por exemplo, Johnson9 relatou uma técnica que permite a quantificação das amostras em uma placa TLC usando um scanner de mesa conectado a um computador. Em 2001, El-Gindy et al.10 desenvolveram o método densitométrico TLC-, que foi utilizado para detectar o composto com densidade óptica, e a técnica também foi aplicada por Elkady et al.11. Em 2007, Hess2 apresentou o método digitalmente aprimorado-TLC (DE-TLC) aplicado para detectar o rendimento de um composto em uma placa TLC usando uma câmera digital combinada com luz UV. Hess também comparou as diferenças de custo entre o método HPTLC e DE-TLC e concluiu que o método DE-TLC poderia ser usado em laboratórios de ensino médio e universitário devido ao seu custo acessível2. No entanto, o custo do método densitométrico TLC ainda era caro, e a operação da luz ultravioleta requer pré-treinamento adequado no caso de os usuários ficarem expostos à radiação ultravioleta. Portanto, compatível com TLC, é desejável o desenvolvimento de um método eficiente, seguro e barato para quantificar o rendimento da amostra.
O presente estudo descreveu um protocolo para detecção da amostra em uma placa TLC utilizando o iluminador azul-LED, e desenvolveu um modelo de regressão com alta confiabilidade (alto valor R-quadrado) para medir as dimensões das bandas e, em seguida, determinar o rendimento do composto. Finalmente, verificou-se que o método de iluminação azul-LED é relativamente seguro (vs. Método de detecção UV), barato (vs. GC, HPLC e HPTLC) e abordagem eficaz (vs. método de bioensaio) para quantificação do rendimento.
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Protocolo
O presente protocolo é descrito usando lovastatina como exemplo. A lovastatina foi extraída de Aspergillus terreus de uma semana de idade.
1. Extração composta
NOTA: Para obter detalhes sobre a extração de compostos, consulte a Figura 1.
- Cultura de Aspergillus terreus no meio de ágar batata-dextrose (PDA, ver Tabela de Materiais) a 30 °C.
- Secar a cultura a 40 °C durante 24 h. Transfira a cultura seca para um tubo de 50 mL usando pinças esterilizadas e adicione 15 mL de acetato de etila.
- Agitar vigorosamente a mistura por vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C com agitação a 200 rpm.
- Sonicate a mistura usando um banho ultra-sônico de 40 kHz (ver Tabela de Materiais) a 40 °C por 1 h.
- Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e filtrar através de um papel de filtro de 11 μm.
- Extrair o filtrado com um volume igual de água estéril numa ampola separatória.
- Após a separação de fases, recolha a camada orgânica e, em seguida, evapore num evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais). Dissolver o resíduo em 2 mL de acetato de etila.
2. Separação do extracto bruto por coluna de adsorção de fase normal (NP)
- Embale a coluna com sílica gel NP como fase estacionária e use n-hexano:acetato de etila:ácido trifluoroacético (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) como fase móvel.
- Carregar 2 ml do extracto (passo 1) na coluna e adicionar o solvente de fase móvel a um caudal de 1 ml/min para eluír o extracto.
NOTA: A taxa de fluxo foi controlada manualmente usando uma torneira. - Verificar o efluente por TLC para confirmar a presença de lovastatina e, em seguida, evaporar num evaporador rotativo a 45 °C até que o solvente seja removido. Este passo leva aproximadamente 20-25 min.
- Dissolva o resíduo em 1 mL de acetato de etila e, em seguida, misture com um volume igual de ácido trifluoroacético a 1%.
- Centrifugar a mistura a 5.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e recolher a camada orgânica num novo tubo de vidro.
3. Preparação e carregamento de placas de cromatograma de camada fina (TLC)
- Colocar 5 μL de amostras e padrões de lovastatina (ver Tabela de Materiais) na linha de base da placa TLC usando uma pipeta capilar, deixando uma borda de 1 cm nas laterais da placa TLC.
- Seque a placa TLC em um exaustor por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa suavemente por pinça em uma câmara de vidro saturada contendo o solvente de fase móvel. Cubra a câmara com uma tampa de vidro e deixe a placa se desenvolver completamente.
- Remova a placa da câmara quando a linha de solvente atingir 1 cm do topo da placa.
4. Análise pelo iluminador azul-LED
- Marque a linha de solvente com um lápis. Seque a placa no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Após a secagem, mergulhe imediatamente a placa em 10% de solvente H2SO4 e, em seguida, seque no exaustor por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa no painel de aquecimento até que as manchas marrons apareçam. Certifique-se de que a placa não esteja superaquecida, pois isso pode dificultar a visualização da lovastatina.
- Transfira a placa para o iluminador de LED azul e digitalize usando um freeware compatível (MiBio Fluo) (consulte a Tabela de Materiais).
5. Estimativa de rendimento pelo modelo de regressão
- Meça a dimensão das bandas usando o software ImageJ (consulte Tabela de materiais).
- Estabeleça um modelo de regressão usando software de análise de dados e gráficos (ver Tabela de Materiais) com base nas concentrações decrescentes dos padrões de lovastatina, incluindo 1 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,5 mg/mL e 0,25 mg/mL.
- Aplicar o modelo de regressão para estimar o rendimento das amostras.
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Resultados
Este estudo apresentou o método de iluminação azul-LED para estimar o rendimento de compostos, e este método foi validado e comparado com os métodos de bioensaio e UV-detectados (Tabela 1). Os modelos de regressão foram desenvolvidos com base nas dimensões das bandas e concentração dos padrões para três métodos, respectivamente, para predizer o rendimento das amostras. Primeiramente, nos resultados do método de bioensaio, o R-quadrado entre as dimensões da zona de inibição e os padrões de lovastatina foi...
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Discussão
O presente estudo descreveu uma nova abordagem, o iluminador azul-LED, para quantificar compostos sem o uso de equipamentos caros e especializados, como HPTLC, HPLC e GC, e o método foi comparado com os métodos de bioensaio e UV detectados para avaliar o desempenho de quantificação. Como resultado, concluiu-se que o método de iluminação azul-LED é um protocolo relativamente seguro e eficaz usado para quantificar o rendimento de compostos alvo na placa TLC.
Estudos prévios relataram vários méto...
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Divulgações
Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar bacteriológico americano | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Iluminador Blue-LED | Centrífuga MICROTEK | Bio-1000F | |
| Thermo | Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Lâmpada UV compacta | UVP | UVGL-25 | |
| Acetato de etila | MACRON | MA-H078-10 | |
| Papel de filtro 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatina padrão | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexano | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Caldo de dextrose de batata H | STBIO MEDIA | ||
| Evaporador rotativo | EYELA | SB-1000 | |
| Ácido sulfúrico | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC gel de sílica 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Ácido trifluoroacético | Alfa Aesar | 10229873 | |
| máquina de vibração ultrassônica | DELTA | DC600 |
Referências
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
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Reimpressões e permissões
