Larvas de zebrafish como modelo para avaliar potenciais radiossensibilizadores ou protetores

Resumo

O peixe-zebra tem sido recentemente explorado como um modelo para validar potenciais modificadores de radiação. O presente protocolo descreve as etapas detalhadas para o uso de embriões de zebrafish para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o efeito de diferentes tratamentos e radiação.

Resumo

Os peixes-zebra são amplamente utilizados em vários tipos de pesquisa porque são um dos modelos de vertebrados de fácil manutenção e exibem várias características de um sistema modelo único e conveniente. Como as células altamente proliferativas são mais suscetíveis a danos no DNA induzidos por radiação, os embriões de peixe-zebra são um modelo in vivo de linha de frente na pesquisa de radiação. Além disso, esse modelo projeta o efeito da radiação e de diferentes fármacos em um curto espaço de tempo, juntamente com os principais eventos biológicos e respostas associadas. Vários estudos sobre câncer têm utilizado peixe-zebra, e este protocolo é baseado no uso de modificadores de radiação no contexto da radioterapia e do câncer. Este método pode ser facilmente utilizado para validar os efeitos de diferentes fármacos em embriões irradiados e controles (não irradiados), identificando fármacos como radiossensibilizadores ou protetores. Embora essa metodologia seja usada na maioria dos experimentos de triagem de drogas, os detalhes do experimento e a avaliação da toxicidade com o histórico de exposição à radiação de raios X são limitados ou abordados apenas brevemente, dificultando sua execução. Este protocolo aborda essa questão e discute o procedimento e a avaliação da toxicidade com uma ilustração detalhada. O procedimento descreve uma abordagem simples para o uso de embriões de peixe-zebra para estudos de radiação e triagem de drogas baseadas em radiação com muita confiabilidade e reprodutibilidade.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal bem conhecido que tem sido amplamente utilizado em pesquisas nas últimas 3 décadas. É um pequeno peixe de água doce que é fácil de criar e reproduzir em condições de laboratório. O zebrafish tem sido extensivamente utilizado para diversos estudos de desenvolvimento e toxicológicos 1,2,3,4,5,6,7,8. O zebrafish tem alta fecundidade e curta geração emb....

Protocolo

O presente estudo foi conduzido com aprovação prévia e seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto de Ciências da Vida de Bhubaneswar. Todas as manutenções e reproduções de zebrafish foram conduzidas em uma instalação de piscicultura ambiente a 28,5 °C, e os embriões foram mantidos em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO) a uma temperatura de 28,5 °C. Neste caso, foi utilizada a linhagem AB do zebrafish, e o estadiamento foi realizado de acordo com Kimmel et ^al.54. A radiação de raios X foi administrada a 6 hpf (estágio de escudo), e diferentes fenótipos foram observados até 120 hpf.

Resultados

O layout geral do protocolo está representado na Figura 2. O efeito da radiação e a caracterização de forma dose-dependente foram avaliados com as seguintes análises.

Avaliação da toxicidade induzida por raios X
Com o uso de estereomicroscópio, as seguintes anormalidades foram avaliadas e caracterizadas após o tratamento medicamentoso e/ou radiação. De acordo com as diretrizes da OCDE 61, para avaliação da toxicidade em peixes,.......

Discussão

Zebrafish são usados como modelos valiosos em muitos estudos, incluindo vários tipos de pesquisa de câncer. Esse modelo fornece uma plataforma útil para a triagem de drogas em larga escala^67,68. Como qualquer outro método de avaliação de toxicidade, a avaliação quantitativa das principais alterações biológicas decorrentes da radiação e/ou tratamento medicamentoso é a parte mais crucial deste protocolo. Nesses tipos de estudos, a sobrevida não deve ser o único cri.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 6 poços	Corning	CLS3335	Poliestireno
B.O.D Incubadora	Oswald	JRIC-10
Cloreto de Cálcio	Fisher Scientific	10101-41-4
Microscópio de Dissecação	Zeiss	Stemi 2000
Tanque Externo para o Tanque de Reprodução de 1,0 L	Tecniplast	ZB10BTE	Policarbonato
Placas de vidro	Borosil	3165A75
Glass GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Versão 5.01
Corrediças de concavidade Kline	Himedia	GW092-1PK
Vidro Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Hidrato de azul de metileno	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Filme de parafina
Pipetas Pasteur	Himedia	PW1212-1X500NO	Polietileno Tanque
interno perfurado em plástico para o tanque de reprodução de 1,0 L	Tecniplast	ZB10BTI	policarbonato de policarbonato
para o tanque de reprodução de 1,0 L	Tecniplast	ZB10BTD	Tampa de policarbonato
policarbonato para o tanque de reprodução de 1,0 L	Tecniplast	ZB10BTL	Policarbonato
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P5655
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Pellet de hidróxido de sódio	SRL	1949181
Microscópio estereoscópico Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Raio X de precisão	Raio X de precisão X-RAD	225XL

Divisor de de