Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.
Artigo de método
* These authors contributed equally
Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.
A família das caspases é conhecida por mediar muitas vias celulares além da morte celular, incluindo diferenciação celular, pathfinding axonal e proliferação. Desde a identificação da família das proteases de morte celular, tem havido uma busca por ferramentas para identificar e expandir a função de membros específicos da família em estados de desenvolvimento, saúde e doença. No entanto, muitas das ferramentas de caspase atualmente disponíveis comercialmente que são amplamente utilizadas não são específicas para a caspase alvo. Neste relato, delineamos a abordagem que usamos para identificar, validar e direcionar a caspase-9 no sistema nervoso usando um novo inibidor e abordagens genéticas com leituras imuno-histoquímicas. Especificamente, utilizamos o tecido neuronal da retina como modelo para identificar e validar a presença e a função das caspases. Essa abordagem permite o interrogatório de funções específicas da caspase-9 apoptóticas e não apoptóticas do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular, e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.
As caspases são uma família de proteases que regulam a morte celular do desenvolvimento, as respostas imunes e a morte celular aberrante na doença 1,2. Embora seja bem sabido que os membros da família da caspase são induzidos em uma variedade de doenças neurodegenerativas, entender qual caspase impulsiona a patologia da doença é mais desafiador3. Tais estudos requerem ferramentas para identificar, caracterizar e validar a função de membros individuais da família caspase. A análise das caspases individuais relevantes é importante tanto do ponto de vista mecanicista quanto terapêutico, po....
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Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
1. Preparação do tecido retiniano e criossecção
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O protocolo descrito permite ao usuário analisar e quantificar os níveis de caspase-9 no tecido da retina. Além disso, apresenta ferramentas para identificar, validar e direcionar especificamente a caspase-9 e os substratos a jusante. As etapas resumidas permitem a análise quantificável dos níveis de caspase e da especificidade celular em fotomicrografias fluorescentes. Todas as figuras mostram fotomicrografias representativas e quantificação dos níveis de caspase indicados na retina total, células endoteliais e neurônio.......
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As caspases são uma família de proteases com vários membros melhor estudada por seus papéis na morte celular e inflamação; no entanto, mais recentemente, uma variedade de funções de não-morte tem sido descoberta para alguns membros da família 4,5. Grande parte da nossa compreensão da função da caspase é derivada do trabalho em cultura de células e de dados inferenciais de doenças humanas. Embora seja apreciado que haja indução, ativação ou inativação aberrante de.......
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Os autores declaram os seguintes interesses concorrentes: C.M.T. tem os seguintes pedidos de patente US20200164026, US20190142915 e US20150165061. C.M.T. e S.S. têm um pedido de patente 20140024597 nos EUA. C.M.T., A.M.P. e M.I.A. têm um pedido de patente US2020058683. C.M.T. e Y.Y.J. têm um pedido de patente WO2018013519. M.I.A e C.M.T estão listados como inventores em um pedido de patente WO/2020/223212 pelos curadores da Universidade de Columbia, na cidade de Nova York. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.
Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) dos National Institutes of Health (NIH), número de prêmio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT), e o Departamento de Defesa do Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | uso a 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | uso a 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | uso a 1:50 |
| Microscópio Confocal de Disco Giratório Biovision | |||
| FIJI 2.3.0 | código aberto | ||
| Pinça Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Roboz | RS-5015 | ||
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 camundongos | gerados | em laboratório ver Avrutsky 2020 | |
| Isolectina (594, 649) | Uso do vetor | DL-1207 | a 1:200 |
| Cloridrato de cetamina | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Bomba de perfusão | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | gerado | consulte Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Sistemas Visitron | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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