Summary
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro モデルとして浮上しています。ここでは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理機能を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です。したがって、適切な前臨床心臓安全性評価モデルを使用することは、医薬品開発中の重要なステップです。現在、心臓の安全性評価は依然として動物実験に大きく依存しています。しかし、動物モデルは、特に心臓の電気生理学的特性の点で、種固有の違いのために、ヒトに対する翻訳特異性が低いことに悩まされています。したがって、前臨床心臓安全性評価のための信頼性が高く、効率的で、人間ベースのモデルを開発することが急務です。ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための貴重な in vitro モデルとして浮上しています。hiPSC-CMは、多様な遺伝的背景やさまざまな病状を持つ個人から取得できるため、薬物誘発性心毒性を個別に評価するための理想的な代理となります。そのため、hiPSC-CMの機能特性を網羅的に調べるための方法論を確立する必要があります。このプロトコルでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム処理の測定など、hiPSC-CMで評価できるさまざまな機能アッセイについて詳しく説明します。全体として、前臨床心臓安全性評価にhiPSC-CMを組み込むことは、医薬品開発に革命をもたらす可能性を秘めています。
Introduction
医薬品開発は長くて費用のかかるプロセスです。2009年から2018年の間に米国食品医薬品局(FDA)によって承認された新しい治療薬の研究では、資本化された研究および臨床試験の推定中央値は製品あたり9億8500万ドルであると報告されています1。薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です2。特に、心毒性は治療薬の複数のクラスの間で報告されています3。したがって、心臓の安全性評価は、医薬品開発プロセスにおける重要な要素です。心臓の安全性評価の現在のパラダイムは、依然として動物モデルに大きく依存しています。しかし、動物モデルの使用との種の違いは、ヒト患者における薬物誘発性心毒性の不正確な予測の主な原因としてますます認識されています4。例えば、心臓活動電位の形態は、異なる再分極電流からの寄与のために、ヒトとマウスの間で実質的に異なる5。さらに、心臓生理学に影響を与える可能性のある心筋ミオシンおよび環状RNAの差次的アイソフォームは、種の間で十分に文書化されています6,7。これらのギャップを埋めるには、前臨床心臓の安全性評価のための信頼性が高く、効率的な、人間ベースのモデルを確立することが不可欠です。
人工多能性幹細胞(iPSC)技術の画期的な発明は、前例のない薬物スクリーニングおよび疾患モデリングプラットフォームを生み出しました。過去10年間で、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)を作製する方法は十分に確立されている8,9。hiPSC-CMは、疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療における潜在的な用途に大きな関心を集めています。例えば、hiPSC-CMは、QT延長症候群10、肥大型心筋症11,12、拡張型心筋症13,14,15などの遺伝的遺伝によって引き起こされる心疾患の病理学的表現型をモデル化するために利用されてきた。その結果、心疾患の病因に関与する重要なシグナル伝達経路が特定され、効果的な治療のための潜在的な治療戦略に光を当てることができます。さらに、hiPSC-CMは、ドキソルビシン、トラスツズマブ、およびチロシンキナーゼ阻害剤を含む抗癌剤に関連する薬物誘発性心毒性をスクリーニングするために使用されています16,17,18;結果として生じる心毒性を軽減するための戦略は調査中です。.最後に、hiPSC-CMに保持される遺伝情報は、個人レベルと集団レベルの両方で薬物誘発性心毒性のスクリーニングと予測を可能にします19,20。まとめると、hiPSC-CMは、パーソナライズされた心臓の安全性予測のための非常に貴重なツールであることが証明されています。
このプロトコルの全体的な目標は、hiPSC-CMを疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療に適用する上で非常に重要なhiPSC-CMの機能特性を包括的かつ効率的に調査するための方法論を確立することです。ここでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム(Ca2+)ハンドリングの測定など、hiPSC-CMの機能特性を評価するための一連の機能アッセイについて詳しく説明します(図1)。
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Protocol
1.培地と溶液の準備
- 50x B27サプリメントの10 mLボトルと500 mLのRPMI 1640培地を混合して、hiPSC-CM維持培地を調製します。培地を4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。使用前に培地を室温(RT)に平衡化してください。
- 20 mLの血清置換培地と180 mLのhiPSC-CM維持培地(10%希釈、v/v)を混合して、hiPSC-CMシーディング培地を調製します。新たに調製した播種培地が好ましいが、4°Cで2週間以内保存することができる。使用前に培地をRTに平衡化してください。
- 基底膜マトリックス1本(10 mL)を4°Cで一晩解凍し、500 μLの基底膜マトリックスを滅菌1.5 mLチューブに分注して、細胞外マトリックスコーティング溶液を調製します。さらに使用するには、-20°Cで保存してください。500 μLの基底膜マトリックスと100 mLの氷冷DMEM/F12培地(1:200希釈、v/v)を混合して、基底膜マトリックスコーティング溶液を作ります。
- 135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl2、5 mM グルコース、および10 mM HEPESを含むタイロード溶液50 mLを調製します。NaOHでpHを7.4に調整します。実験当日に新鮮なTyrodeの溶液を準備します。
- 120 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM EGTA、および10 mM HEPESを含む50 mLの細胞内ピペット溶液を調製します。KOHでpHを7.2に調整します。細胞内ピペット溶液を滅菌5 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。 実験当日、溶液にMgATPを新たに添加して、最終濃度3mMを達成します。
- 2 μMのフラ-2 AMと0.1%プルロニックF-127を含む1 mLのフラ-2 AMローディング溶液を調製します。実験当日に新鮮なローディング溶液を準備し、光から保護します。
2. hiPSC-CM収縮運動の測定
- 96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を添加して、基底膜マトリックスコーティングプレートを調製します。加湿した細胞培養インキュベーター内で96ウェルプレートを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートする。
- hiPSC-CMの酵素的解離
- スタンフォード心臓血管研究所iPS細胞バイオバンク(http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)にhiPS細胞を請求してください。先行文献8,9に従ってhiPSC-CMを生成する。6ウェルプレートで培養したhiPSC-CMを顕微鏡下で10倍の倍率で観察します。
注:細胞がまだ増殖しているときは、細胞を解離しないでください。さもなければ、細胞は再メッキ後にウェル上で増殖し、機能アッセイの不正確な結果をもたらすであろう。通常、hiPSC-CMは18〜23日目に増殖を停止します。 - hiPSC-CMが強く鼓動し、純度が95%を超えていることを確認してください。心筋細胞の特異的マーカーである心筋トロポニンTに対する免疫染色により純度を評価する8、9。
- 維持培地を吸引し、1x DPBSで細胞を2回洗浄します。6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞剥離溶液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
注:潜伏期間は定期的に監視する必要があります。細胞の生存率を低下させるため、細胞を過剰消化しないように注意してください。 - 5 mLピペットを使用してhiPSC-CMを数回穏やかにピペットで上下させ、シングルセル懸濁液を生成します。等量のhiPSC-CMs播種培地を添加し、細胞剥離液を中和します。
- hiPSC-CMを300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1〜2 mLのhiPSC-CM播種培地に再懸濁します。
- 細胞密度と生存率をトリパンブルー排除法を用いて定量化します。簡単に説明すると、10μLの細胞懸濁液を等量のトリパンブルーと混合し、細胞計数スライドに移し、次いで細胞カウンターを用いて計数する(前述のように21)。
- スタンフォード心臓血管研究所iPS細胞バイオバンク(http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)にhiPS細胞を請求してください。先行文献8,9に従ってhiPSC-CMを生成する。6ウェルプレートで培養したhiPSC-CMを顕微鏡下で10倍の倍率で観察します。
- ハイPSC-CMのシーディング
- 細胞外マトリックスコーティング溶液を96ウェルプレートから除去します。
- 1ウェルあたり50,000個の細胞を100 μLのhiPSC-CM播種培地に播種し、96ウェルプレートを加湿細胞培養インキュベーターに入れ、37°C、5%CO2 で一晩過ごします。
- プレーティングの1日後に、hiPSC-CMシード培地を100 μLのhiPSC-CM維持培地と交換します。記録するまで2日ごとにhiPSC-CMメンテナンス培地を交換してください。
- データ・アクイジション
- メッキ後少なくとも10日でhiPSC-CMの収縮運動を測定します(推奨)。
- 温度コントローラーの電源を入れ、37°Cを推奨温度として設定します。顕微鏡、カメラ、およびCO2 電源の電源を入れます。
- プレートホルダーのウォータージャケットに適量の滅菌脱イオン水を入れます(図2A)。96ウェルプレートをプレートホルダーに置き、細胞を少なくとも5分間順応させます。
- 表示ソフトウェアを開き、カメラのフレームレートを75フレーム/秒(fps)に設定し、ビデオ/画像の解像度を1024×1024ピクセルに設定します。オートフォーカスとオートブライトネス機能を適用します。ハイPSC-CMの動画や画像を録画します。
注意: 記録中は顕微鏡テーブルの振動を避けてください。 - 自動分析のためにアナライザーソフトウェアを開きます。
3. ヒPSC-CM電界電位の測定
- 基底膜マトリックスコーティングプレートの作製
- 8 μLの細胞外マトリックスコーティング液滴を、48ウェル微小電極アレイ(MEA)プレートの各ウェルの記録電極領域に注意深く置きます。液滴配置に適した電極領域については 、図3A を参照してください。このステップは、hiPSC-CM単分子膜を電極に集中させるために重要です。いかなる状況でも電極に触れないでください。
- コーティング溶液の蒸発を防ぐために、3ウェルMEAプレートのウェル(図3A)の周囲に48 mLの滅菌脱イオン水を追加します。加湿した細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%CO2 で45〜60分間インキュベートします。
注意: 基底膜マトリックスの乾燥を防ぐために、長時間インキュベートしないでください。
- ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
- ハイPSC-CMのシーディング
- 同じ単一列または列内の200 μLピペットチップを使用して、電極に触れることなく、ウェル表面からほとんどの細胞外マトリックス培地を除去します。
- 1ウェルあたり50,000個の細胞を、8 μLのhiPSC-CMシーディング培地に、同じ行または列の各ウェルの記録電極領域に播種します。
- すべてのウェルに細胞が播種されるまで、最後の2つのステップを繰り返します。すべてのウェルにhiPSC-CM懸濁液が含まれていることを顕微鏡で確認します。必要な密度については、 図3Bを参照してください。
注:基底膜マトリックスが完全に乾燥すると、hiPSC-CMの付着が損なわれ、細胞の付着が最適ではなくなります。 - 加湿細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%CO2 で60分間インキュベートします。
- 150 μLのhiPSC-CMシーディング培地を48ウェルMEAプレートの各ウェルにゆっくりと穏やかに加えます。事前に播種したhiPSC-CMを分散せずに培地を添加するには、プレートを45°の角度で保持し、ピペットチップを各ウェルの壁に立てかけ、培地をゆっくりと放出します。
注意: 培地の追加が速すぎたり、高圧で行ったりすると、付着した心筋細胞が剥がれます。hiPSC-CMドロップサスペンションとの直接接触を避けてください。 - 加湿細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートする。
- めっきの1日後に、hiPSC-CM播種培地を300 μLのhiPSC-CM維持培地でリフレッシュします。hiPSC-CMメンテナンス培地は、記録前に2日ごとに交換してください。
- データ・アクイジション
- めっき後少なくとも10日でMEA測定を実行してください(推奨)。めっき後10日目に、 図3Cに示すように、10倍の倍率で顕微鏡下で自発拍解hiPSC-CM単分子膜の密度を確認します。
- 48ウェルMEAプレートを記録装置に入れます。タッチスクリーンは、温度(37°C)とCO2 (5%)の状態を観察することができます。
- ナビゲーターソフトウェアを開きます。実験セットアップウィンドウで、 心臓リアルタイム構成とフィールド電位記録を選択します。自発的またはペースのあるビート構成を適用します。
- 拍動検出パラメータでは、検出スレッショルドを300μV、最小鼓動時間を250ms、最大鼓動周期を5秒に設定します。フィールドポテンシャル期間(FPD)計算の 多項式回帰 を選択します。
- ベースラインの電気的活動信号が成熟していて安定しているかどうかを確認します。
注:マルチウェルMEAプレートから各電極によって記録された成熟波形は、図3D-Fに示すように、心臓の脱分極スパイクと再分極位相と一致する簡単に識別できる特性を備えた心電界電位を反映している必要があります。 - ベースラインの心臓活動を1〜3分間取得します。薬物治療が必要な場合は、ベースライン記録後に化合物をウェルに追加します。次の記録の前に、プレートをインキュベーターに少なくとも30分間置きます。
4. hiPSC-CM活動電位の測定
- 35 mmディッシュのガラス底部に500 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を入れて、基底膜マトリックスコーティングディッシュを準備します(図4A)。加湿した細胞培養インキュベーター内で35 mmディッシュを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。
- ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
- ハイPSC-CMのシーディング
- 細胞外マトリックスコーティング溶液を35 mmディッシュから除去します。ウェルあたり50,000細胞を500 μLのhiPSC-CMシーディング培地に35 mmディッシュのガラス底部に播種します。
- 加湿した細胞培養インキュベーター内で35 mmディッシュを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。hiPSC-CMシーディング培地を取り出し、2 mLのhiPSC-CM維持培地を35 mmディッシュに加えます。
注:細胞に触れないように、200 μLのろ過されていないチップを2 mL吸引ピペットの上に置いて使用済み培地を除去することをお勧めします。 - 記録前に2日ごとにhiPSC-CM培地を交換してください。
- データ・アクイジション
- めっき後少なくとも10日で活動電位測定を行ってください(推奨)。ステップ1.4の説明に従って、新しいTyrodeの溶液を調製します。細胞内ピペット溶液1アリコートを解凍し、MgATPを最終濃度3 mMまで新たに添加します。
- マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーからマイクロピペットを引き出します。
注:マイクロピペットの抵抗は2〜5MΩが好ましいです。 - hiPSC-CM維持培地をタイロードの溶液に交換し、細胞をタイロードの溶液に15分間順応させます(図4C)。温度センサーをチャンバーに挿入し、図4Cに示すように35 mmディッシュをチャンバーに入れ、温度を37° Cに調整します(図4D)。
- マイクロピペットに細胞内溶液を充填し、パッチクランプアンプヘッドステージに接続されたホルダーに挿入します(図4E)。刺激/取得ソフトウェアを開き、活動電位記録プロトコルをロードして、電圧クランプ構成を選択します。
- マイクロピペットを入浴液に挿入し、適切な単一のhiPSC-CMを選択し、マイクロマニピュレーターを使用して選択したセルの横にあるマイクロピペットの位置を調整および下げます。ピペットチップをバス溶液に挿入したら、オシロスコープのモニターで観察できるピペット抵抗を確認します。
- ピペットをセルの近くに配置すると、電流パルスがわずかに減少し、シール抵抗の増加を反映します。負圧で穏やかな吸引を適用して抵抗を増やし、ギガシールを形成します。 シール 機能を適用します。
- 追加の吸引を適用してメンブレンを破壊し、セル全体の記録構成を取得します。ピペット領域内の膜部分が吸引によって破裂すると、内部溶液は細胞質と平衡状態になります。この時点で、アンプダイアログを使用して、電圧クランプモード(Vクランプ)から電流クランプモードまたは電流注入なし(Cクランプ)に切り替えます。[記録]ボタンを押して、アクションポテンシャル 記録 ファイルを生成して保存します。
注:モード変更により、トリガーや刺激記録プロトコル なしで hiPSC-CMの自発的な活動電位を連続的に記録でき、パッチクランプアンプのV-mon出力で監視できます。
5. ヒPSC-CMCa2+ トランジェントの測定
- Ca2+イメージング21用にカスタマイズされた細胞チャンバーを調製するための前のプロトコルを参照してください。基底膜マトリックスコーティング細胞室の調製には、細胞室に200 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を入れます。加湿した細胞培養インキュベーター内で細胞チャンバーを37°C、5%CO2で一晩インキュベートする。
- ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
- ハイPSC-CMのシーディング
- 細胞外マトリックスコーティング溶液を細胞室から除去する。ウェルあたり20,000個の細胞を200 μLのhiPSC-CM播種培地に播種します。
- 播種後1日目にhiPSC-CM播種培地を200 μLのhiPSC-CM維持培地に交換します。hiPSC-CMメンテナンス培地は、記録前に2日ごとに交換してください。
- データ・アクイジション
- めっき後少なくとも10日でCa2+ 過渡測定を実行します(推奨)。ステップ1.4の説明に従って、新しいTyrodeの溶液を調製します。ステップ1.6の説明に従って、新しいFura-2 AMローディング溶液を調製します。
- hiPSC-CM維持培地を吸引し、タイロード溶液で2回洗浄します。100 μLのFura-2 AMローディング溶液を塗布し、RTで10分間インキュベートします。
- Fura-2 AMローディング溶液をTyrodeの溶液に置き換え、Fura-2 AMの完全な脱エステル化のために少なくとも5分間待ちます。
- 40倍の油浸対物レンズ(0.95 NA)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡の40倍の対物レンズに液浸油を一滴加えます。セルチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置します(図5A)。
- 温度調節器ワイヤーを槽に取り付け、37°Cに設定します。 電界刺激電極を取り付け、パルスを0.5 Hzに設定し、持続時間20ミリ秒にします。
- 超高速波長スイッチング光源をオンにし、機器の指示に従って340nmおよび380nmの高速スイッチングモードに設定します。
- 両方の波長に20ミリ秒の露光時間を適用し、ソフトウェアで20秒の記録時間を適用します。hiPSC-CMにおけるCa2+ トランジェントのリアルタイム変化を反映した動画を撮影します。データをスプレッドシートにエクスポートし、前述のようにデータを分析します23。
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Representative Results
このプロトコルでは、hiPSC-CMの収縮運動、電界電位、活動電位、およびCa2+ 過渡現象の測定方法について説明します。酵素消化、細胞播種、維持、および機能アッセイ伝導を含む概略図を 図1に示します。収縮運動測定にはhiPSC-CM単分子膜の形成が必要です(図2B)。hiPSC-CMの収縮-緩和運動の代表的な痕跡を 図2Cに示します。アナライザソフトウェアは、デフォルト設定を使用して収縮開始、収縮ピーク、収縮終了、緩和ピーク、および緩和終了を検出することにより、収縮-緩和モーショントレースを自動的に解析できます(図2D)。収縮および緩和ピークの速度は、hiPSC-CMの収縮および緩和能力を評価するために使用されます。さらに、収縮および緩和変形距離も求めることができる。
MEAアッセイは、電界電位として知られる活動電位の細胞外記録です。電界電位の測定を成功させるには、MEAプレートの各ウェル内のすべての電極でhiPSC-CM単層を完全にカバーする必要があります(図3C)。各電極によって記録される成熟波形は、図3D-Fに示すように、容易に識別可能な特性を持つ心電界電位を反映している必要があります。指定された品質基準は、1)ベースライン活動が毎分20〜90拍以内の自発拍動を示すこと、2)拍動速度がすべてのウェルのベースライン拍動率に対して計算された6SD以内であること、3)拍動期間の変動係数が5%未満であること、および4)脱分極振幅が0.3mVを超えること、 以前に公開された22。図3Eは、hiPSC-CMの代表的な電界電位トレースを示す。ナビゲーターソフトウェアは、ビートとFPDを自動的に検出して識別します。解析後、ビート周期、FPD、およびスパイク振幅を取得できます(図3F)。具体的には、図3Fに示すように、ビート周期は脱分極ピークtoピーク間隔によって決定され、FPDは脱分極ピークから再偏光ピークまでの間隔によって決定され、スパイク振幅は脱分極正ピークから負ピークまでの距離によって測定される。
シングルセルパッチクランプは、hiPSC-CMの電気生理学的特性を評価するためのゴールドスタンダードです(図4B)。電流クランプモードでの全細胞パッチクランプ記録は、単一のhiPSC-CMの自発的な活動電位を記録することができます(図4F)。分析後、30%、50%、および90%の再分極での振幅、最大拡張期電位(MDP)、および活動電位持続時間(APD)を含むいくつかのパラメータを得ることができます(図4G)。
Ca2+イメージングでは、個々のhiPSC-CMの蛍光強度の経時変化をソフトウェアで記録することができます。フラ-2負荷hiPSC-CMの代表的な領域を図5Bに示す。超高速波長スイッチング光源を使用することで、フレームモードスキャンを介して数百のhiPSC-CMからのCa2+トランジェントの記録が可能になります。表計算ベースのプログラム23による解析の後、各セルの経時的なF340/F380比を求めることができる。次いで、刺激されたCa2+過渡現象の生の痕跡をプロットすることができる(図5C)。さらに、振幅、拡張期Ca2+、およびCa2+崩壊タウなどのパラメータを得ることができる(図5D)。
図 1.プロトコルの全体概略図。 0日目に、基底膜マトリックスコーティングされた96ウェルプレート/48ウェルMEAプレート/35 mmディッシュ/セルチャンバーでhiPSC-CMを消化し、播種します。細胞運動イメージングシステム、MEA、パッチクランプ、およびCa2+ イメージングシステムを使用して機能アッセイを実行する前に、少なくとも10日間の回復期間を待ちます。略称:MEA =微小電極アレイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.収縮運動の測定。 (a)細胞運動イメージングシステム。(b)hiPSC-CM単分子膜の代表的な領域。スケールバー:20μm。 (C)hiPSC-CMの代表的な収縮緩和痕跡。(D) 収縮開始、収縮ピーク、収縮終了、緩和ピーク、緩和終了を示す収縮緩和トレースの模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.電界電位の測定。 (A)(左)48ウェルMEAプレートの上面図、(中央)16個の電極を備えた1つのウェル、および(右)基底膜マトリックス液滴がカバーする必要のある領域。蒸発を補うために十分な蒸留水を貯水池に追加します。(b)再めっき後のhiPSC-CM懸濁液および所望の密度。(c)hiPSC-CM単分子膜の代表的な領域。(D)48ウェルMEAプレートの1ウェル内の16個の電極からの連続波形プロット。(E)ヒPSC-CMの代表的な電界電位トレース。(F) パラメータがどのように分析されたかを示す電界電位トレースの模式図。省略形: FPD = フィールド電位期間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.活動電位の測定。(A)基底膜マトリックスコーティングおよびhiPSC-CM懸濁液を35mmディッシュに配置します。(B)単一のiPSC-CMの代表的な領域。スケールバー:20μm。 (C-E) パッチクランプシステムのセットアップ。(F)hiPSC-CMの代表的な活動電位トレース。(G)パラメータがどのように分析されたかを示す活動電位トレースの模式図。略語:APD =活動電位持続時間、MDP =最大拡張期電位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.Ca2+ 過渡の測定。 (a)Ca2+ イメージングシステム。(B)フラ-2負荷シングルhiPSC-CMの代表的な領域。スケールバー:100μm。 (C)代表的なCa2+ ヒPSC-CMの過渡痕跡。(D)パラメータがどのように分析されたかを示すCa2+ 過渡トレースの模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトiPS細胞技術は、疾患モデリングと薬物スクリーニングのための強力なプラットフォームとして登場しました。ここでは、hiPSC-CMの収縮性、電界電位、活動電位、およびCa2+過渡現象を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理学の包括的な特性評価を提供します。これらの機能アッセイは、我々のグループ12、13、18、24、25、26、27からの複数の出版物に適用されている。
良好なビート条件にあるhiPSC-CMを使用することが不可欠であり、そうしないと、読み出しの信号対雑音比が大幅に低下します。また、測定前に高純度のhiPSC-CMを確保することが望ましい。非心筋細胞の存在は、特に収縮運動と電界電位測定のデータ精度を損なう可能性があり、どちらもhiPSC-CM単層の形成を必要とします。さらに、hiPSC-CMの未熟さは、さまざまな分野でのhiPSC-CMの完全な適用を妨げる大きな懸念事項であり続けています28。hiPSC-CMは、形態、収縮性、電気生理学、Ca2+ 処理、代謝など、複数の面で機能的に未熟であることが知られています29。したがって、機能アッセイを行う前に、少なくとも30日目までhiPSC-CMを培養液に保持することをお勧めします。あるいは、hiPSC−CMの成熟度を改善するために確立された様々な戦略を、機能アッセイ30を実施する前に採用することができる。例えば、代謝成熟培地で培養されたhiPSC-CMは、通常のRPMI培地で培養されたhiPSC-CMと比較して、活動電位のMDPが非常に負であり、Ca2+ トランジェントの崩壊が有意に速い31を示した。最後に、hiPSC-CMのバッチ間のバリエーション32があります。したがって、データは、同じiPS細胞株の少なくとも3つの独立した分化から生成されたhiPSC-CMについて収集されるべきである。
細胞運動イメージングシステムは、hiPSC-CMの収縮および緩和運動を測定するためのハイスループットで効率的なプラットフォームを提供します。ただし、大きな欠点は、直接収縮力を測定するのではなく、収縮速度と緩和速度を測定することです。また、単分子膜を形成するhiPSC-CMの数が異なると速度は変化する。したがって、96ウェルプレートの各ウェルに正確に50,000個の細胞を播種することが重要です。
MEAによって測定されたFPDは、QT持続時間の代理として使用されており、したがって、薬物誘発性QT延長の評価に広く使用されています33。QT持続時間と同様に、FPDはビートレートに依存します。したがって、FPDデータを正確に解釈するには、ビートレートの補正が必要です。このプロトコルでは、MEA測定はメッキの少なくとも10日後に実行することをお勧めします。ただし、めっき後10日経っても電界電位信号が不安定な場合があります。このような場合は、hiPSC-CM培養をさらに2〜3日間延長してください。
パッチクランプ技術は、hiPSC-CMの電気生理学を評価し、イオンチャネルをアッセイするための汎用性の高いツールです。従来のパッチクランプの主な欠点は、その低スループット特性であり、高スループット研究への適用を妨げます。さらに、このテクニックの経験を積むには、長い学習曲線と広範な練習が必要です。しかし、従来のパッチクランプ技術は、依然としてhiPSC-CMの電気生理学を理解するためのゴールドスタンダードと見なされています。hiPSC-CMのAPDをハイスループットに評価する必要がある場合は、活動電位2(ASAP2)2の加速センサーを使用したhiPSC-CM活動電位の光学イメージングから始めることも提案されています21。一次標的が得られた後、従来の活動電位を、より正確な表現型および検証のためのさらなる研究に使用することができる。さらに、自動パッチクランプは、さまざまな分野、特にチャネルパシーでますます採用されています。例えば、hERGチャネルおよび電位依存性ナトリウムチャネルの複数の変形によって運ばれるイオンチャネル電流は、自動パッチクランプ34、35、36、37によって特徴付けられている。さらに、hiPSC-CMにおける自動パッチクランプの使用は最近確立されています38,39。自動パッチクランプの実行については、読者は以前に公開されたプロトコル40を参照することができる。高スループットと機械の取り扱いのシンプルさという利点により、自動パッチクランプが創薬と医薬品開発においてますます重要な役割を果たすことは間違いありません。
レシオメトリックCa2+感受性色素Fura-2を使用することで、hiPSC-CMの拡張期Ca2+の測定は、色素の装填時間、色素分布の不均一、光退色などの実験バイアス要因の影響をはるかに少なくすることができます。これは、特定の心臓病の拡張期機能障害を再現するために重要です。主な制限は、共焦点顕微鏡と互換性がない可能性のあるUV励起光源を必要とすることです。
要約すると、医薬品開発の前臨床段階における心毒性評価の最近の進歩にもかかわらず、心毒性は依然として主要な安全性の懸念事項の1つです。標準的な前臨床安全性評価プロセスへのhiPSC-CMの組み込みの増加は、候補化合物の毒性予測の精度を向上させる可能性があります。さらに、患者固有のhiPSC-CMは、パーソナライズされた心臓薬の選択と副作用の予測を可能にします。ここで説明するさまざまな機能アッセイを使用するプロトコルは、薬物スクリーニングおよび疾患モデリングにおけるhiPSC-CMのアプリケーションを拡大するのに役立ちます。
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Disclosures
J.C.W.はGreenstone Biosciencesの共同創設者ですが、ここで紹介する研究は完全に独立しているため、競合する利害関係はありません。他の著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
原稿を校正してくれたブレイク・ウーに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 HL113006、R01 HL141371、R01 HL163680、R01 HL141851、U01FD005978、NASA NNX16A069A(JCW)、およびAHAポスドクフェローシップ872244(GMP)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
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