Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.

Abstract

Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.

Introduction

Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Нынешняя парадигма оценки сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от животных моделей. Тем не менее, видовые различия от использования животных моделей все чаще признаются в качестве основной причины неточных прогнозов лекарственно-индуцированной кардиотоксичности у пациентов с человеческими заболеваниями4. Например, морфология потенциала сердечного действия существенно различается между людьми и мышами из-за вклада различных реполяризующих токов5. Кроме того, дифференциальные изоформы сердечного миозина и круговых РНК, которые могут влиять на физиологию сердца, были хорошо задокументированы среди видов 6,7. Чтобы восполнить эти пробелы, необходимо создать надежную, эффективную и основанную на человеке модель доклинической оценки сердечной безопасности.

Новаторское изобретение технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) создало беспрецедентные платформы для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. За последнее десятилетие методы получения индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали хорошо известными 8,9. hiPSC-CMs привлекли большой интерес к их потенциальному применению в моделировании заболеваний, скрининге кардиотоксичности, вызванном лекарственными средствами, и прецизионной медицине. Например, hiPSC-CM были использованы для моделирования патологических фенотипов сердечных заболеваний, вызванных генетическим наследованием, таких как синдром удлиненного интервала QT10, гипертрофическая кардиомиопатия 11,12 и дилатационная кардиомиопатия 13,14,15. Следовательно, были выявлены ключевые сигнальные пути, участвующие в патогенезе сердечных заболеваний, которые могут пролить свет на потенциальные терапевтические стратегии эффективного лечения. Кроме того, hiPSC-CMs использовались для скрининга лекарственно-индуцированной кардиотоксичности, связанной с противоопухолевыми агентами, включая доксорубицин, трастузумаб и ингибиторы тирозинкиназы 16,17,18; изучаются стратегии смягчения результирующей кардиотоксичности. Наконец, генетическая информация, хранящаяся в hiPSC-CM, позволяет проводить скрининг и прогнозировать медикаментозную кардиотоксичность как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях19,20. В совокупности hiPSC-CM оказались бесценным инструментом для персонализированного прогнозирования сердечной безопасности.

Общей целью этого протокола является разработка методологий для всестороннего и эффективного исследования функциональных характеристик hiPSC-CMs, которые имеют большое значение для применения hiPSC-CM для моделирования заболеваний, скрининга кардиотоксичности, вызванного лекарственными средствами, и прецизионной медицины. Здесь мы подробно описываем массив функциональных анализов для оценки функциональных свойств hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция (Ca2+) (рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка носителей и решений

  1. Подготовьте поддерживающую среду hiPSC-CM, смешав бутылку объемом 10 мл добавки 50x B27 и 500 мл среды RPMI 1640. Храните среду при температуре 4 °C и используйте ее в течение месяца. Уравновешивайте среднюю температуру до комнатной температуры (RT) перед использованием.
  2. Подготовьте посадочную среду hiPSC-CM, смешав 20 мл сыворотки и 180 мл поддерживающей среды hiPSC-CM (10% разбавление, v/v). В то время как свежеприготовленная посадочная среда является предпочтительной, ее можно хранить при 4 °C не более 2 недель. Уравновешивайте среду до RT перед использованием.
  3. Готовят раствор для покрытия внеклеточного матрикса путем размораживания одного флакона (10 мл) матрицы базальной мембраны при 4 °C в течение ночи и аликвотирования 500 мкл матрицы базальной мембраны в стерильных трубках объемом 1,5 мл. Хранить при -20 °C для дальнейшего использования. Смешайте 500 мкл матрицы базальной мембраны и 100 мл ледяной среды DMEM/F12 (разбавление 1:200, v/v) для получения раствора для покрытия фундаментной мембраны.
  4. Готовят 50 мл раствора Тирода, содержащего 135 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2, 5 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4 с naOH. Приготовьте свежий раствор Тирода в день эксперимента.
  5. Готовят 50 мл внутриклеточного пипеточного раствора, содержащего 120 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ EGTA и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью KOH. Аликвотируют внутриклеточный раствор пипетки в стерильных пробирках по 5 мл и хранят при -20 °С. В день эксперимента заново добавляют MgATP в раствор для достижения конечной концентрации 3 мМ.
  6. Готовят 1 мл Фура-2 АМ загрузочного раствора, содержащего 2 мкМ Фура-2 АМ и 0,1% Плуронический F-127. Приготовьте свежий погрузочный раствор в день эксперимента и защитите его от света.

2. Измерение движения сжатия hiPSC-CM

  1. Готовят пластины с матричным покрытием базальной мембраны, добавляя 100 мкл раствора внеклеточного матрикса в каждую скважину из 96-луночных пластин. Инкубируйте 96-луночные пластины в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Ферментативная диссоциация hiPSC-CM
    1. Запросите hiPSCs в Стэнфордском сердечно-сосудистом институте iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Генерация hiPSC-CM согласно предыдущим публикациям 8,9. Наблюдайте за hiPSC-CM, культивируемыми в шестилуночных пластинах под микроскопом при 10-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не диссоциируйте клетки, когда они все еще пролиферативны. В противном случае клетки перерастут на скважинах после повторного покрытия и приведут к неточным результатам функциональных анализов. Обычно hiPSC-CM останавливают пролиферацию на 18-23 день.
    2. Убедитесь, что hiPSC-CM сильно бьются и имеют чистоту более 95%. Оценивают чистоту путем иммуноокрашивания против сердечного тропонина Т, специфического маркера кардиомиоцитов 8,9.
    3. Аспирируйте поддерживающую среду и дважды промывайте клетки 1x DPBS. Добавляют 1 мл раствора клеточного отслоения в каждую лунку шестилуночных пластин и инкубируют в течение 10 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации должна регулярно контролироваться. Убедитесь, что клетки не перевариваются, так как это снизит жизнеспособность клеток.
    4. Осторожно пипетку hiPSC-CM вверх и вниз несколько раз, используя пипетку 5 мл, чтобы создать одноэлементную суспензию. Добавьте равный объем посевной среды hiPSC-CMs для нейтрализации раствора отслоения клеток.
    5. Центрифуга hiPSC-CMs при 300 х г в течение 3 мин при RT. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать ячейку гранулы в 1-2 мл посевной среды hiPSC-CM.
    6. Количественно оцените плотность и жизнеспособность клеток с помощью метода исключения трипан-синего цвета. Вкратце смешайте 10 мкл клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего цвета, переведите на слайд подсчета клеток, а затем подсчитайте с помощью счетчика клеток, как описано ранее21.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите раствор покрытия внеклеточного матрикса с 96-луночных пластин.
    2. Посейте 50 000 клеток на лунку в 100 мкл посевной среды hiPSC-CM и поместите 96-луночные пластины в увлажненный инкубатор клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2 на ночь.
    3. Замените посевную среду hiPSC-CM на 100 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня до записи.
  4. Сбор данных
    1. Измерьте движение сокращения hiPSC-CM не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется).
    2. Включите регулятор температуры и установите 37 °C в качестве предпочтительной температуры. Включите микроскоп, камеру и источник питания CO2 .
    3. Наполните водяную рубашку держателя пластины соответствующим количеством стерильной деионизированной воды (рисунок 2А). Поместите 96-луночную пластину на держатель пластины и дайте ячейкам акклиматизироваться в течение не менее 5 минут.
    4. Откройте программное обеспечение для просмотра, установите частоту кадров камеры на 75 кадров в секунду (fps) и разрешение видео / изображения на 1024 × 1024 пикселей. Примените функции автофокусировки и автояркости. Запись видео и изображений hiPSC-CM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вибрации стола микроскопа во время записи.
    5. Откройте программное обеспечение анализатора для автоматического анализа.

3. Измерение потенциала поля hiPSC-CM

  1. Подготовка пластин с матричным покрытием из базальной мембраны
    1. Осторожно поместите каплю 8 мкл раствора внеклеточного матричного покрытия на площадь регистрирующего электрода каждой скважины пластин 48-луночного микроэлектродного массива (MEA). См. рисунок 3А для соответствующей области электрода для размещения капель. Этот шаг имеет решающее значение для сохранения монослоя hiPSC-CM, сосредоточенного на электродах. Избегайте прикосновения к электродам в любых обстоятельствах.
    2. Добавьте 3 мл стерильной деионизированной воды в область, окружающую скважины (рисунок 3А) плит MEA из 48 скважин, чтобы предотвратить испарение раствора покрытия. Инкубируют 48-луночные МЭА-пластины в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение 45-60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте слишком долго, чтобы предотвратить высыхание матрицы базальной мембраны.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите большую часть среды внеклеточного матрикса с поверхности скважины, не касаясь электродов, используя наконечник пипетки 200 мкл в пределах одного ряда или столбца.
    2. Посеять 50 000 клеток на скважину в каплю посевной среды hiPSC-CM объемом 8 мкл над площадью регистрирующего электрода каждой скважины одного ряда или столбца.
    3. Повторяйте последние два шага до тех пор, пока все колодцы не будут покрыты ячейками. Проверьте под микроскопом, что все скважины имеют суспензию hiPSC-CM. Желаемую плотность см. на рисунке 3B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Присоединение hiPSC-CM будет скомпрометировано, если матрица базальной мембраны полностью высохнет, что сделает присоединение клеток неоптимальным.
    4. Инкубируйте 48-луночные пластины MEA в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение 60 мин.
    5. Медленно и осторожно добавляйте 150 мкл посевной среды hiPSC-CM в каждую лунку 48-луночных пластин MEA. Чтобы добавить среду без диспергирования ранее засеянных hiPSC-CM, держите пластину под углом 45°, прислоните кончик пипетки к стенке каждой скважины и медленно отпустите среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление среды слишком быстро или с высоким давлением вытеснит прилипшие кардиомиоциты. Избегайте прямого контакта с каплевидной подвеской hiPSC-CM.
    6. Инкубируйте 48-луночные пластины MEA в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
    7. Обновите посадочную среду hiPSC-CM 300 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполняйте измерение МЭА не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). На 10 день после нанесения покрытия проверьте плотность спонтанного биения монослоя hiPSC-CM под микроскопом при 10-кратном увеличении, которое должно быть таким, как показано на рисунке 3C.
    2. Поместите 48-луночную пластину MEA в записывающий инструмент. Сенсорный экран позволяет наблюдать температуру (37 °C) и состояние CO2 (5%).
    3. Откройте программное обеспечение навигатора. В окне экспериментальной настройки выберите Конфигурация сердца в реальном времени и Записи потенциала поля. Применяйте спонтанные или темповые конфигурации биения.
    4. В параметрах обнаружения биения установите порог обнаружения 300 мкВ, минимальный период биения - 250 мс, а максимальный период биения - 5 с. Выберите Полиномиальная регрессия для вычисления длительности потенциала поля (FPD).
    5. Проверьте, является ли базовый сигнал электрической активности зрелым и стабильным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелые формы сигналов, регистрируемые каждым электродом с многолуночной пластины MEA, должны отражать потенциал сердечного поля с легко идентифицируемыми характеристиками, совпадающими со всплеском деполяризации сердца и фазой реполяризации, как показано на рисунке 3D-F.
    6. Приобретайте базовую сердечную деятельность в течение 1-3 мин. Если требуется медикаментозное лечение, добавляют соединения в лунки после базовой регистрации. Поместите пластину в инкубатор не менее чем на 30 минут до следующей записи.

4. Измерение потенциала действия hiPSC-CM

  1. Готовят посуду с матричным покрытием из базальной мембраны, помещая 500 мкл раствора внеклеточного матриксного покрытия на стеклянно-нижнюю часть посуды диаметром 35 мм (рисунок 4А). Инкубируйте 35-миллиметровые чашки в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Снимите раствор покрытия внеклеточного матрикса с посуды толщиной 35 мм. Посейте 50 000 клеток на лунку в 500 мкл посевной среды hiPSC-CM на стеклянной нижней части посуды 35 мм.
    2. Инкубируйте 35-миллиметровые чашки в увлажненном инкубаторе клеточных культур при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи. Удалите посадочную среду hiPSC-CM и добавьте 2 мл поддерживающей среды hiPSC-CM на посуду диаметром 35 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется положить нефильтрованный наконечник объемом 200 мкл на аспирационную пипетку объемом 2 мл, чтобы удалить отработанную среду, чтобы избежать прикосновения к клеткам.
    3. Меняйте культурную среду hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполняйте измерение потенциала действия не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). Приготовьте свежий раствор Tyrode, как описано в шаге 1.4. Разморозить одну аликвоту внутриклеточного раствора пипетки и заново добавить MgATP до конечной концентрации 3 мМ.
    2. Вытащите микропипетки из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительным является сопротивление 2-5 МОм микропипетт.
    3. Замените поддерживающую среду hiPSC-CM раствором Tyrode и позвольте ячейкам акклиматизироваться к раствору Tyrode в течение 15 минут (рисунок 4C). Вставьте датчики температуры в камеру, поместите 35-миллиметровую чашку в камеру, как показано на рисунке 4C, и отрегулируйте температуру до 37 °C (рисунок 4D).
    4. Заполните микропипетки внутриклеточным раствором и вставьте их в держатель, соединенный с патч-зажимным усилителем головной ступени (рисунок 4Е). Откройте программное обеспечение для стимуляции/сбора, загрузите протокол записи потенциала действия и выберите конфигурацию напряжения-зажима.
    5. Вставьте микропипетку в раствор для ванны, выберите соответствующие одиночные hiPSC-CM, а также отрегулируйте и опустите положение микропипетки рядом с выбранной ячейкой с помощью микроманипулятора. Когда наконечник пипетки вставлен в раствор ванны, проверьте сопротивление пипетки, которое можно наблюдать на мониторе осциллографа.
    6. Расположите пипетку близко к ячейке, и импульсы тока немного уменьшатся, чтобы отразить растущее сопротивление уплотнения. Применяют мягкое всасывание с отрицательным давлением для увеличения сопротивления, которое будет образовывать гигазеал. Примените функцию Уплотнение .
    7. Примените дополнительное всасывание, чтобы сломать мембрану, чтобы получить конфигурацию записи всей клетки. Как только мембранная часть в области пипетки разрывается путем всасывания, внутренний раствор находится в равновесии с цитоплазмой клетки. На этом этапе переключитесь из режима зажима напряжения (V-зажим) в режим тока-зажима или без впрыска тока (C-Clamp) с помощью диалогового окна усилителя. Нажмите кнопку Запись , чтобы создать и сохранить файлы записи потенциального действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение режима обеспечивает непрерывную запись потенциалов спонтанного действия hiPSC-CM с помощью протокола записи без триггера и без стимуляции, который можно контролировать на выходе V-mon усилителя патч-зажима.

5. Измерение переходного процесса hiPSC-CM Ca2+

  1. Обратитесь к предыдущему протоколу для подготовки индивидуальных клеточных камер для визуализации Ca2+ 21. Для приготовления клеточной камеры с матричным покрытием базальной мембраны поместите в клеточные камеры 200 мкл раствора внеклеточного матриксного покрытия. Инкубируют клеточные камеры в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Выполните ферментативную диссоциацию hiPSC-CM, как описано в шаге 2.2.
  3. Посев hiPSC-CM
    1. Удалите раствор покрытия внеклеточного матрикса из клеточных камер. Посейте 20 000 клеток на лунку в 200 мкл посевной среды hiPSC-CM.
    2. Замените посевную среду hiPSC-CM на 200 мкл поддерживающей среды hiPSC-CM через 1 день после нанесения покрытия. Меняйте носитель обслуживания hiPSC-CM каждые 2 дня перед записью.
  4. Сбор данных
    1. Выполните переходное измерение Ca2+ не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия (рекомендуется). Приготовьте свежий раствор Tyrode, как описано в шаге 1.4. Приготовьте свежий загрузочный раствор Fura-2 AM, как описано в шаге 1.6.
    2. Аспирировать среду технического обслуживания hiPSC-CM и дважды промыть раствором Tyrode. Применяют 100 мкл раствора Фура-2 АМ и инкубируют в течение 10 мин при РТ.
    3. Замените загрузочный раствор Fura-2 AM раствором Tyrode и подождите не менее 5 минут для полной деэтерификации Fura-2 AM.
    4. Добавьте каплю погружного масла на 40-кратный объектив перевернутого эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного 40-кратным масляным погружным объективом (0,95 NA). Поместите клеточную камеру в сценический адаптер микроскопа (рисунок 5А).
    5. Установите провода регулятора температуры в камеру ванны и установите ее на 37 °C. Установите электроды для стимуляции электрического поля и установите импульсы на частоту 0,5 Гц с длительностью 20 мс.
    6. Включите сверхскоростной источник света с переключением длин волн и установите его в режим быстрого переключения 340 нм и 380 нм в соответствии с инструкциями прибора.
    7. Примените время экспозиции 20 мс для обеих длин волн и время записи 20 с в программном обеспечении. Запишите видео, отражающее изменения в реальном времени переходного периода Ca2+ в hiPSC-CM. Экспортируйте данные в электронную таблицу и проанализируйте данные, какописано ранее 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает, как измерить движение сжатия, потенциал поля, потенциал действия и переходный процесс Ca2+ hiPSC-CM. Принципиальная схема, включающая ферментативное пищеварение, посев клеток, поддержание и проведение функционального анализа, показана на рисунке 1. Образование монослоя hiPSC-CM необходимо для измерения движения сжатия (рисунок 2B). Репрезентативный след сжимающе-релаксационного движения hiPSC-CM показан на рисунке 2C. Программное обеспечение анализатора позволяет автоматически анализировать следы движения сокращения-релаксации, обнаруживая начало сокращения, пик сокращения, конец сокращения, пик релаксации и конец релаксации с использованием настроек по умолчанию (рисунок 2D). Скорости сжатия и пики релаксации используются для оценки способности к сокращению и релаксации hiPSC-CM. Кроме того, также могут быть получены расстояния деформации сжатия и релаксации.

Анализ MEA представляет собой внеклеточную регистрацию потенциалов действия, известных как полевые потенциалы. Успешное измерение потенциалов поля требует полного покрытия монослоя hiPSC-CM на всех электродах в пределах каждой скважины пластин MEA (рисунок 3C). Зрелые формы сигналов, регистрируемые каждым электродом, должны отражать потенциал сердечного поля с легко идентифицируемыми характеристиками, как показано на рисунке 3D-F. Указанными стандартами качества являются: 1) базовая активность должна демонстрировать спонтанное биение в пределах 20-90 ударов в минуту, 2) скорость биения должна быть в пределах 6 СД, рассчитанных для базовой скорости биения на всех скважинах, 3) коэффициент изменения периода биения должен быть менее 5% и 4) амплитуда деполяризации должна быть свыше 0,3 мВ, как было опубликованоранее 22. На рисунке 3E показаны репрезентативные полевые потенциальные следы hiPSC-CM. Программное обеспечение навигатора автоматически обнаруживает и идентифицирует удары и FPD. После анализа можно получить период биения, ФПД и амплитуду шипа (рисунок 3F). В частности, период биения определяется деполяризующим интервалом от пика до пика, FPD определяется интервалом между пиком деполяризации и пиком реполяризации, а амплитуда шипа измеряется расстоянием между деполяризующим положительным пиком до отрицательного пика, как показано на рисунке 3F.

Одноклеточный пластырь является золотым стандартом оценки электрофизиологических свойств hiPSC-CMs (рисунок 4B). Записи цельноклеточных зажимов в режиме зажима тока могут регистрировать спонтанные потенциалы действия одиночных hiPSC-CM (рисунок 4F). После анализа можно получить несколько параметров, включая амплитуду, максимальный диастолический потенциал (MDP) и продолжительность потенциала действия (APD) при реполяризации 30%, 50% и 90%.

Для визуализации Ca2+ изменения интенсивности флуоресценции отдельных hiPSC-CM с течением времени могут быть записаны программным обеспечением. Репрезентативная область HiPSC-CM, нагруженных Fura-2, показана на рисунке 5B. Использование сверхскоростного источника света с переключением по длине волны позволяет записывать переходные процессы Ca2+ из сотен hiPSC-CM с помощью сканирования в кадровом режиме. После анализа с помощью программы23 на основе электронных таблиц можно получить соотношение F340/F380 с течением времени для каждой ячейки. Затем могут быть нанесены необработанные следы стимулированных переходных процессов Ca2+ (рисунок 5C). Кроме того, могут быть получены такие параметры, как амплитуда, диастолический Ca2+ и Ca2+ распада тау (рисунок 5D).

Figure 1
Рисунок 1. Общая принципиальная схема протокола. На 0-й день переваривайте и вымешивайте hiPSC-CM на 96-луночных пластинах с покрытием из фундаментной мембраны/48-луночных пластинах MEA/тарелках/клеточных камерах диаметром 35 мм. Обеспечьте период восстановления не менее 10 дней перед выполнением функциональных анализов с использованием системы визуализации движения клеток, MEA, патч-зажима и системы визуализации Ca2+ . Сокращения: MEA = микроэлектродный массив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Измерение сжимающего движения. (A) Система визуализации движения клеток. (B) Репрезентативная область монослоя hiPSC-CM. Шкала: 20 мкм. (C) Репрезентативные следы сокращения-релаксации hiPSC-CM. (D) Принципиальная диаграмма следа сокращения-релаксации, показывающая начало сокращения, пик сокращения, конец сокращения, пик релаксации и конец релаксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Измерение потенциала поля. (A) Вид сверху (слева) 48-луночной пластины MEA, (средней) одной скважины с 16 электродами и (справа) области, которую должна покрыть матрица-капля базальной мембраны. Добавьте достаточное количество дистиллированной воды в резервуар для воды, чтобы восполнить испарение. (B) суспензия hiPSC-CM и желаемая плотность после повторного покрытия. (C) Репрезентативная область монослоя hiPSC-CM. (D) Графики непрерывной формы сигнала от 16 электродов в одной скважине 48-луночной пластины MEA. (E) Репрезентативные полевые потенциальные следы hiPSC-CM. (F) Принципиальная схема трассировки потенциала поля, показывающая, как анализировались параметры. Аббревиатура: FPD = потенциальная длительность поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Измерение потенциала действия. (A) Покрытие матрицы базальной мембраны и размещение суспензии hiPSC-CMs на посуде диаметром 35 мм. (B) Репрезентативный регион с едиными hiPSC-CM. Шкала: 20 мкм. (C-E) Установка патч-зажимной системы. (F) Репрезентативные следы потенциальных действий hiPSC-CM. (G) Принципиальная схема трассировки потенциала действия, показывающая, как анализировались параметры. Сокращения: APD = длительность потенциала действия, MDP = максимальный диастолический потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Измерение переходного периода Ca2+ . (A) Система визуализации Ca2+ . (B) Репрезентативный регион Фура-2 с одной HiPSC-CM. Шкала: 100 мкм. (C) Репрезентативные Ca2+ переходные следы hiPSC-CM. (D) Принципиальная схема переходной трассировки Ca2+ , показывающая, как анализировались параметры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную характеристику сократимости hiPSC-CM и электрофизиологии. Эти функциональные анализы были применены в нескольких публикациях из нашей группы 12,13,18,24,25,26,27.

Важно использовать hiPSC-CM, которые находятся в хороших условиях биения, иначе отношение сигнал/шум считываний резко снизится. Кроме того, желательно обеспечить высокую чистоту hiPSC-CM перед измерениями. Существование некардиомиоцитов может особенно поставить под угрозу точность данных измерений движения сокращения и потенциала поля, которые требуют образования монослоя hiPSC-CM. Кроме того, незрелость hiPSC-CM остается серьезной проблемой, которая препятствует полному применению hiPSC-CM в различных областях28. Известно, что hiPSC-CM функционально незрелы во многих аспектах, включая морфологию, сократимость, электрофизиологию, обработку Ca2+ и метаболизм29. Поэтому рекомендуется хранить hiPSC-CM в культуре по крайней мере до 30 дня, прежде чем выполнять функциональные анализы. В качестве альтернативы, различные стратегии, которые были созданы для повышения зрелости hiPSC-CM, могут быть приняты до проведения функциональных анализов30. Например, hiPSC-CM, культивируемые в средах метаболического созревания, демонстрировали крайне отрицательный MDP потенциалов действия и значительно более быстрый распад переходных процессов Ca2+ по сравнению с hiPSC-CM, культивируемыми в нормальной среде RPMI31. Наконец, существуют пособные варианты hiPSC-CM32. Таким образом, данные должны собираться на hiPSC-CM, генерируемых по крайней мере из трех независимых дифференциаций одних и тех же линий iPSC.

Система визуализации движения клеток обеспечивает высокую пропускную способность и эффективную платформу для измерения сокращения и релаксационного движения hiPSC-CM. Однако основным недостатком является то, что он не измеряет прямую сократительную силу, а скорее скорость сжатия и релаксации. Кроме того, скорости варьируются, когда количество hiPSC-CM для формирования монослоя различно. Поэтому крайне важно засеять ровно 50 000 клеток в каждую скважину из 96-луночных пластин.

ФПД, измеренный MEA, использовался в качестве суррогата в течение продолжительности QT и, таким образом, широко используется для оценки лекарственно-индуцированного удлинения QT33. Как и продолжительность QT, FPD зависит от скорости биения. Поэтому коррекция скорости биения необходима для точной интерпретации данных FPD. В этом протоколе рекомендуется, чтобы измерение MEA проводилось не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия. Однако иногда возможно, что сигнал потенциала поля все еще нестабилен после 10 дней после покрытия. Если это произошло, продлите культуру hiPSC-CM еще на 2-3 дня.

Метод патч-зажима является универсальным инструментом для оценки электрофизиологии hiPSC-CM и анализа ионных каналов. Основным недостатком обычного патч-зажима является его низкопроизводительное свойство, которое препятствует его применению в исследованиях с высокой пропускной способностью. Кроме того, это требует длительной кривой обучения и обширной практики, прежде чем можно будет получить опыт в этой технике. Тем не менее, традиционная техника зажимов по-прежнему считается золотым стандартом для понимания электрофизиологии hiPSC-CM. Если APD hiPSC-CM необходимо оценить с высокой пропускной способностью, также предлагается начать с оптической визуализации потенциала действия hiPSC-CM с использованием ускоренного датчика потенциалов действия 2 (ASAP2)21. После получения первичных мишеней традиционный потенциал действия может быть использован в дальнейших исследованиях для более точного фенотипирования и валидации. Кроме того, автоматизированный зажим пластыря все чаще используется в различных областях, особенно в каналопатии. Например, токи ионных каналов, переносимые несколькими вариантами каналов hERG и натриевыми каналами с напряжением, характеризуются автоматическим зажимом 34,35,36,37. Кроме того, использование автоматизированного патч-зажима в hiPSC-CM было установлено недавно 38,39. Для выполнения автоматизированного зажима патча читатели могут обратиться к ранее опубликованным протоколам40. С преимуществами высокой пропускной способности и простоты в обращении с машиной, нет никаких сомнений в том, что автоматизированные зажимы для пластырей будут играть все более и более важную роль в открытии лекарств и разработке лекарств.

Использование ратиометрического Ca2 + чувствительного красителя, Fura-2, позволяет измерять диастолический Ca2 + hiPSC-CMs гораздо меньше влиять на экспериментальные факторы смещения, такие как время загрузки красителя, неравномерное распределение красителя и фотоотбеливание. Это важно для повторения диастолической дисфункции конкретных сердечных заболеваний. Основным ограничением является то, что для этого требуется источник света УФ-возбуждения, который может быть несовместим с конфокальной микроскопией.

Таким образом, несмотря на недавний прогресс в оценке кардиотоксичности на доклинической фазе разработки препарата, кардиотоксичность остается одной из ведущих проблем безопасности. Растущее включение hiPSC-CM в стандартный доклинический процесс оценки безопасности может повысить точность прогнозирования токсичности соединений-кандидатов. Кроме того, hiPSC-CMs для конкретного пациента позволяют персонализировать выбор сердечных препаратов и прогнозировать неблагоприятный ответ на лекарства. Протокол, использующий различные функциональные анализы, описанные здесь, поможет расширить применение hiPSC-CM в скрининге лекарств и моделировании заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. является соучредителем Greenstone Biosciences, но не имеет конкурирующих интересов, поскольку представленная здесь работа полностью независима. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Tags

Медицина выпуск 186
Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter