Summary
Her beskriver vi en protokol til isolering af en tilstrækkelig mængde enkelte ikke-kardiomyocytter med høj levedygtighed fra et musehjerte efter myokardieinfarkt (MI). Dette kan bruges til efterfølgende enkeltcellesekventering, flowcytometrianalyse og primær cellekultur.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) er en af de mest almindelige hjerte-kar-sygdomme med stigende dødelighed over hele verden. Ikke-kardiomyocytter tegner sig for mere end halvdelen af den samlede hjertecellepopulation, og de bidrager til adaptive kompensationer ved myokardieskade, herunder inflammatoriske reaktioner, vævsreparation og ardannelse. For at studere post-MI hjertemikromiljøet anvendes enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) i vid udstrækning til at identificere forskellige hjertecelletyper og intercellulær kommunikation. Blandt procedurerne for forberedelse af scRNA-seq-prøver er forberedelse af cellesuspensionen et af de mest kritiske trin, fordi cellelevedygtigheden kan påvirke kvaliteten af scRNA-seq-resultaterne. Derfor designede vi en eksperimentel protokol til fremstilling af en ikke-kardiomyocytcellesuspension fra post-MI musehjerter med ekstra fokus på at forbedre cellelevedygtigheden ved at vælge milde fordøjelsesenzymer, kontrollere fordøjelsestiden og anvende fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Endelig isolerede vi CD45+ celler fra den ikke-kardiomyocytcellesuspension opnået gennem denne protokol, og derefter udførte vi scRNA-seq.
Introduction
Myokardieinfarkt (MI) er en af de mest almindelige hjerte-kar-sygdomme, og dens dødelighed stiger over hele verden1. MI er forårsaget af utilstrækkelig blodtilførsel til det omgivende myokardium, hvilket kan være et resultat af en koronararterieblokering, der opstår med aterosklerotisk plaquebrud. Selvom perkutan koronar intervention (PCI) har reduceret dødeligheden hos akutte MI-patienter, er den høje forekomst af hjertesvigt efter MI fortsat et problem2. Den vigtigste patofysiologi, der ligger til grund for hjertesvigt efter MI, er kroppens kompenserende reaktion på hjerteskader, hvilket indebærer at erstatte den døde hjertemuskel med ikke-kontraktile fibrotiske ar. Disse adaptive reaktioner er signifikant afhængige af lokal inflammation medieret af interaktionerne mellem flere celletyper og hjertevævsceller, og denne betændelse betragtes nu som et potentielt terapeutisk mål for at reducere fibrotisk ardannelse og dermed beskytte mod hjertesvigt efter MI 3,4. Interessant nok oplever mikromiljøet på infarktstedet en tidsafhængig overgang i de infiltrerende celletyper og funktioner på forskellige stadier af MI 1,5. Mange undersøgelser har vist, at ikke-kardiomyocytter (f.eks. Immunceller, fibroblaster og endotelceller) spiller centrale roller i post-MI-betændelse og vævsreparation 5,6. I de senere år er enkeltcellesekventering blevet brugt i vid udstrækning som et kraftfuldt værktøj til belysning af involvering og funktioner af ikke-kardiomyocytter i post-MI mikromiljøet 7,8. Dette giver indsigt i patofysiologien af post-MI skade og reparation og udviklingen af potentielle terapier mod post-MI hjertesvigt.
High-throughput RNA-sekventering (RNA-Seq) er en teknik, der bruges til at studere hele transkriptomer i detaljer ved hjælp af næste generations sekventering (NGS)7,8,9. For nylig har udviklingen af scRNA-Seq revolutioneret det biomedicinske forskningsfelt. Sammenlignet med konventionel bulksekventering analyserer scRNA-Seq genekspressionsprofiler og transkriptionel heterogenitet på enkeltcelleniveau 7,8. Denne teknik fremmer signifikant forskningen i den cellulære patofysiologi af MI 9,10 ved at identificere forskellige cirkulerende celletyper i mikromiljøet efter MI og afdække interaktionen mellem kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter. Disse resultater bidrager yderligere til at afdække nye terapeutiske mål for hjertesvigt efter MI. Generelt omfatter det scRNA-seq-baserede post-MI-eksperiment tre hovedafsnit: (1) etablering af post-MI dyremodel; 2) fremstilling af cellesuspensionen og (3) prøvesekventering og dataanalyse. Det er bemærkelsesværdigt, at forberedelse af cellesuspensionen er det mest kritiske trin i forberedelsen af scRNA-Seq-eksperimentet, fordi kvaliteten af cellesuspensionen bestemmer nøjagtigheden af resultaterne.
Denne protokol er designet til at ekstrahere en ikke-kardiomyocytcellesuspension fra post-MI hjertevævet; Det er vigtigt, at de specifikke detaljer for opretholdelse af cellelevedygtighed og opløsning er inkluderet. I mellemtiden kan det udstyr, der anvendes i denne protokol, såsom kirurgiske sæt til mus, gnaverventilatorer og centrifuger, findes i de fleste dyreforsøgscentre og biomedicinske laboratorier, og eksperimentomkostningerne ved denne protokol er således relativt lave. Hvis man betragter tidspunkter og infarktsteder som variabler, kan denne protokol desuden anvendes til at simulere en lang række kliniske scenarier, især for komplikationer efter MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr ved Zhejiang University og blev godkendt af Animal Advisory Committee ved Zhejiang University.
1. Venstre forreste nedadgående koronararterieligering (LAD ligation) kirurgi
BEMÆRK: Otte uger gamle C57BL/6J-hanmus blev brugt som modeller. Hjerterne blev høstet 2 uger efter MI. Venstre anterior faldende koronararterieligeringsoperation blev udført som tidligere beskrevet og demonstreret11.
- Desinficer de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol før operationen.
- Vej musen, og bedøm derefter musen med intraperitoneale injektioner af 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg). Overhold tåklemmerefleksen, og mål respirationsfrekvensen for at evaluere dybden af anæstesi under proceduren.
- Placer musen på operationsbordet med en 37 °C varmepude. Brug oftalmisk salve for at forhindre dehydrering af øjnene.
- Depilere dens venstre precordial bryst og hals med hårfjerningscreme, og brug vatpinde til at fjerne hår. Desinficere huden med iodofor, efterfulgt af 70% alkohol for at rengøre området tre gange.
- Udfør et midterlinie cervikalt snit (0,8-1,0 cm) under et mikroskop. Adskil hud, muskler og væv omkring luftrøret, og indsæt derefter en 20 G kanyle i luftrøret.
BEMÆRK: Overhold mens du indsætter kanylen i luftrøret under mikroskopisk visning for at sikre, at røret ikke indsættes i spiserøret. - Tilslut musen til en gnaverventilator indstillet til 0,2 ml tidevandsvolumen med 150 slag pr. Minut.
- Skær musebrystet skråt langs midtklavikulær linje med en steril saks. Disseker det subkutane væv for at udsætte ribbenene.
- Brug steril saks til at skære huden skråt langs venstre midterklavikulære linje (0,8-1,0 cm). Udfør venstre thoracotomi for at adskille tredje og fjerde ribben for at udsætte hjertet. Brug en rib retractor for et klart udsyn.
- Åbn perikardiet med buede tang, og liger derefter den venstre forreste nedadgående arterie (under venstre atriumvedhæng) ved hjælp af en 7-0 silkesutur. En bleg forreste væg i venstre ventrikel indikerer, at myokardieperfusionen afbrydes med succes.
- Slip ribbenretraktoren, og sy brystsnittet i lag med en 5-0 silkesutur, mens du udviser luft fra brystet. Sy halssnittet med en 5-0 sutur silkesutur.
- Fjern trakealrøret fra musen, når dens spontane vejrtrækning er genoprettet. Intraperitonealt injicere 0,5 ml forvarmet sterilt saltvand. Injicer buprenorphin (0,1 mg/kg) hver 12. time subkutant for at minimere smerter.
- Til sidst skal du placere musen på varmepuden for at vente på genoplivning. Overvåg musen for at sikre, at den ikke lider af overdreven dyspnø eller blødning via visuel observation.
- Sæt musen tilbage i buret, når den vågner. I den første uge skal du overvåge musen dagligt for at kontrollere, at dens mobilitet, pleje og spisevaner er tilstrækkelige. I henhold til eksperimentets behov høstes hjertet på forskellige tidspunkter efter MI.
BEMÆRK: I denne protokol blev enkeltcellesuspensionen fremstillet med hjertet 2 uger efter MI.
2. Fremstilling af hjerte-enkeltcellesuspension
- Fremstilling af opløsninger og medier
- Hjertevævsdissociationsbuffer: Bland 10 mg collagenase IV (600 E / ml), 5 mg dispase II (0,5 U / ml) og 50 μL DNase I (100 μg / ml) i 5 ml RPMI 1640. Dette medium forvarmes til 37 °C i vandbad før brug.
- Cellevaskebuffer: Forbered 1% BSA eller 10% FBS i fosfatbufret saltvand (PBS, PH 7.4), og opbevar ved 4 °C eller på is.
- Perfusionsopløsning: Forkølet PBS (PH 7.4) som perfusionsopløsning.
- Lysisbuffer for røde blodlegemer (RBC): Brug RBC-lysisbufferen som nævnt af producenten.
BEMÆRK: Se materialetabellen for listen over reagenser og udstyr, der anvendes i denne undersøgelse.
- Aflive musen med en intraperitoneal pentobarbitalnatrium (150 mg / kg) injektion.
- Hjerte dissektion
- Placer musen i liggende stilling ved at fastgøre bagbenene på plads med tape.
- Spray kroppen med 70% ethanol, og skær derefter lodret gennem mavehuden og musklerne, mens du undgår at gennembore leveren. Åbn forsigtigt brystkassen, mens du undgår at punktere hjertet.
- Brug den forkølede PBS (PH 7,4) til at perfusere venstre ventrikel, indtil den farveløse perfusionsvæske observeres (ca. 15 ml PBS [pH 7,4] er nødvendig).
- Løft forsigtigt hjertet fra brystkassen med tang, og skær det overskydende væv fastgjort til ydersiden af hjertet med oftalmisk saks. Anbring hjertet i 1 ml forkølet PBS (PH 7,4) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Enzymatisk dissociation af hjertevævet
- Overfør musehjertet til en brønd i en 24-brøndplade med 150 μL af hjertevævets dissociationsbuffer placeret på is, og skær den i små stykker (~ 1 mm) med en saks.
- Det hakkede hjertevæv overføres til et 15 ml centrifugerør med 5 ml af vævsdissociationsbufferen.
BEMÆRK: Det anbefalede buffervolumen for dissociation af hjertevæv er 5 ml/hjerte. - Centrifugerøret anbringes i den elektrisk termostatiske stempelryster ved 125 o/min i 1 time ved 37 °C. Pipetten vævssuspensionen op og ned 10 gange hvert 20. minut.
- Cellesuspensionen filtreres gennem en 70 μm cellesi for at fjerne ufordøjet væv og klumper. Tilsæt 25 ml af cellevaskebufferen for at skylle det originale rør, og overfør det derefter for at skylle cellesilen. Derefter filtreres cellesuspensionen gennem en 40 μm cellesil for yderligere at fjerne celleklumper.
- Den filtrerede cellesuspension centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og celleprøven resuspenderes derefter i 1x RBC-lysisbuffer i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes fire gange større volumen cellevaskebuffer, og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 10 ml cellevaskebuffer. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml cellevaskebuffer.
- 18 μL af cellesuspensionen blandes med 2 μL farvningsopløsning af acridinorange (AO)/propidiumiodid (PI) (9:1), og der tilsættes 10 μL af blandingen til et tællekammerglas. Evaluer cellenumrene og levedygtigheden ved hjælp af en automatisk celletæller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkeltcellesuspension med høj vitalitet blev opnået ved at implementere afsnit 2 i denne protokol. Imidlertid kunne cellefragmenter stadig observeres (figur 1A); derfor blev fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) udført for yderligere at forbedre kvaliteten16. Efter FACS reduceres den gennemsnitlige cellestørrelse fra 9,6 μm til 9,1 μm ( tabel 1), hvilket tyder på, at andelen af cellefragmenter effektivt kan reduceres i cellesuspensionen ved hjælp af FACS (figur 1B). Den gating-strategi, der anvendes til FACS, er vist i figur 1C.
Ud over billederne i figur 1 blev cellekoncentrationen, den gennemsnitlige cellestørrelse og cellelevedygtigheden målt af en celletæller (tabel 1). Forskellene i cellekoncentrationer skyldtes volumenet af cellesuspensionen. Mærkbart faldt den gennemsnitlige cellestørrelse efter FACS (tabel 1), hvilket viser, at FACS effektivt kan reducere celleklumpning og fjerne cellefragmenter.
ScRNA-seq blev udført for at studere det hjerteimmunologiske mikromiljø og samtidig verificere cellesuspensionskvaliteten opnået gennem denne protokol. Efter tilberedning af enkeltcellesuspensionen sorterede vi først de celler, der udtrykte overfladeprotein CD45, som er en fælles markør for en lang række immunceller. Dernæst udførte vi scRNA-seq på CD45+ celler ved hjælp af 10X Genomics platform17. På denne måde samlede vi 14.217 individuelle celler fra tre raske hjerteprøver i et fusioneret datasæt efter kvalitetskontrol (tabel 2). Den uovervågede klyngedannelse og reduktion i t-distribueret stokastisk naboindlejring (t-SNE) dimensionalitet viste en åbenlys adskillelse af syv typer immunceller (figur 2). Desuden viste hver immuncelletype et højt udtryk for klassiske markører. Afslutningsvis viser disse resultater, at enkeltcellesuspensionen fremstillet ved denne protokol har en høj styrke til enkeltcellesekventering.
Figur 1: Cellelevedygtighed i hjertets enkeltcellesuspension. (A) Cellelevedygtighed uden FACS. De sorte pilespidser angiver cellefragmenter (ingen fluorescens). (B) Celle levedygtighed med FACS. Den gule pil angiver levende celler (grøn fluorescens), og den røde pil angiver døde celler (rød fluorescens). (C) Gating strategi. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Enkeltcelle RNA-sekventering af hjerte-CD45+ celler fra tre musehjerteprøver. (A) tSNE plot af CD45+ celler, der viser immuncellepopulationerne identificeret baseret på kanoniske markørgener. (B) Heatmap over de fem mest differentieret udtrykte gener i hver delpopulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Før FACS | Efter FACS | |
| Total cellekoncentration (celler/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Koncentration af levende celler (celler/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Koncentration af døde celler (celler/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Levedygtighed (%) | 92.8 | 92.7 |
| Gennemsnitlig cellestørrelse (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabel 1: Hjerte-enkeltcelle suspension før og efter FACS. Celletæthederne af hjertets enkeltcellesuspension opnået før og efter FACS sammenlignes ved hjælp af en automatiseret celletæller.
| Skøn | |
| Anslået antal celler | 14,217 |
| Gennemsnitlige læsninger pr. celle | 81,017 |
| Mediangener pr. celle | 1,374 |
| Samlet antal gener opdaget | 18,424 |
| Median UMI-tal pr. celle | 4,021 |
| Gyldige stregkoder | 98.4% |
| Læser kortlagt til genom | 95.1% |
Tabel 2: Kvalitetskontrolstatistikker. Tabellen viser de forskellige estimater af enkeltcelledata for sunde musehjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel havde til formål at beskrive en protokol til isolering af enkelte ikke-kardiomyocytter fra musehjerter efter MI. Protokollen kan anvendes til at isolere forskellige typer celler i post-MI-mikromiljøet med høj kvalitet, herunder immunceller, endotelceller og fibroblaster. Tre væsentlige faktorer er afgørende for at opnå en cellesuspension af høj kvalitet til enkeltcellesekventering. Den første er indstillingen af den enzymatiske fordøjelse. Det er vigtigt at kontrollere fordøjelsestiden og volumen og koncentration af fordøjelsesenzymerne for at sikre både cellelevedygtighed og isolationseffektivitet. I dette tilfælde øgede vi koncentrationen af enzymet passende og forlængede fordøjelsestiden. Her anbefaler vi en fordøjelsesvarighed på 45 min til 1 time. En kortere varighed kan øge cellens levedygtighed, men kan føre til utilstrækkelig fordøjelse af hjertevæv og kan øge mængden af celleklumper. Derudover brugte vi DNase I til at forhindre celleaggregering, fordi lytiske celler kan frigive frit DNA til at pakke de omgivende celler ind for at danne celleklumper13. Den anden væsentlige faktor er at bruge en cellevaskeopløsning, der indeholder BSA eller FBS. BSA eller FBS kan ikke kun beskytte enzymernes aktivitet, men også forbedre cellernes levedygtighed. Den sidste væsentlige faktor er at lette FACS for at eliminere cellefragmenter og døde celler. Cellefragmenter kan resultere i et unøjagtigt celleantal og levedygtighed. Disse faktorer forbedrer sammen levedygtigheden og renheden af cellesuspensionen, hvilket gør den mere kompatibel med enkeltcellesekventering.
Denne protokol beskriver først cellesuspensionspræparatet til enkeltcellesekventering, og den indeholder også yderligere procedurer til forbedring af kvaliteten af cellesuspensionen til en relativt lav pris. I sammenligning med andre protokoller, der anvendes af tidligere undersøgelser, undgår vi at bruge fordøjelsesenzymer, der kan forårsage aggregering af celler induceret af frit DNA, såsom trypsin14. Fjernelsen af cellerester er en af de største udfordringer for enkeltcelleundersøgelser, og nogle undersøgelser bruger sæt til fjernelse af døde celler til at forbedre cellelevedygtigheden, før prøverne køres14,15. Her foreslår vi dog at bruge FACS til at forbedre prøvens renhed på grund af dens høje effektivitet til at reducere døde celler og snavs.
Den enkeltcellesuspension, der opnås ved denne protokol, kan analyseres yderligere ved flowanalyse eller primær cellekultur (aseptiske standardprocedurer)18. Da fordøjelsesenzymerne er relativt milde, er det egnet til at fordøje hjertevæv taget i forskellige stadier af MI såvel som fra sunde hjerter. Denne protokol har dog visse begrænsninger. For eksempel fremmer langvarig fordøjelse ved 37 °C uundgåeligt ekspressionen af stressgenerne19,20. Denne begrænsning kan løses ved at bruge aktiv protease ved lav temperatur eller reducere fordøjelsestiden efterfulgt af FACS. Denne protokol inkluderer heller ikke isolerende kardiomyocytter, og den er derfor ikke egnet til undersøgelser af lokale vævsresponser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af naturvidenskabelige fonde i Zhejiang-provinsen (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
