Summary
Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.
Abstract
Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten, met een toenemende mortaliteit wereldwijd. Niet-cardiomyocyten zijn goed voor meer dan de helft van de totale hartcelpopulatie en ze dragen bij aan adaptieve compensaties bij myocardletsel, waaronder ontstekingsreacties, weefselherstel en littekenvorming. Om de post-MI cardiale micro-omgeving te bestuderen, wordt single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) veel gebruikt om verschillende hartceltypen en intercellulaire communicatie te identificeren. Onder de procedures van scRNA-seq monstervoorbereiding is het voorbereiden van de celsuspensie een van de meest kritieke stappen, omdat de levensvatbaarheid van de cel de kwaliteit van de scRNA-seq-resultaten kan beïnvloeden. Daarom hebben we een experimenteel protocol ontworpen voor het bereiden van een niet-cardiomyocytencelsuspensie van post-MI-muizenharten met een extra focus op het verbeteren van de levensvatbaarheid van de cel door milde spijsverteringsenzymen te kiezen, de verteringstijd te regelen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) toe te passen. Ten slotte isoleerden we CD45+ cellen uit de niet-cardiomyocytencelsuspensie verkregen via dit protocol, en vervolgens voerden we scRNA-seq uit.
Introduction
Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten en de mortaliteit ervan neemt over de hele wereld toe1. MI wordt veroorzaakt door een onvoldoende bloedtoevoer naar het omliggende myocardium, wat een gevolg kan zijn van een kransslagaderblokkade die optreedt bij atherosclerotische plaqueruptuur. Hoewel percutane coronaire interventie (PCI) de sterftecijfers van acute MI-patiënten heeft verminderd, blijft de hoge prevalentie van hartfalen na MI een probleem2. De belangrijkste pathofysiologie die ten grondslag ligt aan post-MI hartfalen is de compenserende reactie van het lichaam op hartletsels, waarbij de dode hartspier wordt vervangen door niet-contractiele fibrotische littekens. Deze adaptieve reacties zijn aanzienlijk afhankelijk van lokale ontsteking gemedieerd door de interacties tussen meerdere celtypen en hartweefselcellen, en deze ontsteking wordt nu beschouwd als een potentieel therapeutisch doelwit om fibrotische littekenvorming te verminderen en dus te beschermen tegen post-MI hartfalen 3,4. Interessant is dat de micro-omgeving op de infarctplaats een tijdsafhankelijke overgang ervaart in de infiltrerende celtypen en functies in verschillende stadia van MI 1,5. Veel studies hebben aangetoond dat niet-cardiomyocyten (bijv. Immuuncellen, fibroblasten en endotheelcellen) een centrale rol spelen bij post-MI-ontsteking en weefselherstel 5,6. In de afgelopen jaren is single-cell sequencing op grote schaal gebruikt als een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van de betrokkenheid en functies van niet-cardiomyocyten in de post-MI micro-omgeving 7,8. Dit geeft inzicht in de pathofysiologie van post-MI letsel en herstel en de ontwikkeling van mogelijke therapieën tegen post-MI hartfalen.
High-throughput RNA sequencing (RNA-Seq) is een techniek die wordt gebruikt om volledige transcriptomen in detail te bestuderen met behulp van next-generation sequencing (NGS)7,8,9. Onlangs heeft de ontwikkeling van scRNA-Seq een revolutie teweeggebracht in het biomedische onderzoeksveld. Vergeleken met conventionele bulksequencing analyseert scRNA-Seq genexpressieprofielen en transcriptionele heterogeniteit op het niveau van één cel 7,8. Deze techniek bevordert het onderzoek van de cellulaire pathofysiologie van MI 9,10 aanzienlijk door verschillende circulerende celtypen in de post-MI micro-omgeving te identificeren en de interactie tussen cardiomyocyten en niet-cardiomyocyten bloot te leggen. Deze bevindingen dragen verder bij aan het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen voor post-MI hartfalen. Over het algemeen omvat het op scRNA-seq gebaseerde post-MI-experiment drie hoofdsecties: (1) de vaststelling van een post-MI-diermodel; 2) de bereiding van de celsuspensie; en (3) monstersequencing en gegevensanalyse. Opmerkelijk is dat het voorbereiden van de celsuspensie de meest kritieke stap is in de voorbereiding van het scRNA-Seq-experiment, omdat de kwaliteit van de celsuspensie de nauwkeurigheid van de resultaten bepaalt.
Dit protocol is ontworpen om een niet-cardiomyocytencelsuspensie uit het post-MI hartweefsel te extraheren; Veelbetekenend is dat de specifieke details voor het behoud van de levensvatbaarheid en resolutie van cellen zijn opgenomen. Ondertussen is de apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt, zoals chirurgische kits voor muizen, knaagdierventilatoren en centrifuges, te vinden in de meeste dierexperimentele centra en biomedische laboratoria, en dus zijn de experimentkosten van dit protocol relatief laag. Bovendien, als tijdspunten en plaatsen van infarct als variabelen worden beschouwd, kan dit protocol worden toegepast om een breed scala aan klinische scenario's te simuleren, vooral voor de post-MI-complicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de Zhejiang University en werden goedgekeurd door de Animal Advisory Committee aan de Zhejiang University.
1. Linker anterieure dalende coronaire ligatie (LAD ligatie) operatie
OPMERKING: Acht weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen werden als modellen gebruikt. De harten werden geoogst 2 weken na MI. Linker anterieure dalende kransslagaderligatiechirurgie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en aangetoond11.
- Desinfecteer de chirurgische instrumenten vóór de operatie met 70% ethanol.
- Weeg de muis en verdoof de muis vervolgens met intraperitoneale injecties van 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg). Observeer de teen-knijpreflex en meet de ademhalingsfrequentie om de diepte van de anesthesie tijdens de procedure te evalueren.
- Plaats de muis op de operatietafel met een verwarmingskussen van 37 °C. Gebruik oogheelkundige zalf om uitdroging van de ogen te voorkomen.
- Ontharing van de linker precordiale borst en nek met ontharingscrème en gebruik wattenstaafjes om haren te verwijderen. Desinfecteer de huid met jodophor, gevolgd door 70% alcohol om het gebied drie keer schoon te maken.
- Voer een middellijn cervicale incisie (0,8-1,0 cm) uit onder een microscoop. Scheid de huid, spieren en weefsel rond de luchtpijp en breng vervolgens een canule van 20 G in de luchtpijp in.
OPMERKING: Observeer tijdens het inbrengen van de canule in de luchtpijp onder microscopisch zicht om ervoor te zorgen dat de buis niet in de slokdarm wordt ingebracht. - Sluit de muis aan op een knaagdierventilator die is ingesteld op 0,2 ml getijdenvolume met 150 slagen per minuut.
- Snijd de muizenborst schuin langs de midclaviculaire lijn met een steriele schaar. Ontleed het onderhuidse weefsel om de ribben bloot te leggen.
- Gebruik een steriele schaar om de huid schuin langs de linker midden-claviculaire lijn (0,8-1,0 cm) te knippen. Voer linker thoracotomie uit om de derde en vierde ribben te scheiden om het hart bloot te leggen. Gebruik een rib retractor voor een duidelijk zicht.
- Open het hartzakje met een gebogen tang en laat vervolgens de linker voorste dalende slagader (onder het linker atriumaanhangsel) los met behulp van een 7-0 zijden hechtdraad. Een bleke voorste wand van de linker ventrikel geeft aan dat de myocardiale perfusie met succes wordt onderbroken.
- Laat het ribretractor los en hecht de thoracale incisie in lagen met een 5-0 zijden hechtdraad terwijl de lucht uit de borst wordt verdreven. Hecht de nekincisie met een 5-0 hechtdraad zijden hechtdraad.
- Verwijder de tracheale buis van de muis zodra de spontane ademhaling is hersteld. Injecteer intraperitoneaal 0,5 ml voorverwarmde steriele zoutoplossing. Injecteer buprenorfine (0,1 mg/kg) elke 12 uur subcutaan om pijn te minimaliseren.
- Plaats ten slotte de muis op het verwarmingskussen om te wachten op reanimatie. Controleer de muis om ervoor te zorgen dat deze niet lijdt aan overmatige dyspneu of bloedingen via visuele observatie.
- Breng de muis terug naar zijn kooi nadat hij wakker is geworden. Controleer de muis de eerste week dagelijks om te controleren of de mobiliteit, verzorging en eetgewoonten voldoende zijn. Volgens de behoeften van het experiment, oogst het hart op verschillende tijdstippen na MI.
OPMERKING: In dit protocol werd de eencellige suspensie 2 weken na MI met het hart bereid.
2. Voorbereiding van de cardiale eencellige suspensie
- Voorbereiding van de oplossingen en media
- Cardiale weefseldissociatiebuffer: Meng 10 mg collagenase IV (600 U / ml), 5 mg dispase II (0, 5 U / ml) en 50 μl DNase I (100 μg / ml) in 5 ml RPMI 1640. Verwarm dit medium voor gebruik voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.
- Celwasbuffer: Bereid 1% BSA of 10% FBS in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, PH 7.4) en bewaar bij 4 °C of op ijs.
- Perfusieoplossing: Voorkoel PBS (PH 7.4) als perfusieoplossing.
- Rode bloedcel (RBC) lysis buffer: Gebruik de RBC lysis buffer zoals vermeld door de fabrikant.
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de lijst van reagentia en apparatuur die in dit onderzoek worden gebruikt.
- Euthanaseer de muis door een intraperitoneale pentobarbital natrium (150 mg / kg) injectie.
- Hartdissectie
- Plaats de muis in rugligging door de achterpoten op hun plaats te bevestigen met plakband.
- Spray het lichaam met 70% ethanol en snijd vervolgens verticaal door de buikhuid en spieren terwijl u vermijdt de lever te doorboren. Open voorzichtig de thorax en vermijd het doorboren van het hart.
- Gebruik de voorgekoelde PBS (PH 7.4) om de linker ventrikel te perfuseren totdat de kleurloze perfusievloeistof wordt waargenomen (ongeveer 15 ml PBS [pH 7.4] is nodig).
- Til het hart voorzichtig op van de thorax met een tang en knip het overtollige weefsel weg dat aan de buitenkant van het hart is bevestigd met een oogheelkundige schaar. Plaats het hart in 1 ml voorgekoelde PBS (PH 7,4) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Enzymatische dissociatie van het hartweefsel
- Breng het muizenhart over in een put van een 24-putplaat met 150 μL van de hartweefseldissociatiebuffer op ijs en snijd het in kleine stukjes (~ 1 mm) met een schaar.
- Breng het gehakte hartweefsel over in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml van de weefseldissociatiebuffer.
OPMERKING: Het aanbevolen buffervolume voor dissociatie van hartweefsel is 5 ml / hart. - Plaats de centrifugebuis gedurende 1 uur bij 37 °C in de elektrisch thermostatische zuigerschudder bij 125 tpm. Pipetteer de weefselsuspensie 10 keer per 20 min op en neer.
- Filter de celsuspensie door een 70 μm celzeef om onverteerd weefsel en klonten te verwijderen. Voeg 25 ml van de celwasbuffer toe om de originele buis te spoelen en breng deze vervolgens over om de celzeef te spoelen. Filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 μm om celklonten verder te verwijderen.
- Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie het celmonster vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 1x RBC-lysisbuffer.
- Voeg vier keer meer volume van de celwasbuffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g .
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 10 ml van de celwasbuffer. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 1 ml van de celwasbuffer.
- Meng 18 μL van de celsuspensie met 2 μL van acridine sinaasappel (AO)/propidium jodide (PI) kleuringsoplossing (9:1) en voeg 10 μL van het mengsel toe aan een telkamerschuif. Evalueer de celaantallen en levensvatbaarheid met behulp van een automatische celteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een eencellige suspensie met hoge vitaliteit werd verkregen door toepassing van sectie 2 van dit protocol. Er konden echter nog steeds celfragmenten worden waargenomen (figuur 1A); daarom werd fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uitgevoerd om de kwaliteit verder te verbeteren16. Na FACS neemt de gemiddelde celgrootte af van 9,6 μm tot 9,1 μm ( tabel 1), wat suggereert dat het aandeel celfragmenten in de celsuspensie effectief kan worden verminderd door FACS (figuur 1B). De gatingstrategie die voor FACS wordt gebruikt, is weergegeven in figuur 1C.
Naast de afbeeldingen in figuur 1 werden de celconcentratie, de gemiddelde celgrootte en de levensvatbaarheid van de cel gemeten door een celteller (tabel 1). De verschillen in celconcentraties waren te wijten aan het volume van de celsuspensie. Opmerkelijk is dat de gemiddelde celgrootte afnam na FACS (tabel 1), waaruit blijkt dat FACS celklontering effectief kan verminderen en celfragmenten kan verwijderen.
ScRNA-seq werd uitgevoerd om de cardiale immunologische micro-omgeving te bestuderen en tegelijkertijd de celsuspensiekwaliteit te verifiëren die via dit protocol werd verkregen. Na het bereiden van de eencellige suspensie, sorteerden we eerst de cellen die oppervlakte-eiwit CD45 tot expressie brachten, wat een veel voorkomende marker is voor een breed scala aan immuuncellen. Vervolgens voerden we scRNA-seq uit op CD45+ cellen met behulp van het 10X Genomics platform17. Op deze manier hebben we 14.217 individuele cellen uit drie gezonde hartmonsters samengevoegd tot een samengevoegde dataset na kwaliteitscontrole (tabel 2). De onbewaakte clustering en reductie in t-gedistribueerde stochastische buurinbedding (t-SNE) dimensionaliteit toonde een duidelijke scheiding van zeven soorten immuuncellen (figuur 2). Bovendien vertoonde elk immuunceltype een hoge expressie van klassieke markers. Concluderend tonen deze resultaten aan dat de eencellige suspensie die door dit protocol wordt voorbereid, een hoge potentie heeft voor single-cell sequencing.
Figuur 1: Levensvatbaarheid van de cel in de cardiale eencellige suspensie. (A) Levensvatbaarheid van cellen zonder FACS. De zwarte pijlpunten geven celfragmenten aan (geen fluorescentie). (B) Levensvatbaarheid van cellen met FACS. De gele pijl geeft levende cellen aan (groene fluorescentie) en de rode pijl geeft dode cellen aan (rode fluorescentie). (C) Gating-strategie. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Single-cell RNA sequencing van cardiale CD45+ cellen uit drie muizenhartmonsters. (A) tSNE-plot van CD45+ -cellen met de immuuncelpopulaties geïdentificeerd op basis van canonieke markergenen. (B) Heatmap van de top vijf differentieel tot expressie gebrachte genen in elke subpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vóór FACS | Na FACS | |
| Totale celconcentratie (cellen/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Concentratie levende cellen (cellen/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Dode cel concentratie (cellen/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Levensvatbaarheid (%) | 92.8 | 92.7 |
| Gemiddelde celgrootte (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabel 1: Cardiale eencellige suspensie voor en na FACS. De celdichtheden van de cardiale eencellige suspensie verkregen voor en na FACS worden vergeleken met behulp van een geautomatiseerde celteller.
| Ramingen | |
| Geschat aantal cellen | 14,217 |
| Gemiddelde leesbewerkingen per cel | 81,017 |
| Mediane genen per cel | 1,374 |
| Totaal aantal gedetecteerde genen | 18,424 |
| Mediane UMI-tellingen per cel | 4,021 |
| Geldige barcodes | 98.4% |
| Leest toegewezen aan genoom | 95.1% |
Tabel 2: Statistieken over kwaliteitscontrole. De tabel geeft een overzicht van de verschillende schattingen van de eencellige gegevens van gezonde muizenharten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel was bedoeld om een protocol te beschrijven om enkele niet-cardiomyocyten te isoleren van muizenharten post MI. Het protocol kan worden toegepast om verschillende soorten cellen in de post-MI-micro-omgeving met hoge kwaliteit te isoleren, waaronder immuuncellen, endotheelcellen en fibroblasten. Drie essentiële factoren zijn cruciaal voor het verkrijgen van een hoogwaardige celsuspensie voor single-cell sequencing. De eerste is de instelling van de enzymatische spijsvertering. Het is belangrijk om de tijd van vertering en het volume en de concentratie van de spijsverteringsenzymen te regelen om zowel de levensvatbaarheid van de cel als de isolatie-efficiëntie te garanderen. In dit geval verhoogden we de concentratie van het enzym op de juiste manier en verlengden we de verteringstijd. Hier adviseren we een verteringsduur van 45 min tot 1 h. Een kortere duur kan de levensvatbaarheid van de cel verhogen, maar kan leiden tot onvoldoende hartweefselvertering en kan de hoeveelheid celklonten verhogen. Daarnaast gebruikten we DNase I om celaggregatie te voorkomen, omdat lytische cellen vrij DNA kunnen vrijgeven om de omliggende cellen te omhullen om celklontente vormen 13. De tweede essentiële factor is het gebruik van een celwasoplossing die BSA of FBS bevat. BSA of FBS kan niet alleen de activiteit van de enzymen beschermen, maar ook de levensvatbaarheid van de cellen verbeteren. De laatste essentiële factor is het faciliteren van FACS om celfragmenten en dode cellen te elimineren. Celfragmenten kunnen resulteren in een onnauwkeurig celgetal en levensvatbaarheid. Deze factoren samen verbeteren de levensvatbaarheid en zuiverheid van de celsuspensie, waardoor deze meer compatibel is met single-cell sequencing.
Dit protocol beschrijft eerst het celsuspensiepreparaat voor single-cell sequencing, en het bevat ook aanvullende procedures om de kwaliteit van de celsuspensie tegen relatief lage kosten te verbeteren. In vergelijking met andere protocollen die door eerdere studies werden gebruikt, vermijden we het gebruik van spijsverteringsenzymen die de aggregatie van cellen kunnen veroorzaken die worden geïnduceerd door vrij DNA, zoals trypsine14. Het verwijderen van het celafval is een van de grootste uitdagingen voor eencellige studies, en sommige studies gebruiken dode celverwijderingskits om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren voordat de monsters worden uitgevoerd14,15. Hier raden we echter aan FACS te gebruiken om de zuiverheid van het monster te verbeteren vanwege de hoge effectiviteit bij het verminderen van dode cellen en puin.
De eencellige suspensie die door dit protocol wordt verkregen, kan verder worden geanalyseerd door stroomanalyse of primaire celkweek (standaard aseptische procedures)18. Omdat de spijsverteringsenzymen relatief mild zijn, is het geschikt om hartweefsel te verteren dat in verschillende stadia van MI is genomen, evenals dat van gezonde harten. Dit protocol heeft echter bepaalde beperkingen. Zo bevordert een langdurige vertering bij 37 °C onvermijdelijk de expressie van stressgenen19,20. Deze beperking kan worden opgelost door actieve protease bij lage temperatuur te gebruiken of de verteringstijd gevolgd door FACS te verkorten. Ook omvat dit protocol geen isolerende cardiomyocyten en is het dus niet geschikt voor studies naar lokale weefselresponsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Funds van de provincie Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
