Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl einzelner nicht-kardiomyozyten mit hoher Viabilität aus einem Mausherzen nach einem Myokardinfarkt (MI). Dies kann für die anschließende Einzelzellsequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse und primäre Zellkultur verwendet werden.
Abstract
Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit weltweit steigender Sterblichkeit. Nicht-Kardiomyozyten machen mehr als die Hälfte der gesamten Herzzellpopulation aus und tragen zur adaptiven Kompensation von Myokardverletzungen bei, einschließlich Entzündungsreaktionen, Gewebereparatur und Narbenbildung. Um die kardiale Mikroumgebung nach einem MI zu untersuchen, wird die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) häufig verwendet, um verschiedene Herzzelltypen und interzelluläre Kommunikation zu identifizieren. Unter den Verfahren der scRNA-seq-Probenvorbereitung ist die Herstellung der Zellsuspension einer der kritischsten Schritte, da die Zellviabilität die Qualität der scRNA-seq-Ergebnisse beeinflussen kann. Daher haben wir ein experimentelles Protokoll zur Herstellung einer nicht-kardiomyozytenartigen Zellsuspension aus Mäuseherzen nach einem Myokardinfarkt entwickelt, wobei der Schwerpunkt auf der Verbesserung der Zelllebensfähigkeit durch die Auswahl milder Verdauungsenzyme, die Kontrolle der Verdauungszeit und die Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) liegt. Schließlich isolierten wir CD45+ -Zellen aus der durch dieses Protokoll erhaltenen Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension und führten dann scRNA-seq durch.
Introduction
Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, deren Sterblichkeit weltweit zunimmt1. Der Myokardinfarkt wird durch eine unzureichende Durchblutung des umgebenden Myokards verursacht, was auf einen Verschluss der Koronararterien zurückzuführen sein kann, der bei einer atherosklerotischen Plaqueruptur auftritt. Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI) die Sterblichkeitsraten von Patienten mit akutem Myokardinfarkt gesenkt hat, bleibt die hohe Prävalenz der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ein Problem2. Die wichtigste Pathophysiologie, die der Herzinsuffizienz nach einem Herzinfarkt zugrunde liegt, ist die kompensatorische Reaktion des Körpers auf Herzverletzungen, bei der der abgestorbene Herzmuskel durch nicht-kontraktile fibrotische Narben ersetzt wird. Diese adaptiven Reaktionen beruhen maßgeblich auf lokalen Entzündungen, die durch die Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen und Herzgewebezellen vermittelt werden, und diese Entzündung wird nun als potenzielles therapeutisches Ziel angesehen, um die fibrotische Narbenbildung zu reduzieren und somit vor einer Herzinsuffizienz nach einem Myokardinfarkt zu schützen 3,4. Interessanterweise erfährt die Mikroumgebung an der Infarktstelle einen zeitabhängigen Übergang der infiltrierenden Zelltypen und -funktionen in verschiedenen Stadien von MI 1,5. Viele Studien haben gezeigt, dass Nicht-Kardiomyozyten (z. B. Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen) eine zentrale Rolle bei der Entzündung nach einem Myokardinfarkt und der Gewebereparatur spielen 5,6. In den letzten Jahren wurde die Einzelzellsequenzierung in großem Umfang als leistungsfähiges Werkzeug zur Aufklärung der Beteiligung und Funktion von Nicht-Kardiomyozyten in der Mikroumgebung nach einem Myokardinfarkteingesetzt 7,8. Dies gibt Einblicke in die Pathophysiologie der Post-MI-Verletzung und -Reparatur sowie in die Entwicklung potenzieller Therapien gegen die Post-MI-Herzinsuffizienz.
Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, mit der ganze Transkriptome mithilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) sehr detailliert untersucht werden können7,8,9. In jüngster Zeit hat die Entwicklung von scRNA-Seq das biomedizinische Forschungsfeld revolutioniert. Im Vergleich zur konventionellen Massensequenzierung analysiert scRNA-Seq Genexpressionsprofile und transkriptionelle Heterogenität auf Einzelzellebene 7,8. Diese Technik fördert maßgeblich die Erforschung der zellulären Pathophysiologie von MI 9,10, indem sie verschiedene zirkulierende Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung identifiziert und die Interaktion zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten aufdeckt. Diese Ergebnisse tragen außerdem dazu bei, neue therapeutische Angriffspunkte für die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt zu finden. Im Allgemeinen umfasst das scRNA-seq-basierte Post-MI-Experiment drei Hauptabschnitte: (1) die Etablierung eines Post-MI-Tiermodells; (2) die Herstellung der Zellsuspension; und (3) Probensequenzierung und Datenanalyse. Auffällig ist, dass die Herstellung der Zellsuspension der kritischste Schritt bei der Vorbereitung des scRNA-Seq-Experiments ist, da die Qualität der Zellsuspension die Genauigkeit der Ergebnisse bestimmt.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension aus dem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt zu extrahieren. Bezeichnenderweise sind die spezifischen Details zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Auflösung der Zellen enthalten. Inzwischen sind die in diesem Protokoll verwendeten Geräte, wie z. B. chirurgische Kits für Mäuse, Beatmungsgeräte für Nagetiere und Zentrifugen, in den meisten Tierversuchszentren und biomedizinischen Labors zu finden, und daher sind die Versuchskosten für dieses Protokoll relativ gering. Darüber hinaus kann dieses Protokoll unter Berücksichtigung von Zeitpunkten und Infarktorten als Variablen angewendet werden, um eine Vielzahl von klinischen Szenarien zu simulieren, insbesondere für die Komplikationen nach dem Myokardinfarkt.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren an der Zhejiang University durchgeführt und vom Animal Advisory Committee der Zhejiang University genehmigt.
1. Ligatur der Koronararterien links anterior absteigend (LAD-Ligatur)
HINWEIS: Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden als Modelle verwendet. Die Herzentnahme erfolgte 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt. Die linksanteriore absteigende Koronararterien-Ligaturoperation wurde wie zuvor beschrieben und nachgewiesen durchgeführt11.
- Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente vor der Operation mit 70%igem Ethanol.
- Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie dann mit intraperitonealen Injektionen von 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg). Beobachten Sie den Zehen-Kneif-Reflex und messen Sie die Atemfrequenz, um die Tiefe der Anästhesie während des Eingriffs zu beurteilen.
- Legen Sie die Maus mit einem 37 °C warmen Heizkissen auf den OP-Tisch. Verwenden Sie Augensalbe, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
- Enthaaren Sie die linke Brust und den Hals mit Enthaarungscreme und verwenden Sie Wattestäbchen, um Haare zu entfernen. Desinfizieren Sie die Haut mit Jodophor, gefolgt von 70% Alkohol, um den Bereich dreimal zu reinigen.
- Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Halswirbelsäule (0,8-1,0 cm) unter dem Mikroskop durch. Trennen Sie die Haut, den Muskel und das Gewebe, das die Luftröhre umgibt, und führen Sie dann eine 20-G-Kanüle in die Luftröhre ein.
Anmerkungen: Beobachten Sie beim Einführen der Kanüle in die Luftröhre unter dem Mikroskop, dass der Schlauch nicht in die Speiseröhre eingeführt wird. - Schließen Sie die Maus an ein Nagetierbeatmungsgerät an, das auf ein Tidalvolumen von 0,2 ml mit 150 Hüben pro Minute eingestellt ist.
- Schneiden Sie die Brust der Maus mit einer sterilen Schere schräg entlang der Mittelschlüsselbeinlinie ein. Präparieren Sie das Unterhautgewebe, um die Rippen freizulegen.
- Verwenden Sie eine sterile Schere, um die Haut schräg entlang der linken mittleren Schlüsselbeinlinie (0,8-1,0 cm) zu schneiden. Führen Sie eine linke Thorakotomie durch, um die dritte und vierte Rippe zu trennen und das Herz freizulegen. Verwenden Sie einen Rippenaufroller für eine klare Sicht.
- Öffnen Sie das Perikard mit einer gekrümmten Pinzette und ligieren Sie dann die linke vordere absteigende Arterie (unterhalb des linken Vorhofanhangs) mit einer 7-0-Seidennaht. Eine blasse Vorderwand des linken Ventrikels deutet darauf hin, dass die myokardiale Perfusion erfolgreich unterbrochen wurde.
- Lösen Sie den Rippenretraktor und nähen Sie den Thoraxschnitt in Schichten mit einer 5-0-Seidennaht, während Sie Luft aus dem Brustkorb ausstoßen. Nähen Sie den Halsschnitt mit einer 5-0-Nahtseidennaht.
- Entfernen Sie den Trachealtubus von der Maus, sobald ihre Spontanatmung wiederhergestellt ist. Intraperitoneal 0,5 ml vorgewärmte sterile Kochsalzlösung injizieren. Injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 Stunden subkutan, um die Schmerzen zu minimieren.
- Legen Sie abschließend die Maus auf das Heizkissen, um auf die Wiederbelebung zu warten. Überwachen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie nicht an übermäßiger Dyspnoe oder Blutungen leidet, indem Sie sie visuell beobachten.
- Bringen Sie die Maus nach dem Aufwachen in ihren Käfig zurück. Überwachen Sie die Maus in der ersten Woche täglich, um sicherzustellen, dass ihre Mobilität, Fellpflege und Essgewohnheiten angemessen sind. Ernten Sie das Herz je nach Bedarf des Experiments zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Myokardinfarkt.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die einzellige Suspension 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt mit dem Herzen hergestellt.
2. Herstellung der kardialen Einzelzellsuspension
- Aufbereitung der Lösungen und Medien
- Dissoziationspuffer für kardiales Gewebe: Mischen Sie 10 mg Kollagenase i.v. (600 U/ml), 5 mg Dispase II (0,5 U/ml) und 50 μl DNase I (100 μg/ml) in 5 ml RPMI 1640. Dieses Medium vor Gebrauch im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
- Zellwaschpuffer: 1 % BSA oder 10 % FBS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, PH 7,4) herstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
- Perfusionslösung: PBS (PH 7,4) als Perfusionslösung vorkühlen.
- Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): Verwenden Sie den Lysepuffer für Erythrozyten, wie vom Hersteller angegeben.
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte.
- Euthanasieren Sie die Maus durch eine intraperitoneale Pentobarbital-Natrium-Injektion (150 mg/kg).
- Dissektion des Herzens
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage, indem Sie ihre Hinterbeine mit Klebeband fixieren.
- Besprühen Sie den Körper mit 70%igem Ethanol und schneiden Sie dann senkrecht durch die Bauchhaut und die Muskeln, ohne die Leber zu durchstechen. Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb und vermeiden Sie dabei eine Punktion des Herzens.
- Verwenden Sie das vorgekühlte PBS (PH 7,4), um den linken Ventrikel zu durchbluten, bis die farblose Perfusionsflüssigkeit beobachtet wird (ca. 15 ml PBS [pH 7,4] werden benötigt).
- Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette vom Brustkorb ab und schneiden Sie das überschüssige Gewebe, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist, mit einer Augenschere ab. Legen Sie das Herz in 1 ml vorgekühltes PBS (PH 7,4) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Enzymatische Dissoziation des Herzgewebes
- Übertragen Sie das Mausherz in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 150 μL des auf Eis gelegten Dissoziationspuffers des Herzgewebes und schneiden Sie es mit einer Schere in kleine Stücke (~1 mm).
- Das zerkleinerte Herzgewebe wird mit 5 ml des Gewebedissoziationspuffers in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
HINWEIS: Das empfohlene Puffervolumen für die Dissoziation von Herzgewebe beträgt 5 ml/Herz. - Legen Sie das Zentrifugenröhrchen für 1 h bei 37 °C in den elektrisch thermostatischen Kolbenschüttler mit 125 U/min. Pipettieren Sie die Gewebesuspension alle 20 Minuten 10 Mal auf und ab.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb, um unverdautes Gewebe und Klumpen zu entfernen. Fügen Sie 25 ml des Zellwaschpuffers hinzu, um das Originalröhrchen zu spülen, und übertragen Sie es dann, um das Zellsieb zu spülen. Als nächstes wird die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb gefiltert, um Zellklumpen weiter zu entfernen.
- Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die Zellprobe in 1x RBC-Lysepuffer für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Fügen Sie viermal mehr Volumen des Zellwaschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml des Zellwaschpuffers. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des Zellwaschpuffers.
- Mischen Sie 18 μl der Zellsuspension mit 2 μl Acridinorange (AO)/Propidiumiodid (PI)-Färbelösung (9:1) und geben Sie 10 μl der Mischung in einen Objektträger der Zählkammer. Bewerten Sie die Zellzahlen und die Viabilität mit einem automatischen Zellzähler.
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Representative Results
Eine einzellige Suspension mit hoher Vitalität wurde durch die Umsetzung von Abschnitt 2 dieses Protokolls erhalten. Es konnten jedoch noch Zellfragmente beobachtet werden (Abbildung 1A); Daher wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durchgeführt, um die Qualität weiter zu verbessern16. Nach FACS verringert sich die durchschnittliche Zellgröße von 9,6 μm auf 9,1 μm (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass der Anteil der Zellfragmente in der Zellsuspension durch FACS effektiv reduziert werden kann (Abbildung 1B). Die für FACS verwendete Gating-Strategie ist in Abbildung 1C dargestellt.
Zusätzlich zu den Bildern in Abbildung 1 wurden die Zellkonzentration, die durchschnittliche Zellgröße und die Zellviabilität mit einem Zellzähler gemessen (Tabelle 1). Die Unterschiede in den Zellkonzentrationen waren auf das Volumen der Zellsuspension zurückzuführen. Auffällig ist, dass die durchschnittliche Zellgröße nach FACS abnahm (Tabelle 1), was zeigt, dass FACS die Zellverklumpung effektiv reduzieren und Zellfragmente entfernen kann.
ScRNA-seq wurde durchgeführt, um die immunologische Mikroumgebung des Herzens zu untersuchen und gleichzeitig die Qualität der Zellsuspension zu überprüfen, die durch dieses Protokoll erhalten wurde. Nach der Herstellung der Einzelzellsuspension sortierten wir zunächst die Zellen, die das Oberflächenprotein CD45 exprimierten, das ein häufiger Marker für eine Vielzahl von Immunzellen ist. Als nächstes führten wir scRNA-seq an CD45+ Zellen mit der 10X Genomics Plattform17 durch. Auf diese Weise haben wir nach der Qualitätskontrolle 14.217 Einzelzellen aus drei gesunden Herzproben zu einem zusammengeführten Datensatz zusammengefasst (Tabelle 2). Das unüberwachte Clustering und die Reduktion der t-verteilten stochastischen Nachbareinbettung (t-SNE) Dimensionalität zeigten eine offensichtliche Trennung von sieben Typen von Immunzellen (Abbildung 2). Darüber hinaus zeigte jeder Immunzelltyp eine hohe Expression klassischer Marker. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die mit diesem Protokoll hergestellte Einzelzellsuspension eine hohe Wirksamkeit für die Einzelzellsequenzierung aufweist.
Abbildung 1: Zellviabilität in der kardialen Einzelzellsuspension. (A) Lebensfähigkeit der Zellen ohne FACS. Die schwarzen Pfeilspitzen deuten auf Zellfragmente hin (keine Fluoreszenz). (B) Viabilität der Zellen mit FACS. Der gelbe Pfeil zeigt lebende Zellen an (grüne Fluoreszenz) und der rote Pfeil zeigt tote Zellen an (rote Fluoreszenz). (C) Gating-Strategie. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Einzelzell-RNA-Sequenzierung von kardialen CD45+ -Zellen aus drei Mausherzproben. (A) tSNE-Diagramm von CD45+ Zellen, das die Immunzellpopulationen zeigt, die auf der Grundlage kanonischer Markergene identifiziert wurden. (B) Heatmap der fünf wichtigsten differentiell exprimierten Gene in jeder Subpopulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Vor dem FACS | Nach dem FACS | |
| Gesamtzellkonzentration (Zellen/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Lebendzellkonzentration (Zellen/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Konzentration abgestorbener Zellen (Zellen/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Rentabilität (%) | 92.8 | 92.7 |
| Durchschnittliche Zellgröße (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabelle 1: Kardiale Einzelzellsuspension vor und nach FACS. Die Zelldichten der kardialen Einzelzellsuspension, die vor und nach dem FACS gewonnen wurde, werden mit einem automatisierten Zellzähler verglichen.
| Schätzt | |
| Geschätzte Anzahl der Zellen | 14,217 |
| Mittlere Lesevorgänge pro Zelle | 81,017 |
| Mediane Gene pro Zelle | 1,374 |
| Gesamtzahl der nachgewiesenen Gene | 18,424 |
| Mediane UMI-Anzahl pro Zelle | 4,021 |
| Gültige Barcodes | 98.4% |
| Lesevorgänge, die dem Genom zugeordnet sind | 95.1% |
Tabelle 2: Statistiken zur Qualitätskontrolle. Die Tabelle listet die verschiedenen Schätzungen der Einzelzelldaten gesunder Mäuseherzen auf.
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Discussion
Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll zur Isolierung einzelner Nicht-Kardiomyozyten aus Mäuseherzen nach Myokardinfarkt zu beschreiben. Das Protokoll kann angewendet werden, um verschiedene Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung mit hoher Qualität zu isolieren, darunter Immunzellen, Endothelzellen und Fibroblasten. Drei wesentliche Faktoren sind entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Zellsuspension für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Die erste ist die Einstellung der enzymatischen Verdauung. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Verdauung sowie das Volumen und die Konzentration der Verdauungsenzyme zu kontrollieren, um sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen als auch die Effizienz der Isolierung zu gewährleisten. In diesem Fall haben wir die Konzentration des Enzyms entsprechend erhöht und die Verdauungszeit verlängert. Hier empfehlen wir eine Verdauungsdauer von 45 min bis 1 h. Eine kürzere Dauer kann die Lebensfähigkeit der Zellen erhöhen, aber zu einer unzureichenden Verdauung des Herzgewebes führen und die Anzahl der Zellklumpen erhöhen. Darüber hinaus haben wir DNase I verwendet, um die Zellaggregation zu verhindern, da lytische Zellen freie DNA freisetzen können, um die umgebenden Zellen zu umhüllen und Zellklumpen zu bilden13. Der zweite wesentliche Faktor ist die Verwendung einer Zellwaschlösung, die BSA oder FBS enthält. BSA oder FBS können nicht nur die Aktivität der Enzyme schützen, sondern auch die Lebensfähigkeit der Zellen verbessern. Der letzte wesentliche Faktor ist die Erleichterung von FACS zur Beseitigung von Zellfragmenten und toten Zellen. Zellfragmente können zu einer ungenauen Zellzahl und Lebensfähigkeit führen. Diese Faktoren zusammen verbessern die Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellsuspension, wodurch sie besser mit der Einzelzellsequenzierung kompatibel ist.
Dieses Protokoll beschreibt zunächst die Herstellung der Zellsuspension für die Einzelzellsequenzierung und beinhaltet auch zusätzliche Verfahren, um die Qualität der Zellsuspension zu relativ geringen Kosten zu verbessern. Im Vergleich zu anderen Protokollen, die in früheren Studien verwendet wurden, vermeiden wir die Verwendung von Verdauungsenzymen, die die Aggregation von Zellen verursachen können, die durch freie DNA induziert werden, wie z. B. Trypsin14. Die Entfernung der Zelltrümmer ist eine der größten Herausforderungen für Einzelzellstudien, und in einigen Studien werden Kits zur Entfernung abgestorbener Zellen verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, bevor die Proben durchgeführt werden14,15. Hier empfehlen wir jedoch die Verwendung von FACS, um die Reinheit der Probe aufgrund seiner hohen Wirksamkeit bei der Reduzierung toter Zellen und Ablagerungen zu verbessern.
Die mit diesem Protokoll erhaltene Einzelzellsuspension kann durch Flussanalyse oder primäre Zellkultur (aseptische Standardverfahren) weiter analysiert werden18. Da die Verdauungsenzyme relativ mild sind, eignet es sich zur Verdauung von Herzgewebe, das in verschiedenen Stadien des Myokardinfarkts entnommen wird, sowie von gesunden Herzen. Dieses Protokoll hat jedoch bestimmte Einschränkungen. So fördert beispielsweise eine verlängerte Verdauung bei 37 °C zwangsläufig die Expression von Stressgenen19,20. Diese Einschränkung kann durch die Verwendung einer aktiven Protease bei niedriger Temperatur oder durch eine Verkürzung der Aufschlusszeit gefolgt von FACS gelöst werden. Außerdem beinhaltet dieses Protokoll keine Isolierung von Kardiomyozyten und ist daher nicht für Studien zu lokalen Gewebereaktionen geeignet.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Natural Science Funds der Provinz Zhejiang unterstützt (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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