Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Resumo

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Resumo

A hepatectomia parcial tem sido amplamente utilizada para investigar a regeneração hepática em camundongos, mas o isolamento de altos rendimentos de hepatócitos viáveis para aplicações unicelulares a jusante é um desafio. Um acúmulo acentuado de lipídios dentro de hepatócitos em regeneração é observado durante os primeiros 2 dias de regeneração hepática normal em camundongos. Esta chamada esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à principal fase proliferativa. A purificação do gradiente de densidade é a espinha dorsal da maioria dos protocolos existentes para o isolamento de hepatócitos primários. Como a purificação do gradiente depende da densidade e do tamanho das células, ela separa as populações de hepatócitos não esteatóticos dos esteatóticos. Portanto, hepatócitos gordurosos muitas vezes são perdidos, produzindo frações de hepatócitos não representativas.

O protocolo apresentado descreve um método fácil e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores, independentemente de seu conteúdo lipídico. Hepatócitos de camundongos machos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente, usando uma técnica de perfusão retrógrada com saída pela veia porta. Os hepatócitos são dissociados pela colagenase para sua liberação da cápsula de Glisson. Após a lavagem e centrifugação cuidadosa, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante. Em conclusão, este trabalho descreve uma técnica simples e reprodutível para o isolamento de uma população representativa de hepatócitos regenerados após hepatectomia parcial em camundongos. O método também pode ajudar no estudo da doença hepática gordurosa.

Introdução

O fígado pode regenerar-se mesmo após uma grande perda de tecido. Essa capacidade regenerativa única é explicitamente ilustrada pelo modelo experimental de hepatectomia parcial (70%), descrito pela primeira vez em ratos por Higgins e Anderson em 1931¹. Neste modelo, 70% do fígado é removido cirurgicamente dos animais, cortando lobos hepáticos maiores. Os lobos restantes crescem então através de hipertrofia compensatória para restaurar a massa hepática original dentro de cerca de 1 semana após a cirurgia, embora sem restauração da arquitetura hepática original ^2,3. Hepatectomias adicionais com quantidades variadas de remoção tecidual têm sido desenvolvidas, como a hepatectomia prolongada a 86%, onde o remanescente hepático é muito pequeno para se recuperar, levando eventualmente à insuficiência hepática pós-hepatectomia (PHLF) e subsequente morte em 30%-50% dos animais ^4,5,6. Esses modelos possibilitam o estudo da regeneração hepática normal e falha, dependendo da quantidade de tecido ressecado (Figura 1).

Embora os modelos de hepatectomias em camundongos tenham sido usados com sucesso por muitos anos, apenas recentemente métodos analíticos mais avançados permitiram uma visão mais profunda no nível de célula única. Para a maioria desses métodos, no entanto, a presença de hepatócitos individuais é um pré-requisito básico. A maioria dos protocolos para o isolamento de hepatócitos primários baseia-se em uma técnica de perfusão de colagenase em duas etapas e subsequente purificação de gradiente de densidade para separar hepatócitos viáveis de detritos e não parenquimatos, bem como células mortas ^7,8,9. Esse método foi descrito pela primeira vez por Berry e Friend em 1969¹⁰ e adaptado por Seglen e colegas em 1972^11,12. No entanto, como a centrifugação por gradiente depende da densidade e do tamanho das células, os hepatócitos carregados de lipídios são frequentemente perdidos durante a purificação padrão. Embora essa perda possa ser insignificante para muitas questões de pesquisa, é um aspecto crucial para a regeneração hepática precoce. Durante os primeiros 2 dias, os hepatócitos dentro do fígado de rato em regeneração acumulam lípidos, crescendo assim em tamanho e mergulhando em densidade. Essa esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) serve para fornecer combustível regenerativo e é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à fase proliferativa principal e é distribuída de forma desigual dentro dos lóbulos hepáticos - as unidades funcionais do fígado^13,14. Após a hepatectomia prolongada de 86%, no entanto, a SRAT também ocorre, mas persiste, pois a regeneração é paralisada e os lipídios não estão sendo oxidados¹⁴. Portanto, a purificação gradiente de hepatócitos após hepatectomias de 70% ou 86% produzirá frações não representativas, pois a maioria dos hepatócitos carregados de lipídios é perdida devido à sua baixa densidade¹⁵.

Neste protocolo de isolamento modificado, hepatócitos de camundongos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Normalmente, a canulação e a perfusão do remanescente para isolamento celular são feitas através da veia porta. No entanto, a resistência portovascular em pequenos remanescentes deixados após ressecção maior é alta¹⁶ e, portanto, a perfusão é delicada. Como a veia cava permanece não afetada pelas hepatectomias, a perfusão pode ser facilmente realizada na direção retrógrada através da canulação da veia cava. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente hepático, utilizando perfusão retrógrada com saída pela veia porta (Figura Suplementar S1). Os hepatócitos são dissociados pelas colagenases e liberados da cápsula de Glisson. Após a lavagem e o processamento cuidadoso de hepatócitos viáveis por isolamento gradual usando uma abordagem de centrifugação de baixa velocidade, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram de acordo com o Regulamento Federal Suíço de Animais e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 007/2017, 156/2019), garantindo cuidados humanos. Camundongos machos C57BL/6 com idade entre 10-12 semanas foram mantidos em um ciclo de 12 h dia/noite com livre acesso a alimentos e água. Cada grupo experimental foi composto por seis a oito animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Hepatectomia parcial em camundongos

1. Para hepatectomia padrão (70%), ligai e ressecaram o lobo lateral esquerdo, a porção direita do lobo mediano e a porção esquerda do lobo mediano (Figura 1B). Para hepatectomia prolongada (86%)⁴, remova também os lobos caudados e o lobo anterior direito (Figura 1C).
2. NOTA: A hepatectomia padrão é um procedimento que tem sido usado na pesquisa de regeneração hepática por muitos anos. Protocolos para esse procedimento estão disponíveis^3,17, incluindo o protocolo videoassistido de Mitchell e Willenbring ¹⁸. Mais detalhes sobre as técnicas utilizadas aqui para hepatectomias podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1.

Figura 1: Hepatectomia padrão (70%) e estendida (86%) em camundongos. (A) Os cinco lobos hepáticos de camundongos e suas respectivas contribuições para o peso total do fígado. (B) Ilustração esquemática da hepatectomia a 70% em camundongos. Os lobos escuros representam o futuro remanescente hepático. (C) Ilustração esquemática da hepatectomia a 86% em camundongos. Os lobos escuros representam o futuro remanescente hepático. (D) Volume preciso de tecido ressecado pós-hepatectomia de 70% e 86%. (E) Abdome de camundongo imediatamente após hepatectomia a 70%; (F) abdome de camundongo imediatamente (esquerda) e 48 h (direita) após hepatectomia a 86%. Observe a cor pálida do remanescente esteatótico (seta branca). n = 6-7/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomia padrão; eHx = hepatectomia prolongada; LW = peso do fígado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação das soluções de perfusão

1. Prepare os tampões de perfusão, digestão e preservação (ver Tabela 1).
   1. Ajustar o pH de todas as soluções-tampão a 37 °C adicionando hidróxido de sódio (NaOH) ou cloreto de hidrogénio (HCl), conforme necessário. O pH ideal para os tampões é 7,4.
   2. Coloque o tampão de preservação e o E Médio de Williams no gelo.
2. Prepare o tampão de citometria de fluxo e armazene-o no gelo.

Tabela 1: Soluções e tampões utilizados para a digestão e purificação de hepatócitos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

3. Preparação do equipamento de perfusão

1. Aqueça o banho-maria a 42 °C e coloque o tampão de perfusão (50 mL) e o tampão de digestão (10-20 mL) no banho-maria. Não adicione colagenase ao tampão de digestão ainda.
2. Prepare a bomba peristáltica e insira a tubulação. A configuração completa da perfusão é mostrada na Figura 2.
   1. Conecte uma cânula IV de 26 G à extremidade de saída da tubulação usando um conector de bloqueio Luer. Insira a extremidade de entrada do tubo no tubo tampão de perfusão pré-aquecido no banho de água. Lavar a tubulação com etanol a 70%, seguido de 50 mL de cloreto de sódio estéril (NaCl 0,9%). Prima a tubulação com tampão de perfusão quente (velocidade da bomba de 3 mL/min).
3. Sedar o camundongo usando anestesia inalatória com isoflurano (800 mL/min O 2, 3%-5% de isoflurano para indução e₂% para manutenção durante o procedimento). Manuseie o isoflurano sob um exaustor de laboratório e forneça ventilação adequada.
4. Administrar buprenorfina por via subcutânea 30 min antes da cirurgia na dose de 0,1 mg/kg de peso corporal.
5. Para evitar a hipotermia, coloque o rato sedado em uma almofada de aquecimento e coloque um tecido de pano enrolado sob o abdômen superior para elevar o fígado acima dos outros órgãos e facilitar o acesso à veia cava inferior.
   NOTA: Não use tecido muito espesso, pois a torção dos vasos é possível e a eficácia da perfusão seria afetada.
6. Adicione pomada ocular para evitar danos na córnea.
7. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado, testando o reflexo de retirada do pedal (pinça da almofada do pé em ambas as patas traseiras). Em caso de resposta, forneça anestesia adicional e reteste antes de iniciar o procedimento.
8. Limpe o abdômen com etanol a 70%.
   1. Reabra a incisão da linha média cortando a sutura e afastando suavemente as bordas da ferida. Se a hepatectomia for mais antiga que 24-48 h, remova a sutura e corte a pele com uma tesoura.
   2. Fixe uma sutura de polipropileno 5-0 no esterno, puxe-a cranialmente e fixe-a nesta posição. Use um afastador ou clipes simples para manter o abdômen aberto. A cavidade abdominal deve ser exposta o máximo possível para otimizar o acesso e a visualização.
9. Mova os intestinos para a direita usando cotonetes para revelar a veia porta e a veia cava. Use um pano molhado para reter os intestinos.
10. Coloque um objeto pesado de aproximadamente 2 cm de altura (por exemplo, um anel de peso revestido de silicone para frascos volumétricos) adjacente às patas traseiras do rato (Figura suplementar S2A). Coloque a tubulação com a cânula 26 G IV conectada no objeto e posicione a agulha cuidadosamente em cima da veia cava. Ajuste o comprimento da tubulação.
11. Coloque a solução de estoque de colagenase preparada no tubo tampão de digestão pré-aquecido. Adicionar 250 μL da solução-mãe a 10 ml de tampão de digestão. Prepare 10-20 mL de tampão de digestão por animal. Para animais maiores ou perfusão de fígados inteiros, prepare até 30 mL de tampão de digestão.
    NOTA: Recomenda-se adicionar a solução de estoque de colagenase ao tampão de digestão aquecido aproximadamente 30 minutos antes do início do processo de digestão.
    
    Figura 2: Visão geral da configuração de perfusão. (A) Mesa cirúrgica com o equipamento necessário para a perfusão. (B) Os materiais necessários para a preparação do fígado, bem como a extração e isolamento de hepatócitos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Canulação e perfusão

1. Ajuste a velocidade da bomba para 3 mL/min e ligue a bomba. Deixe o tampão de perfusão pré-aquecido alcançar a agulha. Descarte os primeiros 2-3 mL de tampão de perfusão.
2. Realizar a canulação da veia cava inferior.
   1. Enquanto o tampão está correndo através da agulha, insira a cânula 26 G IV em um ângulo raso na veia cava abaixo do rim. Certifique-se de que o bisel da agulha aponte para cima.
   2. Use um cotonete para puxar suavemente a veia cava caudalmente abaixo do local da punção para que a tensão fornecida facilite a inserção da cânula na veia. Procure sangue na câmara de flash do cateter quando a agulha entrar no lúmen.
   3. Avance a agulha um adicional de 2-3 mm para garantir que a ponta do cateter de plástico também tenha entrado na veia.
   4. Deslize o cateter de plástico sobre a agulha e para a veia cava mais 5 mm. Retire a agulha lentamente e com muito cuidado.
      NOTA: Não é recomendável fixar a cânula com uma ligadura. Esta etapa é demorada, pois o recipiente deve primeiro ser dissecado para esse fim. Se a cânula estiver vagamente posicionada e apoiada com um objeto, nenhuma fixação adicional será necessária (consulte a configuração de perfusão na Figura S2 Suplementar). Para estabilizar o local de canulação e evitar o refluxo, uma única gota de n-butil-cianoacrilato monomérico pode ser adicionada ao local de canulação.
3. Quando o sangue cair da cânula, preencha-a com tampão de perfusão quente usando uma seringa.
4. Recoloque o tubo à cânula, ainda funcionando a uma velocidade de bomba de 3 mL/min. Deixe o tampão de perfusão entrar no fígado.
5. Após 2-3 s, procure manchas brancas que se formam no fígado e/ou expansão/inchaço da veia porta, que indicam que o tampão de perfusão está fluindo pelo fígado e entrando nos lóbulos hepáticos a partir da veia central (Figura 3).
6. Espere que a veia porta inche visivelmente dentro de 1-2 s após o aparecimento de manchas brancas na superfície do fígado. Corte a veia porta com uma tesoura o mais distalmente possível do hilo hepático. Use um clipe de microvaso para rotular (não ocluir) o local de corte (Figura 3B).
   NOTA: Isso simplifica a avaliação do fluxo através do fígado durante o processo de perfusão. O fígado limpa o sangue instantaneamente e fica amarelo-branco em poucos segundos (Figura 3C). Um corte adicional através da pele no lado direito da abertura abdominal facilita a saída do sangue, bem como a solução de perfusão (Figura 3B e Figura Suplementar S2B,C).
7. Aumente o fluxo até 4-7 mL/min, dependendo do peso do animal, do tamanho do fígado e da extensão da hepatectomia prévia.
8. Campe a veia porta com pinça ou pinça vascular por 7-10 s. Certifique-se de que nenhum fluido esteja passando.
   NOTA: O fígado incha visivelmente durante o aperto e relaxa após a liberação. Isso é crucial para lavar todo o fígado e limpá-lo de qualquer sangue restante.
9. Realize um segundo grampo após aproximadamente 30 s e certifique-se de que o fígado incha e relaxa. Continue com a lavagem do animal até que o tampão que flui para fora da veia porta esteja claro, mas pelo menos por 3-4 min.
   NOTA: A velocidade da bomba depende do tubo, bem como do tamanho do fígado. Deve ser avaliado individualmente.
10. Neste ponto do procedimento, a eutanásia deveria ter ocorrido secundária à exsanguinação. Confirme que a circulação sistêmica parou (sem batimentos cardíacos ou cintilação do coração). Para garantir a morte, o pneumotórax bilateral é realizado nesta fase do procedimento como método físico secundário de eutanásia.
    NOTA: Reduza ligeiramente a velocidade da bomba se a circulação sistémica tiver parado (sem batimentos cardíacos ou cintilação do coração).

Figura 3: Processo de perfusão desde a canulação até a digestão. (A) Anatomia do fígado de camundongo com a veia cava inferior (seta branca) e a veia porta (seta amarela). (B) Canulação da veia cava inferior. A cânula é fixada com uma ligadura (seta branca), e a localização do fluxo de saída através da veia porta aberta é marcada (não presa) com uma braçadeira de microvaso. (C) Observe o aparecimento de estruturas irregulares antes que o tampão de perfusão tenha eliminado o fígado de todo o sangue restante (seta branca). A pele é incisada (seta amarela) e um cotonete é colocado para garantir a drenagem do sangue e do fluido de perfusão. O pinçamento intermitente pode ser realizado com um grampo vascular ou pinça. (D) O fígado deve ser limpo de todo o sangue (*). Depois que o tampão de digestão contendo colagenase tiver entrado no fígado, ele não relaxará mais após o clampeamento e os lobos do fígado aumentarão de tamanho. (E) Depois de um tempo, uma aparência borbulhante na superfície do fígado pode ser observada (*). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Digestão

1. Pause a bomba de perfusão e transfira rapidamente o tubo de entrada do tampão de perfusão para o tampão de digestão pré-aquecido. Reinicie a bomba.
2. Antes que o tampão de digestão atinja o fígado, prenda a veia porta mais uma vez por 3-4 s. Certifique-se de que o fígado relaxa após a liberação do grampo e o fluido de perfusão permanece claro.
   NOTA: O tampão de digestão contém vermelho de fenol e é facilmente distinguível do tampão de perfusão claro. Isso permite um rastreamento fácil dentro do tubo.
3. Assim que o tampão de digestão tiver atingido o fígado, prenda a veia porta mais uma vez com um clipe de microvaso.
   NOTA: Ao apertar, o fígado incha, mas não relaxa após a liberação da braçadeira. Isso é normal.
4. Para facilitar o processo de digestão, feche a veia cava superior com um grampo vascular diretamente abaixo do diafragma para permitir que o tampão de digestão passe da veia cava inferior para o fígado para o fluxo através da veia porta aberta.
   NOTA: Este aperto garante que a circulação sistémica é contornada e que o contacto desnecessário com componentes/inibidores residuais do sangue é evitado. Esta etapa é opcional, pois é difícil abordar a veia cava superior atrás do tecido hepático aumentado após a cirurgia simulada, mas o acesso é muito mais fácil em camundongos hepatectomizados.
5. Digerir por aproximadamente 4 min a uma taxa de fluxo de 5 mL/min. À medida que a digestão progride, procure sinais de que o fígado começa a inchar e pequenas seções claras / transparentes na superfície do fígado. Além disso, observe que o fígado assume a textura de um pedaço de pano molhado e parece quase encharcado (Figura 3E). Sonde a consistência tocando cuidadosamente com um cotonete úmido.
6. Continue com a perfusão até que uma diferença marcante na textura da superfície do fígado possa ser observada. Observe que o fígado assume uma cor muito clara e uma aparência borbulhante (Figura 3E), e a cápsula de Glison (ou seja, o saco hepático) se separa do parênquima. Pare o processo de digestão assim que o fígado adquirir essas propriedades, pois a digestão excessiva pode danificar os hepatócitos. Remova a agulha antes que o ar entre no fígado.
   NOTA: Normalmente, 10-20 mL de tampão de digestão são necessários para alcançar a digestão suficiente. Isso depende do tamanho do animal, da extensão da hepatectomia, da configuração da tubulação e da qualidade da solução de colagenase. Se necessário, aumente o tempo de perfusão em vez da velocidade de perfusão. Muita pressão no sistema vascular pode fazer com que o fígado exploda e o fluido de perfusão/digestão pode ser perdido para o espaço retroperitoneal.

6. Preparação do fígado

1. Remova o fígado suavemente da cavidade abdominal. Tenha muito cuidado, pois agora é muito frágil e frágil.
2. Segure o tecido conjuntivo central entre os lóbulos usando fórceps e levemente levante-o para cima, usando-o como ponto de ancoragem.
3. Corte todas as conexões do fígado com outros órgãos, remova a vesícula biliar e coloque o fígado no tampão de preservação gelado.
   NOTA: Idealmente, a extração de hepatócitos e o processamento adicional devem ocorrer imediatamente para manter a viabilidade dos hepatócitos. No entanto, se necessário, o fígado pode ser armazenado por um curto período de tempo a 4 °C (por exemplo, para transporte). Este atraso não deve exceder 30-40 min.

7. Extração de hepatócitos

1. Transfira o fígado para uma placa de Petri de 10 cm e adicione 10 mL de E médio de Williams gelado.
2. Rompa a cápsula de Glisson com pinças de ponta fina em alguns locais ao longo da superfície do fígado. Segure uma parte central (por exemplo, tecido conjuntivo no hilo do fígado) com dois pares de pinças e separe-os lentamente, permitindo que a cápsula se rasgue sem danificar os hepatócitos. Solte as células agitando suavemente a cápsula (Figura S3 Suplementar).
   NOTA: Idealmente, o fígado rasga facilmente e libera as células. Não aplique força. Um raspador de células pode ajudar a remover completamente todas as células e aumentar o rendimento celular. Não corte o fígado em pedaços com uma tesoura.
3. Filtrar 5 ml de polpa hepática através de um filtro celular de 100 μm para um tubo de 50 ml. Lave o filtro com 10 mL de meio gelado fresco. Filtrar os restantes 5 ml de polpa através do filtro celular.
   NOTA: Utilizar pipeta sorológica de 25 mL para transferir a polpa hepática com os hepatócitos dissociados (Figura 4A). Pipetas menores com aberturas menores aumentam a tensão de cisalhamento e danificam irreversivelmente os hepatócitos.
4. Adicione um total de 30 mL de meio frio para enxaguar a placa de Petri, filtrá-la e adicione a suspensão ao tubo de 50 mL até que esteja cheia. Todas as células isoladas estão agora em suspensão (Figura 4B).

Figura 4: Purificação por centrifugação suave . (A) Homogeneizado hepático deixado após a etapa de extração. (B) Visão microscópica (ampliação de 20x) do homogeneizado; observe a contaminação marcada com detritos. (C) Etapas de centrifugação de purificação e (D) vistas microscópicas dos sobrenadantes a serem descartados. (E) Visão microscópica da fração purificada de hepatócitos. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Isolamento de hepatócitos

1. Gire a 50 × g durante 5 min a 4 °C (menor aceleração e menor freio possível).
   NOTA: Os hepatócitos são mais densos do que as células hepáticas não parenquimatosas. Devido à baixa força de centrifugação, apenas os hepatócitos são peletizados, enquanto outras células (por exemplo, células imunes, eritrócitos e células sinusoidais) permanecem no sobrenadante.
2. Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células, girando suavemente o tubo.
3. Adicionar 40 mL de meio E de Williams frio e girar novamente a 50 × g por 10 min a 4 °C (baixa aceleração, freio baixo) para remover ainda mais hepatócitos mortos e detritos celulares e hepatócitos viáveis e gordurosos de pellets (Figura 4C).
4. Descarte a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células girando o tubo.
5. Adicione 40 mL de meio E de Williams frio e gire novamente a 50 × g por 5 min a 4 °C (baixa aceleração, freio baixo).
6. Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando 1 mL para ressuspender as células, girando suavemente o tubo.
   Observação : não pare esse processo até que as células são corrigidas ou analisadas. Os hepatócitos são muito frágeis e qualquer atraso no processo de perfusão, digestão e purificação pode danificar as células.
7. Determine a concentração celular final após a adição de azul de tripano, usando uma câmara de contagem melhorada de Neubauer.
   NOTA: A maioria dos detritos e células não parenquimatosas já foram removidos, resultando em uma pelota limpa de aproximadamente 10-15 × 10⁶ hepatócitos deixados após 70%-hepatectomia.
8. Dependendo da concentração desejada, adicione mais meio gelado. Use a suspensão de células de hepatócitos para qualquer análise a jusante ou inicie uma cultura de células primárias.
   NOTA: Nesta fase, apenas algumas células imunes e não parenquimatosas (<5%) permanecem na suspensão. Se uma purificação adicional for desejada, execute uma seleção negativa de células CD31 + e CD45 ⁺ por classificação de células ativadas por magnetismo ou fluorescência (MACS / FACS). Até o momento, não há um marcador de superfície confiável e robusto para as células do parênquima hepático.

9. Preparação dos hepatócitos isolados para citometria de fluxo

1. Centrifugar os hepatócitos a 100 × g durante 5 min.
2. Descarte o sobrenadante e adicione a quantidade desejada de tampão de citometria de fluxo, dependendo da concentração da suspensão celular.
3. Adicionar 1 mL de suspensão celular em um tubo de citometria de fluxo. Centrifugar durante 5 min a 100 × g e eliminar o sobrenadante.
4. Adicione 100-200 μL do corante de viabilidade verde Alexa Fluor 488 Zombie diluído (concentração 1:400) às células e agite-as suavemente. Ressuscite cuidadosamente os hepatócitos agitando manualmente ou usando um misturador de vórtice em baixa velocidade (máximo 2-3) por 2 s.
   Observação : não use pequenas pontas de pipeta para ressuspender as células. Eles são muito frágeis e a tensão de cisalhamento aplicada causa danos e reduz a viabilidade celular. Se a pipetagem não for evitável, use uma pipeta de 1.000 μL depois de cortar a menor parte da ponta para aumentar o diâmetro e pipetar as células muito lentamente.
5. Coloque os tubos no gelo ou guarde-os à temperatura ambiente, dependendo da coloração desejada. Incube as células por 20-30 min no escuro.
6. Adicione 2 mL de tampão de citometria de fluxo e lave as células 3x. Centrifugar as células após cada etapa de lavagem a 100 × g durante 5 min.
7. Adicionar 2 mL de tampão de fixação (1:1 4% PFA e PBS). Ressuscite cuidadosamente os hepatócitos agitando manualmente ou usando um misturador de vórtice em baixa velocidade (máximo 2-3) por 2 s.
8. Fixe as células por 30 min.
9. Centrifugar a 100 × g por mais 5 min, descartar o sobrenadante e adicionar tampão de citometria de fluxo.
   NOTA: As células podem ser armazenadas em tampão de citometria de fluxo antes da análise até 72 h após o isolamento.

10. Análise de hepatócitos com citometria de fluxo

1. Analise os hepatócitos usando um classificador de células ativado por fluorescência.
   NOTA: Considere o tamanho relativamente grande dos hepatócitos e ajuste as tensões. Comece com uma baixa tensão e não vá além de 350 V para dispersão frontal (FSC) e 220 V para dispersão lateral (SSC).
   1. Ajuste as tensões para FSC e SSC para o tamanho grande estimado das células. Identificar a população de hepatócitos e registrar todos os eventos usando SSC-A e FSC-A (Figura 5A).
   2. Observe que os detritos e as células não parenquimatosas são exibidos no canto inferior esquerdo do gráfico de densidade FSC versus SSC e são excluídos (Figura 5A).
   3. Como as células duplas podem afetar a análise, construa um gráfico de densidade de altura de dispersão lateral (SSC-H) versus área de dispersão lateral (SSC-A) para excluir duplicatas, como mostra a Figura 5B.
   4. Selecione a população final de hepatócitos por meio da determinação de células CD31- (marcador endotelial) e CD45^- (marcador imunológico) (Figura 5C).

Resultados

O TRAS atinge o pico às 16 h após a hepatectomia e desaparece gradualmente 32-48 h após a hepatectomia padrão, mas persiste além de 48 h após a hepatectomia prolongada. Macroscopicamente, o TRAS é facilmente visível como uma tez pálida do remanescente hepático (Figura 1F) e pode ser observado em camundongos hepatectomizados entre 16 h e 48 h após a cirurgia.

O rendimento final estimado é de 10-15 × 10 6 hepatócitos após hepatectomia a 70% e 4-9 × 10

Discussão

O protocolo publicado fornece um método confiável e direto para isolar um alto rendimento de hepatócitos murinos normais e esteatóticos para análises a jusante de célula única ou análise em massa de células após a classificação FACS. A vantagem distinta sobre a purificação do gradiente de densidade é que o conteúdo lipídico celular não tem essencialmente impacto no rendimento efetivo dos hepatócitos. Assim, a fração de hepatócitos esteatóticos será retida e incluída nas análises a jusante. Isso não é apenas crucial para ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Alexa Fluor 488 Zombie verde	BioLegend	423111	Corante de viabilidade amina-reativa
Attane Isoflurano ad us. vet. 99,9%	Provet AG	QN01AB06	CUIDADO: precisa
de	Solução EDTA	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-Etanol
	Sigma-Aldrich	V001229	Diluir com água para 70%
de soro fetal bovino (FCS)	Gibco		A5256701-Hanks
(HBSS), Ca2+, Mg2+, vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	Para digestão/preservação
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS), sem Ca2+, sem Mg2+, sem vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	Para solução de tampão de perfusão
HEPES, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Histoacryl
adesivo tecidual (butil-2-cianoacrilato)	B. Braun	1050052	Para estabilização do local de canulação
Hoechst 33258 Solução de corante de coloração	Abcam	ab228550	-
Liberase Grau de Pesquisa	Roche	5401119001	Colagenases liofilizadas I/II
NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Vet Pomada	Dechra	17033-211-38-Fosfato
tamponado salino (PBS)	Gibco		A1286301-Sudan
IV - Coloração lipídica	Sigma-Aldrich		V001423-Temgesic
(cloridrato de buprenorfina), solução injetável 0,3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	Narcóticos. Armazene com segurança.
Azul de tripano, 0,4%,	Sigma-Aldrich	T8154	Para contagem de células
Williams' Médio	E Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materiais
25 mL pipeta sorológica, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
mL Falcon tubos	TPP	-	-
BD Neoflon, Cateter Pro IV 26 G	BD Falcon	Raspador de 391349
células, largura da lâmina rotativa 25 mm	TPP	99004-Filtro	de
Células Falcon 100 µ m Nylon	BD Falcon	352360-Fenestrated
campo cirúrgico estéril	-		Material de pano reutilizável
Bocal de enchimento para tubo de tamanho 16 # (ID 3,1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE # 16	Para entrar nos tubos Tubos
citometria de fluxo, 5 mL	BD Falcon	352008-Male
Luer para Barb, ID da tubulação 3,2 mm	Drifton	LM41	Tubo de conexão para seringa
Placas de Petri, 96 x 21 mm	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	Para retrair o esterno
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	Para sutura da pele
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligadura tubo de vesícula biliar
16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm	perfusão	Drifton	SC0374T
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Citômetro	de Fluxo BD-		-
Isis roedor shaver	Aesculap	GT421-Estação
Isofluran	Provet	-	-
Centrífuga de baixa velocidade • Scanspeed 416	Labogene	--
Câmara de contagem melhorada por Neubauer	Marienfeld	-	-
Concentrador de oxigênio - EverFlo	Philips	1020007	0 - 5 L / min
Pipetboy - Bomba de perfusão Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700-Shenchen
- YZ1515x	Shenchen	YZ1515x-Microscópio
cirúrgico - SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux tapete de aquecimento	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092-Banho-maria
- Banho-maria - Precision GP 02	Thermo	scientific-Ajuste	para 42 ° O