Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Resumo

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Resumo

A hepatectomia parcial tem sido amplamente utilizada para investigar a regeneração hepática em camundongos, mas o isolamento de altos rendimentos de hepatócitos viáveis para aplicações unicelulares a jusante é um desafio. Um acúmulo acentuado de lipídios dentro de hepatócitos em regeneração é observado durante os primeiros 2 dias de regeneração hepática normal em camundongos. Esta chamada esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à principal fase proliferativa. A purificação do gradiente de densidade é a espinha dorsal da maioria dos protocolos existentes para o isolamento de hepatócitos primários. Como a purificação do gradiente depende da densidade e do tamanho das células, ela separa as populações de hepatócitos não esteatóticos dos esteatóticos. Portanto, hepatócitos gordurosos muitas vezes são perdidos, produzindo frações de hepatócitos não representativas.

O protocolo apresentado descreve um método fácil e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores, independentemente de seu conteúdo lipídico. Hepatócitos de camundongos machos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente, usando uma técnica de perfusão retrógrada com saída pela veia porta. Os hepatócitos são dissociados pela colagenase para sua liberação da cápsula de Glisson. Após a lavagem e centrifugação cuidadosa, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante. Em conclusão, este trabalho descreve uma técnica simples e reprodutível para o isolamento de uma população representativa de hepatócitos regenerados após hepatectomia parcial em camundongos. O método também pode ajudar no estudo da doença hepática gordurosa.

Introdução

O fígado pode regenerar-se mesmo após uma grande perda de tecido. Essa capacidade regenerativa única é explicitamente ilustrada pelo modelo experimental de hepatectomia parcial (70%), descrito pela primeira vez em ratos por Higgins e Anderson em 1931¹. Neste modelo, 70% do fígado é removido cirurgicamente dos animais, cortando lobos hepáticos maiores. Os lobos restantes crescem então através de hipertrofia compensatória para restaurar a massa hepática original dentro de cerca de 1 semana após a cirurgia, embora sem restauração da arquitetura hepática original ^2,3. Hepatectomias adiciona....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram de acordo com o Regulamento Federal Suíço de Animais e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 007/2017, 156/2019), garantindo cuidados humanos. Camundongos machos C57BL/6 com idade entre 10-12 semanas foram mantidos em um ciclo de 12 h dia/noite com livre acesso a alimentos e água. Cada grupo experimental foi composto por seis a oito animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Hepatectomia parcial em camundongos

1. Para hepatectomia padrão (70%),....

Resultados

O TRAS atinge o pico às 16 h após a hepatectomia e desaparece gradualmente 32-48 h após a hepatectomia padrão, mas persiste além de 48 h após a hepatectomia prolongada. Macroscopicamente, o TRAS é facilmente visível como uma tez pálida do remanescente hepático (Figura 1F) e pode ser observado em camundongos hepatectomizados entre 16 h e 48 h após a cirurgia.

O rendimento final estimado é de 10-15 × 10 6 hepatócitos após hepatectomia a 70% e 4-9 × 10

Discussão

O protocolo publicado fornece um método confiável e direto para isolar um alto rendimento de hepatócitos murinos normais e esteatóticos para análises a jusante de célula única ou análise em massa de células após a classificação FACS. A vantagem distinta sobre a purificação do gradiente de densidade é que o conteúdo lipídico celular não tem essencialmente impacto no rendimento efetivo dos hepatócitos. Assim, a fração de hepatócitos esteatóticos será retida e incluída nas análises a jusante. Isso não é apenas crucial para .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Alexa Fluor 488 Zombie verde	BioLegend	423111	Corante de viabilidade amina-reativa
Attane Isoflurano ad us. vet. 99,9%	Provet AG	QN01AB06	CUIDADO: precisa
de	Solução EDTA	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-Etanol
	Sigma-Aldrich	V001229	Diluir com água para 70%
de soro fetal bovino (FCS)	Gibco		A5256701-Hanks
(HBSS), Ca2+, Mg2+, vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	Para digestão/preservação
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS), sem Ca2+, sem Mg2+, sem vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	Para solução de tampão de perfusão
HEPES, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Histoacryl
adesivo tecidual (butil-2-cianoacrilato)	B. Braun	1050052	Para estabilização do local de canulação
Hoechst 33258 Solução de corante de coloração	Abcam	ab228550	-
Liberase Grau de Pesquisa	Roche	5401119001	Colagenases liofilizadas I/II
NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Vet Pomada	Dechra	17033-211-38-Fosfato
tamponado salino (PBS)	Gibco		A1286301-Sudan
IV - Coloração lipídica	Sigma-Aldrich		V001423-Temgesic
(cloridrato de buprenorfina), solução injetável 0,3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	Narcóticos. Armazene com segurança.
Azul de tripano, 0,4%,	Sigma-Aldrich	T8154	Para contagem de células
Williams' Médio	E Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materiais
25 mL pipeta sorológica, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
mL Falcon tubos	TPP	-	-
BD Neoflon, Cateter Pro IV 26 G	BD Falcon	Raspador de 391349
células, largura da lâmina rotativa 25 mm	TPP	99004-Filtro	de
Células Falcon 100 µ m Nylon	BD Falcon	352360-Fenestrated
campo cirúrgico estéril	-		Material de pano reutilizável
Bocal de enchimento para tubo de tamanho 16 # (ID 3,1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE # 16	Para entrar nos tubos Tubos
citometria de fluxo, 5 mL	BD Falcon	352008-Male
Luer para Barb, ID da tubulação 3,2 mm	Drifton	LM41	Tubo de conexão para seringa
Placas de Petri, 96 x 21 mm	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	Para retrair o esterno
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	Para sutura da pele
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligadura tubo de vesícula biliar
16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm	perfusão	Drifton	SC0374T
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Citômetro	de Fluxo BD-		-
Isis roedor shaver	Aesculap	GT421-Estação
Isofluran	Provet	-	-
Centrífuga de baixa velocidade • Scanspeed 416	Labogene	--
Câmara de contagem melhorada por Neubauer	Marienfeld	-	-
Concentrador de oxigênio - EverFlo	Philips	1020007	0 - 5 L / min
Pipetboy - Bomba de perfusão Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700-Shenchen
- YZ1515x	Shenchen	YZ1515x-Microscópio
cirúrgico - SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux tapete de aquecimento	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092-Banho-maria
- Banho-maria - Precision GP 02	Thermo	scientific-Ajuste	para 42 ° O

ventilação Solução salina balanceada com filtro estéril de Tubo de