Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

A cultura organoide intestinal é um sistema tridimensional (3D) ex vivo no qual as células-tronco são isoladas das criptas intestinais do tecido primário e plaqueadas em uma matriz de gel ^1,2. Essas células-tronco são capazes de auto-renovação, auto-organização e funcionalidade de órgãos². Os organoides imitam o microambiente tecidual e são mais semelhantes aos modelos in vivo do que os modelos de cultura celular in vitro bidimensionais (2D), embora menos manipuláveis que as células ^3,4. Esse modelo elimina obstáculos encontrados em modelos 2D, como a falta de aderências célula-célula adequadas, interações célula-matriz e populações homogêneas, e também reduz as limitações dos modelos animais, incluindo altos custos e longos períodos de tempo⁵. Os organoides intestinais - também conhecidos como colonóides para aqueles cultivados a partir de células-tronco derivadas de criptas colônicas - são essencialmente mini-órgãos que contêm um epitélio, incluindo todos os tipos de células que estariam presentes in vivo, bem como um lúmen. Esse modelo permite a manipulação do sistema para estudar diversos aspectos do intestino, como o nicho de células-tronco, a fisiologia intestinal, a fisiopatologia e a morfogênese intestinal ^3,5,6. Também fornece um ótimo modelo para a descoberta de medicamentos, estudando distúrbios intestinais humanos, como doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal, desenvolvimento de tratamento personalizado específico do paciente e estudo da regeneração tecidual 4,7,8,9. Além disso, o sistema organoide também pode ser utilizado para estudar a comunicação celular, o metabolismo de fármacos, a viabilidade, a proliferação e a resposta a estímulos ^7,8. Embora os modelos animais possam ser usados para testar potenciais terapêuticas para condições patológicas intestinais, eles são bastante limitados, pois o estudo de várias drogas ao mesmo tempo representa um desafio. Há mais variáveis de confusão in vivo, e o custo e o tempo associados são altos e longos, respectivamente. Por outro lado, o sistema de cultura de organoides permite a triagem de muitas terapêuticas de uma só vez em um período de tempo mais curto e também permite o tratamento personalizado por meio do uso de cultura organoide derivada do paciente ^4,8. A capacidade dos organoides colônicos de imitar a organização, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos também os torna um excelente modelo para o estudo da regeneração e do reparo tecidual⁹. Nosso laboratório estabeleceu um sistema de cultura organoide do intestino delgado para estudar o efeito da claudina-7 nas funções das células-tronco do intestino delgado¹⁰. Neste estudo, um sistema de cultura de organoides do intestino grosso é estabelecido para estudar a capacidade, ou a falta de habilidade, das células-tronco de se auto-renovarem, diferenciarem e proliferarem em um modelo condicional de nocaute de claudina-7 (cKO).

A Claudin-7 é uma proteína de junção apertada (TJ) muito importante, altamente expressa no intestino e essencial para a manutenção da função e integridade do TJ¹¹. Camundongos cKO sofrem de fenótipo semelhante ao da DII, exibindo inflamação grave, ulcerações, descamação de células epiteliais, adenomas e aumento dos níveis de citocinas^11,12. Embora seja amplamente aceito que os claudins são vitais para a função de barreira epitelial, novos papéis para os claudins estão surgindo; estão envolvidos na proliferação, migração, progressão do câncer e função das células-tronco 10,12,13,14,15,16,17. Atualmente, não se sabe como a claudina-7 afeta o nicho de células-tronco e a função das células-tronco colônicas. Como o intestino se auto-renova rapidamente aproximadamente a cada 5-7 dias, a manutenção do nicho de células-tronco e o bom funcionamento das células-tronco ativas são vitais¹⁸. Aqui, um sistema é estabelecido para examinar os potenciais efeitos regulatórios da claudina-7 no nicho de células-tronco colônicas.

Todos os experimentos e procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da East Carolina University (ECU) e conduzidos em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e ECU sobre cuidados e uso de animais de laboratório. Camundongos knockout induzíveis e específicos do intestino foram gerados pelo cruzamento de camundongos transgênicos C57BL6 claudin-7-flox com camundongos Villin-CreERT2¹⁹. Camundongos machos e fêmeas com idade de 3 meses foram utilizados neste estudo.

1. Preparação do reagente/equipamento

1. Arrefecer os seguintes reagentes/equipamentos antes de iniciar as suas experiências associadas: solução salina tamponada com fosfato (PBS) para lavagem do tecido do cólon durante o isolamento da cripta; um balancim/rotador (colocado num frigorífico de 4 °C) para incubação com meio de dissociação epitelial.
   1. Remover a matriz de gel (ver Tabela de Materiais) de -20 °C e descongelar no gelo antes do revestimento.
   2. Pré-arrefecer a centrífuga a 4 °C antes de girar criptas para revestimento.
   3. Arrefecer o tampão de citrato de sódio a 0,1% (ver Tabela de Materiais) e manter no gelo antes da deteção da morte celular in situ .
2. Aquecer os seguintes reagentes antes de iniciar seus experimentos associados: uma placa de cultura de 96 poços por 24 h antes do revestimento; Mídia L-WRN (consulte Tabela de Materiais) antes de adicionar às criptas chapeadas e antes de cada alteração de mídia.
   1. Aqueça o banho-maria a 94 °C antes de colorir.

2. Isolamento de cripta colônica murina

1. Prepare a mídia necessária seguindo os passos abaixo.
   NOTA: Os volumes de mídia são calculados aqui para o tecido colônico de dois camundongos.
   1. Preparar meios de dissociação epitelial: 30 mL de 1x PBS + 400 μL de 0,5 M EDTA + 50 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632 de 10 mM (ver Tabela de Materiais). Mantenha no gelo até o uso.
   2. Preparar meios de dissociação de cripta: 10 mL de 1x PBS + 10 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632. Mantenha no gelo até o uso.
   3. Suplemento L-WRN meio: 50 mL de L-WRN meio + 47,5 mL de DMEM glicose elevada com L-Glutamina + 500 μL de L-glutamina + 500 μL de pennicilina/estreptomicina + 1.000 μL de suplemento B-27 (50x) + 500 μL de suplemento N2 (100x) + 50 μL de solução tampão HEPES (1 M) (ver Tabela de Materiais).
   4. Filtrar o meio L-WRN completo (suplementado) e a alíquota para armazenamento a -20 °C por até 3 meses.
      NOTA: O meio descongelado é estável a 4 °C até 2 semanas.
2. Execute o isolamento da cripta.
   1. Para anestesia geral, adicione 1 mL de isoflurano ao algodão e coloque-o dentro de um de plástico dentro de uma câmara de anestesia de 0,09 pés cúbicos (ver Tabela de Materiais). Coloque o rato na câmara de anestesia até que a respiração pare (aproximadamente 3-5 min) e, em seguida, realize a luxação cervical²⁰.
   2. Faça uma incisão de aproximadamente 2 na linha média do rato, prendendo a pele das costas para expor o abdômen. Isolar o cólon cortando logo abaixo do ceco do lado proximal e acima do reto do lado distal²¹.
   3. Usando fórceps, remova o tecido adiposo ligado ao cólon. Empurre suavemente as fezes para fora utilizando a extremidade plana da pinça e corte o tecido aberto longitudinalmente.
   4. Lave o tecido 10-15 vezes com PBS frio 1x usando pinça para "girar" o tecido em torno de PBS entre as lavagens.
   5. Usando uma tesoura limpa e afiada, corte o tecido em pequenos pedaços, com aproximadamente 3-5 mm de tamanho.
   6. Repetir o processo para o segundo ratinho e combinar os pedaços de tecido num tubo de 50 ml contendo meios de dissociação epitelial fria (passo 2.1.1).
   7. Incubar os pedaços de tecido do cólon em meio de dissociação epitelial por 90 min a 4 °C com balanço suave.
   8. Permita que os fragmentos de tecido afundem no fundo do tubo e, em seguida, descarte cuidadosamente o meio de dissociação epitelial sem interromper o tecido. Repita este processo ao lavar o tecido 10-15 vezes com PBS frio 1x. Descarte o máximo de PBS possível durante a lavagem final.
   9. Adicionar meio de dissociação de cripta (passo 2.1.2) ao tubo de 50 ml contendo pedaços de tecido do cólon e agitar continuamente durante 5-10 min à mão.
      NOTA: A mídia deve ficar turva das criptas dissociadas.
   10. Sob o exaustor de cultura celular, filtre o tecido e o meio com um filtro de células de nylon de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um tubo fresco de 50 mL.
   11. Centrifugar a 200 x g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante sem perturbar o pellet que contém cripta.
       NOTA: Dependendo do equipamento, pode-se transferir o meio tenso para um tubo de 15 mL para centrifugação.
   12. Ressuscite o pellet em ~3-4 mL de PBS frio 1x.
   13. Pipeta 10 μL das criptas isoladas em uma linha em uma lâmina de microscópio. Sob o microscópio, conte o número de criptas longas e cheias para estimar a concentração de criptas por 10 μL.
   14. Calcule o volume apropriado de criptas para girar para baixo, a fim de chapar 10 criptas / μL em uma placa de 96 poços.

3. Revestimento de criptas

1. Centrifugar um volume apropriado de criptas isoladas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 200 x g por 5 min a 4 °C.
2. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1.000 μL sem interromper as criptas peletizadas.
3. Adicione 100 μL de matriz de gel (o suficiente para nove poços) às criptas e pipetas peletizadas cuidadosamente para evitar a introdução de bolhas de ar.
   NOTA: Consulte a seção Discussão para obter uma descrição detalhada de como misturar a matriz de gel e criptas. Normalmente, 100 μL são suficientes para nove poços.
4. Deixe a matriz de gel solidificar parcialmente (~1-2 min).
5. Placa de 10 μL da matriz de gel misturada com as criptas em cada poço de uma placa de cultura pré-aquecida de 96 poços para formar uma forma de cúpula.
   NOTA: Coloque a cúpula no centro do poço. Tenha cuidado para não permitir que a matriz de gel se espalhe para os lados do poço. Consulte a seção Discussão para obter uma descrição detalhada sobre solidificação e chapeamento.
6. Deixe a matriz de gel ser totalmente ajustada por 10-20 min em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
7. Preparar a solução de trabalho final da mídia L-WRN.
   1. Adicionar 100 μL de penniilina/estreptomicina a uma alíquota de 10 ml de L-WRN (ver passo 2.1.3) (estável durante 2 semanas a 4 °C).
   2. Adicionar suplementos a 900 μL de L-WRN com pennicilina/estreptomicina: 0,9 μL de 1 mg/mL de EGF + 0,9 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632.
      NOTA: Os volumes são baseados em nove poços. O dicloridrato Y-27632 só é adicionado no dia 0 (no momento do chapeamento).
8. Adicione 100 μL de mídia a cada poço. Tenha cuidado para não atrapalhar a cúpula.
9. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.

4. Criando nocaute de claudin-7 na cultura

1. Permita que as criptas cresçam normalmente em cultura por 24 horas após o revestimento.
2. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 2,7 μL de 4-hidroxitamoxifeno (4OH-Tamoxifeno) a 900 μL de meio L-WRN (concentração final de 3 μmol/L) + 0,9 μL de EGF de 1 mg/mL.
   NOTA: A solução-mãe de 4OH-Tamoxifeno é preparada misturando 4OH-Tamoxifeno em pó (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS a uma concentração de 1 mmol / L.
3. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo.
4. Adicionar 100 μL de meios contendo 4OH-tamoxifeno a cada alvéolo e rotulá-los como claudina-7 cKO/4OH-TAM.
   NOTA: DMSO precisa ser adicionado aos poços de controle. Meios frescos contendo 4OH-tamoxifeno devem ser adicionados a cada 2 dias.
5. Incubar a 37 °C até à próxima mudança do meio (~2-3 dias).

5. Manutenção de organoides colônicos

NOTA: A mídia deve ser alterada a cada 2-3 dias. Cultura até 12 dias.

1. Preparar uma nova solução de trabalho final de meio L-WRN: 900 μL de meio L-WRN + 0,9 μL de 1 mg/mL de EGF.
2. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo. Adicione mídia fresca aos poços.
   NOTA: Tenha cuidado para não interromper a cúpula.
3. Incubar a 37 °C até à próxima mudança do meio.
   NOTA: As culturas podem ser mantidas e passadas durante a duração desejada para o experimento. As culturas para o presente estudo foram tipicamente mantidas entre 9-12 dias, mas pode-se desejar continuar por mais tempo, por 15 ou 20 dias.

6. Colheita e incorporação de organoides colônicos

1. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo.
2. Fixar os organoides com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 1 h à temperatura ambiente.
   NOTA: O PFA é um material tóxico. Tome precauções ao usar este reagente.
3. Retirar 4% de PFA dos poços por sucção a vácuo e adicionar 30% de sacarose por 24 h a 4 °C.
4. Rotule um molde de plástico e encha-o a 90% com composto de temperatura de corte ideal (OCT) (consulte Tabela de Materiais).
5. Remova 30% de sacarose dos poços através de sucção a vácuo. Adicione 10 μL de 1x PBS a cada poço.
6. Com uma ponta de pipeta, risque suavemente o fundo do poço para dissociar a cúpula que contém organoides.
7. Com uma pipeta, remova o PBS que contém os organoides dissociados e carregue o líquido no molde contendo OCT.
   NOTA: Evite introduzir bolhas no composto OCT.
8. Continue este processo até que todos os organoides tenham sido removidos de todos os poços.
9. Num balão Dewar de aço inoxidável, adicionar pellets de gelo seco e 2-metilbutano (suficiente para cobrir os pellets de gelo seco) (ver Tabela de Materiais).
10. Segure firmemente o bloco OCT contendo organoides acima do 2-metilbutano para congelar rapidamente.
11. Conservar o bloco OCT contendo organoides a -80 °C até estar pronto para a secção (pode ser conservado até 1 ano).

7. Imunofluorescência

1. Secção do bloco OCT contendo organoides a uma espessura de 5 μm utilizando um criostato (ver Tabela de Materiais) a -20 °C.
2. Para cada seção, verifique sob o microscópio para garantir que um organoide foi capturado. Quando o corte estiver concluído, armazene as lâminas a -80 °C até que estejam prontas para manchar (podem ser armazenadas por até 6 meses).
3. Aquecer as lâminas em tampão de citrato de sódio a 10 mM durante 10 minutos a 94 °C.
   NOTA: O tampão é feito pela dissolução do citrato de sódio em água deionizada. Ajuste o pH para 6 com ácido clorídrico.
4. Deixe os slides esfriarem na bancada por 20 minutos. Enxaguar com água destilada por 5 min.
5. Monte as lâminas em um rack de coloração (ver Tabela de Materiais) com Triton X-100 a 0,2% e incube com glicina 100 mM por 15 min.
6. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Bloco com albumina sérica bovina (BSA) a 5% por 45 min à temperatura ambiente.
7. Incubar com claudina-7 anticorpo primário²² anti-coelho murino (diluído em 1% de BSA) durante a noite a 4 °C. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
8. Incubar com o anticorpo secundário Cy3 anti-coelho²³ (diluído em 1% de BSA) durante 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
9. Monte as lâminas com um meio de montagem apropriado (consulte Tabela de materiais) com DAPI e adicione uma folha de cobertura.

8. Detecção de morte celular

1. Fixe os organoides dentro dos poços com paraformaldeído a 4% por 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar com 1x PBS por 5 min.
2. Incubar a placa de cultura sobre gelo com Triton X-100 a 0,1% em tampão frio de citrato de sódio a 0,1% por 2 min. Enxaguar duas vezes com 1x PBS por 5 min cada.
3. Preparar a reação TUNEL^24,25 utilizando TMR Red^, um kit de deteção de morte celular in situ(ver Tabela de Materiais). Adicionar 50 μL de reagentes de reação TUNEL a cada poço.
4. Incubar numa atmosfera humidificada durante 1 h a 37 °C no escuro.
   NOTA: Todas as etapas restantes devem ser concluídas no escuro.
5. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Incubar com 1:2.500 Hoechst (diluído em 1x PBS, ver Tabela de Materiais) durante 3 min.
6. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Utilize o filtro TRITC para visualizar imagens em um microscópio fluorescente (consulte Tabela de materiais).

A fim de examinar os efeitos regulatórios da claudina-7 sobre as células-tronco do cólon, criptas colônicas foram isoladas do tecido do cólon murino, conforme descrito acima e mostrado na Figura 1A. Uma vez que as criptas foram isoladas do tecido primário, elas foram revestidas em uma matriz 3D em uma placa de 96 poços para crescer por 11 dias (Figura 1). Criptas saudáveis normais fecharão o lúmen e se tornarão esferoides no dia 2 e, eventualmente, começarão a brotar e formar os vários tipos de células epiteliais aproximadamente no dia 5 (Figura 1B). Os colonóides foram autorizados a crescer até o dia 11, onde foram então colhidos para novos experimentos (Figura 1B). Para nocautear claudin-7 na cultura, as criptas foram autorizadas a crescer normalmente por 24 h. Após 24 h, as criptas foram tratadas com 3 μmol/L de 4OH-Tamoxifeno (TAM) e cultivadas por mais 10 dias. O meio de cultura contendo 4OH-TAM fresco foi trocado a cada 2 dias. O DMSO foi utilizado como veículo em poços de controle. As criptas deficientes em Claudin-7 (claudin-7 KO) não conseguiram formar esferoides adequados e começaram a morrer rapidamente após 1 dia de tratamento com 4OH-TAM (Figura 1B).

A Figura 2A destaca o crescimento bem-sucedido de colonóides de criptas normais contendo claudina-7 (controle) à medida que progridem ao longo dos 9 dias de cultura. Essas criptas começaram a formar esferoides no dia 2, começaram a brotar no dia 5 e continuaram crescendo e brotando até serem colhidas no dia 9 (Figura 2A). Em contraste, criptas sem claudin-7 (claudin-7 KO) deterioraram-se muito rapidamente (Figura 2B). Aproximadamente 2-3 dias após o tratamento com 4OH-TAM, as criptas de claudin-7 KO não formaram esferoides de aparência saudável e apareceram apenas como aglomerados circulares de células (Figura 2B). Criptas isoladas de camundongos do tipo selvagem foram tratadas com 4OH-TAM para confirmar que não há efeito tóxico devido ao tratamento com tamoxifeno; essas criptas foram capazes de sobreviver e crescer normalmente. Para examinar a deleção da claudina-7 e a condição de sobrevida dos colonoides KO da claudina-7, foram utilizados um método de imunocoloração e um kit de detecção de morte celular in situ (Figura 3). A coloração imunofluorescente para claudina-7 em controle colhido e organoides cKO confirmou o knockout bem-sucedido da claudina-7 em cultura (Figura 3A). Os colonoides controle do 9º dia apresentaram muito pouco sinal apoptótico (Figura 3B); no entanto, os colonóides KO da claudina-7 apresentaram alta apoptose (Figura 3B). Sem claudina-7, as células-tronco não poderiam sobreviver, se auto-renovar ou se diferenciar para formar colonóides.

Figura 1: Representação esquemática mostrando o isolamento da cripta e o crescimento do colonóide. (A) Descrição gráfica do processo de isolamento da cripta, chapeamento na matriz 3D e crescimento até a colheita. (B) Linha do tempo de experimentos e crescimento de colonóides no controle e criptas derivadas de claudin-7 KO. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Os colonóides deficientes em Claudin-7 são incapazes de sobreviver e crescer . (A) Imagens representativas dos organoides controle/DMSO no dia 3 e no dia 9. (B) Imagens representativas de organoides 4OH-TAM/cKO no dia 3 e no dia 9, n = 10. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Colonoides deficientes em Claudin-7 sofrem rapidamente apoptose. (A) Coloração Claudin-7 no dia 9 controle/DMSO e claudina-7 cKO/4OH-TAM organoides, n = 3. Barras de escala = 250 μm. (B) Coloração apoptótica no dia 9 controle e colonoides cKO/4OH-TAM claudin-7, n = 3. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.