O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.
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Artigo de método
Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O epitélio intestinal se regenera a cada 5-7 dias e é controlado pela população de células-tronco epiteliais intestinais (IESC) localizada na parte inferior da região da cripta. Os IESCs incluem células-tronco ativas, que se auto-renovam e se diferenciam em vários tipos de células epiteliais, e células-tronco quiescentes, que servem como células-tronco de reserva em caso de lesão. A regeneração do epitélio intestinal é controlada pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação dessas IESCs ativas. Além disso, o equilíbrio da população de células-tronco criptas e a manutenção do nicho de células-tronco são essenciais para a regeneração intestinal. A cultura organoide é uma abordagem importante e atraente para estudar proteínas, moléculas de sinalização e pistas ambientais que regulam a sobrevivência e as funções das células-tronco. Este modelo é menos caro, menos demorado e mais manipulável do que os modelos animais. Os organoides também imitam o microambiente tecidual, proporcionando relevância in vivo. O presente protocolo descreve o isolamento de criptas colônicas, incorporando essas células de cripta isoladas em um sistema de matriz de gel tridimensional e cultivando células de cripta para formar organoides colônicos capazes de auto-organização, proliferação, auto-renovação e diferenciação. Este modelo permite manipular o ambiente - nocauteando proteínas específicas, como a claudina-7, ativando/desativando vias de sinalização, etc. - para estudar como esses efeitos influenciam o funcionamento das células-tronco colônicas. Especificamente, o papel da proteína claudina-7 de junção apertada na função das células-tronco colônicas foi examinado. Claudin-7 é vital para manter a homeostase intestinal e função de barreira e integridade. O knockout da claudina-7 em camundongos induz um fenótipo semelhante à doença inflamatória intestinal, exibindo inflamação intestinal, hiperplasia epitelial, perda de peso, ulcerações mucosas, descamação de células epiteliais e adenomas. Anteriormente, foi relatado que a claudina-7 é necessária para as funções das células-tronco epiteliais intestinais no intestino delgado. Neste protocolo, um sistema de cultura organoide colônica é estabelecido para estudar o papel da claudina-7 no intestino grosso.
Introdução
A cultura organoide intestinal é um sistema tridimensional (3D) ex vivo no qual as células-tronco são isoladas das criptas intestinais do tecido primário e plaqueadas em uma matriz de gel 1,2. Essas células-tronco são capazes de auto-renovação, auto-organização e funcionalidade de órgãos2. Os organoides imitam o microambiente tecidual e são mais semelhantes aos modelos in vivo do que os modelos de cultura celular in vitro bidimensionais (2D), embora menos manipuláveis que as células 3,4. Esse modelo el....
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Protocolo
Todos os experimentos e procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da East Carolina University (ECU) e conduzidos em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e ECU sobre cuidados e uso de animais de laboratório. Camundongos knockout induzíveis e específicos do intestino foram gerados pelo cruzamento de camundongos transgênicos C57BL6 claudin-7-flox com camundongos Villin-CreERT219. Camundongos machos e fêmeas com idade de 3 meses foram utilizados neste estudo.
1. Preparação do reagente/equipamento
- Arrefecer os seguintes r....
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Resultados
A fim de examinar os efeitos regulatórios da claudina-7 sobre as células-tronco do cólon, criptas colônicas foram isoladas do tecido do cólon murino, conforme descrito acima e mostrado na Figura 1A. Uma vez que as criptas foram isoladas do tecido primário, elas foram revestidas em uma matriz 3D em uma placa de 96 poços para crescer por 11 dias (Figura 1). Criptas saudáveis normais fecharão o lúmen e se tornarão esferoides no dia 2 e, eventualmente, começarão a b.......
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Discussão
A cultura organoide é um excelente modelo para o estudo da função das células-tronco, fisiologia intestinal, descoberta de medicamentos, doenças intestinais humanas e regeneração e reparo tecidual 7,8,9,10,11,26. Embora tenha muitas vantagens, pode ser um desafio estabelecer. Deve-se ter cuidado em todas as etapas ao longo do.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo NIH DK103166.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dessecador a vácuo economizador de espaço de 0,09 pés cúbicos | anestesia | States Plastic Corp | 78564 |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9261 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | ThermoFisher | 69715 | |
| Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco' s Fosfato tamponado com solução salina | Gibco | 14190-144 | |
| 2-metilbutano | Sigma | 277258 | |
| 4% de paraformaldeído | ThermoFisher | J61899. | |
| 4-hidroxitamoxifeno (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µ Filtro de células de nylon M | Corning | 352350 | |
| Placa de cultura de 96 poços | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Suplemento (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Albumina de soro bovino | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murino coelho anticorpo | Laboratórios Imuno-Biológicos | 18875 | |
| Vidro de cobertura (24 x 50-1,5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Tipo 2 | R& D Systems | 3533-005-02 | matriz de gel |
| Cy3 anticorpo anti-coelho | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Frasco | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM Alta Glicose com L-Glutamina | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS Sistema de Imagem Flamote | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II com | DAPI Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Solução Tampão | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| Kit de detecção de morte celular in situ, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurano | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Derivação Organoide Gastrointestinal e Núcleo de Cultura | N / A | |
| Kit cirúrgico de camundongo | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Suplemento (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Composto de temperatura de corte ideal (OCT) | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Citrato de Sódio | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sacarose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Filtro de Aspirador (0.22 µ m; acetato de celulose) | Corning | 430769 | |
| dicloridrato de Y-27632 | Tocris Bioscience | 1254 |
Referências
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of e....
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Reimpressões e permissões
