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Artigo de método

Hipertermia gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética: um método de tratamento viável em um modelo de rabdomiossarcoma murino

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DOI:

10.3791/64544

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13 de janeiro de 2023

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children, 4Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 6Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary, 7Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 8Department of Medical Imaging, University of Toronto, 9Department of Pediatric Surgery, University of Toronto, 10Department of Surgery, University of Toronto

Neste artigo

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Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para usar hipertermia controlada, gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética, para desencadear a liberação de drogas de lipossomas sensíveis à temperatura em um modelo de rabdomiossarcoma em camundongos.

Resumo

O ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética (MRgHIFU) é um método estabelecido para produzir hipertermia localizada. Dada a imagem em tempo real e a modulação da energia acústica, esta modalidade permite o controle preciso da temperatura dentro de uma área definida. Muitas aplicações térmicas estão sendo exploradas com essa tecnologia não invasiva e não ionizante, como a geração de hipertermia, para liberar fármacos de portadores lipossomais termossensíveis. Essas drogas podem incluir quimioterapias como a doxorrubicina, para as quais a liberação direcionada é desejada devido aos efeitos colaterais sistêmicos limitantes da dose, ou seja, cardiotoxicidade. A doxorrubicina é um pilar para o tratamento de uma variedade de tumores malignos e é comumente usada no rabdomiossarcoma (RMS) recidivante ou recorrente. RMS é o tumor extracraniano sólido de partes moles mais comum em crianças e adultos jovens. Apesar da terapia agressiva e multimodal, as taxas de sobrevida da RMS permaneceram as mesmas nos últimos 30 anos. Para explorar uma solução para atender a essa necessidade não atendida, um protocolo experimental foi desenvolvido para avaliar a liberação de doxorrubicina lipossomal termossensível (TLD) em um modelo de RMS singênico imunocompetente usando MRgHIFU como fonte de hipertermia para liberação de fármacos.

Introdução

O rabdomiossarcoma (RMS) é um tumor de músculo esquelético que ocorre mais comumente em crianças e adultosjovens1. A doença localizada é frequentemente tratada com tratamento multimodal, incluindo quimioterapia, radiação ionizante e cirurgia. O uso de esquemas quimioterápicos multidrogas é mais prevalente em pacientes pediátricos, com melhores resultados em comparação com seus pares adultos2; no entanto, apesar dos esforços de pesquisa em andamento, a taxa de sobrevida em 5 anos permanece em torno de 30% na forma mais agressiva da doença 3,4. O tratamento padrão de quimioterapia é um esquema multidrogas que inclui vincristina, ciclofosfamida e actinomicina D. Em casos de doença recidivante ou recorrente, quimioterapias alternativas são usadas, incluindo doxorrubicina (FD) padrão (livre) e ifosfamida1. Embora todas essas quimioterapias tenham toxicidade sistêmica, a cardiotoxicidade da doxorrubicina impõe uma limitação de dose por toda a vida 5-7. Para aumentar a quantidade de fármaco entregue ao tumor e minimizar a toxicidade sistêmica, formulações alternativas têm sido desenvolvidas, incluindo o encapsulamento lipossomal. Podem ser doxorrubicina não termossensível, aprovada para o tratamento de câncer de mama e carcinoma hepatocelular, ou doxorrubicina termossensível, cujos ensaios clínicos estão em andamento 8,9,10,11,12,13. Métodos alternativos para a administração de drogas lipossomais encapsuladas, como lipossomas multivesiculares e lipossomas direcionados por ligantes, têm sido avaliados e se mostram promissores para o tratamento detumores9. Neste estudo, a adição de calor tem impactos multifatoriais, incluindo a liberação do fármaco14. A combinação de hipertermia (HT) gerada com ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética (MRgHIFU) e doxorrubicina lipossomal termossensível (TLD) é uma nova abordagem terapêutica multimodal para o uso dessa droga tóxica, mas eficaz no tratamento da SMR, minimizando a toxicidade limitante da dose e potencialmente aumentando a resposta imune ao tumor.

A doxorrubicina liberta-se rapidamente de TLD a temperaturas >39 °C, muito acima da temperatura média do corpo humano de 37 °C, mas não suficientemente elevada para causar danos nos tecidos ou ablação; isso começa a ocorrer a 43 °C, mas ocorre mais rapidamente quando as temperaturas se aproximam de 60 °C15. Vários métodos têm sido utilizados para gerar TH in vivo, incluindo lasers, micro-ondas, ablação por radiofrequência e ultrassom focado, muitos dos quais são métodos invasivos de aquecimento16. MRgHIFU é um método de aquecimento não invasivo e não ionizante que facilita ajustes precisos de temperatura dentro do tecido alvo in situ. A ressonância magnética (RM) fornece imagens em tempo real, onde o software de computador pode ser usado, para calcular uma medida de termometria do tecido durante o tratamento; Posteriormente, esses dados podem ser utilizados para controlar a terapia ultrassônica em tempo real para atingir e manter um set point de temperaturadesejado17. O MRgHIFU tem sido testado em vários tipos de tecidos e pode ser usado para uma ampla gama de tratamentos de temperatura, desde TH leve até ablação, bem como clinicamente para tratar com sucesso metástases ósseas dolorosas18. Além disso, foi demonstrado que a TH causa citotoxicidade tumoral, modula a expressão proteica e altera a resposta imune no microambiente tumoral 19,20,21,22. Um estudo combinou TH leve com DTL, seguido de ablação com MRgHIFU, em um modelo sinérgico de R1 emratos23, resultando em necrose no núcleo do tumor e liberação da droga para a periferia. Tradicionalmente, a radioterapia tem sido usada como terapia adjuvante para danificar as células tumorais e diminuir a recorrência local da doença. No entanto, seu uso é limitado pela dosagem ao longo da vida e danos fora do alvo1. Assim, a HT é única na medida em que pode causar alguns dos mesmos efeitos sem as mesmas toxicidades ou limitações.

Modelos animais pré-clínicos para RMS incluem modelos imunocompetentes singênicos e xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) em hospedeiros imunocomprometidos. Embora os modelos imunocomprometidos permitam o crescimento dos tumores humanos, eles não possuem o microambiente tumoral apropriado e são limitados em sua capacidade de estudar a resposta imune24. A mutação ativadora do FGFR4 é um marcador promissor de mau prognóstico e um potencial alvo terapêutico em RMS adulto e pediátrico 1,25. Nos modelos singênicos de RMS desenvolvidos no laboratório de Gladdy, os tumores são capazes de crescer em um hospedeiro imunocompetente, que desenvolve respostas imunes inatas e adaptativas aotumor26. Como a TH influencia a resposta imune, a observação da alteração na resposta imune murina é uma vantagem valiosa desse modelo tumoral. Para testar tanto a resposta tumoral ao TLD em comparação com a DF, quanto a mudança na resposta imune do tumor tanto à quimioterapia quanto à TH, um protocolo foi desenvolvido e empregado para tratar tumores RMS murinos singênicos in vivo usando MRgHIFU e TLD, que é o foco deste estudo.

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Protocolo

A pesquisa foi realizada em conformidade com os comitês de cuidados com animais com protocolos de uso de animais aprovados sob um veterinário supervisor nas instalações de pesquisa animal do Centro de Fenogenômica (TCP) e do Centro de Recursos Animais (ARC) da University Health Network (UHN). Todos os procedimentos, exceto o MRgHIFU, envolvendo os animais foram realizados em um gabinete de segurança biológica (BSC) para minimizar a exposição dos animais ao ar externo ou infecção suscetível.

1. Criação de camundongos

NOTA: Um total de 65 camundongos (linhagem B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) foram incluídos no estudo piloto (macho: n = 23; fêmea: n = 42). Camundongos machos e fêmeas foram usados com 7-9 semanas de idade. Seus filhotes foram desmamados e genotipados, e os camundongos heterozigotos p53 foram utilizados para os experimentos.

  1. Abrigar dois camundongos fêmeas com cada camundongo macho para criar gaiolas de reprodução. Conte as idades de seus filhotes desde o nascimento (nascimento = dia 0).
  2. No dia 10, identifique os filhotes com um entalhe na orelha. Colete snips de cauda para genotipagem antes da injeção de linha celular.

2. Genotipagem em camundongos

  1. Extrair o DNA dos recortes de cauda de 2 mm coletados usando um kit comercial de extração de DNA (consulte a Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
  2. Determinar a concentração e pureza do ADN medindo a absorbância a 260-280 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de Materiais).
  3. Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR).
    1. Crie uma mistura mestre contendo uma mistura comercial de PCR (contendo Taq polimerase, dNTPS e MgCl 2; consulte Tabela de Materiais), primer e dH2 O em umaproporção de 12,5:0,25:10,75 (μL) para o número necessário de amostras. Adicionar 1 μL de amostra de DNA a cada tubo de PCR e incluir dH2O, uma amostra nula (homozigótica para a mutação p53), uma amostra heterozigótica (heterozigota para a mutação p53) e uma amostra selvagem (homozigota para p53 normal) como controles de PCR.
    2. Adicionar 24 μL da mistura principal a cada tubo de PCR contendo ADN. Pipetar a solução em cada tubo de PCR para cima e para baixo para distribuir o DNA por toda a mistura principal.
    3. Coloque os tubos de reação em um termociclador e cicle de acordo com as seguintes especificações: 95 °C por 2 min, 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 15 s e 72 °C por 1 min, e depois mantenha a 4 °C até estar pronto para analisar no gel.
  4. Analisar os produtos de PCR usando eletroforese em gel de agarose.
    1. Preparar um gel a 2% (50 ml de 1x TAE e 1 g de agarose) aquecendo a agarose no TAE e misturando até dissolver. Quando arrefecer e ainda líquido, adicionar 2,5 μL de coloração de gel de ADN à agarose e misturar. Jogue o gel em uma caixa de gel com um pente. Coloque o gel no aparelho eletroforético (ver Tabela de Materiais) e cubra com 1x TAE.
    2. Carregar 10 μL de 1 kB DNA Ladder no gel. Carregar 12,5 μL de cada amostra. Passe o gel durante 25 minutos a 135 V.
    3. Imagem do gel usando as configurações apropriadas para a coloração de gel de DNA usada em um imageador de gel (consulte a Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.

3. Preparo do modelo tumoral (Figura 1)

  1. Cultivar a linhagem celular M25FV24C (passagem 12-15) 1 semana antes da data de injeção em meio de crescimento completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] com aditivos: 10% FBS, 1% Penicilina/Estreptomicina e 2 mM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo) em um frasco de 75 mL, a 37 °C e 5% CO2. Uma vez que as células estejam ~80% confluentes, aspirar o meio e lavar as células 1x com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    NOTA: M25FV24C é uma linhagem celular murina projetada para superexpressar o mutante FGFR4V550E, que é observado em RMS pediátrico e adulto 1,26.
  2. Levantar as células adicionando 0,5 mL de solução de tripsina a 0,25% ao lado da placa e incubando o vaso por 2-3 min à temperatura ambiente. Uma vez que as células aparecem destacadas, adicionar 2,5 mL de meio de crescimento completo à temperatura ambiente para inativar a tripsina. Use uma alíquota de amostra de 10 μL para determinar a concentração celular de células viáveis usando um hemocitômetro e exclusão de azul de tripano.
  3. Prepare o volume correto de células suspensas em DPBS para injeção e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL: volume para centrífuga = (número de camundongos × número de células por camundongo)/ (concentração de células), onde o número de camundongos = os camundongos a serem injetados + 10 camundongos extras para erro, e o número de células por camundongo = 104.
  4. Centrifugar por 5 min a 153 x g. Ressuspender o pellet celular no volume apropriado (10 μL por camundongo × número de camundongos) de tampão de mioinjeção (meio F10 + 0,5% FBS) e injetar os camundongos dentro de 1 h após a preparação desta suspensão.

4. Injeção intramuscular de células

NOTA: As células M25FV24C são injetadas no membro posterior direito de camundongos entre 4 e 6 semanas de idade. A injeção em 4 semanas produz um pequeno camundongo com um tumor que pode ser mais difícil de tratar, pois há menos tecido circundante para dispersão de HT; esperar até 6 semanas rende um camundongo maior, facilitando o tratamento do tumor.

  1. Inverter a suspensão celular várias vezes antes da aspiração para ajudar a distribuir uniformemente as células dentro da solução. Aspirar 10 μL (104 células) utilizando uma seringa de microlitros (ver Tabela de Materiais). Aperte o rato; Uma vez contido, o acesso aos músculos caudais da coxa pode ser obtido estendendo a perna traseira. Faça a barba na perna usando cortadores e limpe com etanol 70%.
  2. Injetar a suspensão celular M25FV24C (10 μL, 10 4 células) na musculatura da coxa do membro posterior direito de um camundongo de4-6 semanas usando uma seringa de microlitro estanque ao gás com uma agulha G 26s.
    NOTA: A agulha deve ser inserida paralelamente ao fêmur em direção ao joelho, tomando cuidado para não atingir o nervo ciático. Inserir apenas a ponta da agulha (aproximadamente 2 mm) devido à pequena massa muscular do membro posterior.
  3. Administre a solução em movimento constante. Remova a agulha e certifique-se de que não ocorra sangramento. Retorne o mouse para uma segunda gaiola.
  4. Avaliar os animais diariamente e monitorar os membros pélvicos quanto ao crescimento do tumor através da palpação. Eutanasiar os camundongos usando dióxido de carbono se qualquer um dos seguintes desfechos iniciais for encontrado: tamanho do tumor superior a 1,5 cm de diâmetro, ulceração tumoral ou sinais sistêmicos de doença (piloereção, postura curvada, inatividade ou diminuição da ingestão de alimentos ou água).

5. Ressonância magnética de rastreamento

  1. Anestesiar o camundongo, até um nível em que não haja movimento com o aperto da pata, com isoflurano sob os seguintes parâmetros: induzir em uma câmara com 4% a 1,5 LPM, em seguida, transferir para o cone nasal no trenó do scanner de RM e continuar a manutenção do isoflurano no cone nasal com 1,5%-2% a 0,75 LPM. Conecte o monitor respiratório. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  2. Imagem do mouse anestesiado usando o scanner de ressonância magnética (ver Tabela de Materiais). Na imagem ponderada em T2 (aquisição Ax_Screen, Tabela 1), anote-se as dimensões no plano e o número de cortes axiais em que o tumor aparece. Observe a localização do tumor em referência ao fêmur e à face lateral da coxa, onde entraria a onda ultrassônica.
    NOTA: O tumor aparece como uma massa hiperintensa dentro do músculo que é assimétrica do lado oposto. Um bom tamanho inicial do tumor para múltiplos tratamentos é de 2 mm x 2 mm x 2 mm para estudos agudos ou de sobrevida. Se for muito maior, só será bom para estudos agudos, pois o tumor atingirá um ponto final de tamanho antes de completar três tratamentos semanais. Os critérios de exclusão para o tratamento com HIFU incluem: enrolado ao redor do fêmur, muito perto do fêmur, muito posterior no camundongo, medial ao fêmur, muito perto do reto.
  3. Remova o mouse do scanner e obtenha um peso basal. Faça a barba do rato do meio do corpo até os pés sob anestesia com um barbeador elétrico.
    OBS: O ideal é que o barbear seja feito 1 dia antes do tratamento, pois permite que o mouse realize a tosa, o que permite que o creme depilatório funcione de forma mais eficiente.
  4. Recupere o mouse no BSC, usando uma almofada de aquecimento sob uma extremidade da gaiola. Devolver o rato à sua gaiola quando recuperar o decúbito esternal.

6. Experimento: preparação animal do dia do tratamento de HIFU

  1. Para preparar o sistema HIFU (ver Tabela de Materiais) de pequeno furo, ligue o gerador e encha o transdutor com água deionizada suficiente até que a membrana seja expandida abaixo do transdutor, mas não tão firme a ponto de comprimir o mouse. Desgaseifique a água no circuito do transdutor por 30 min para remover o oxigênio dissolvido do meio.
  2. Prepare o sistema de computador associado.
    1. Ligue o computador de controle e certifique-se de que ele esteja conectado via ethernet ao gerador HIFU e via USB ao display da sonda térmica. Inicie o software e clique em Início para iniciar o transdutor antes de inserir o mouse.
    2. Calibrar as sondas térmicas de fibra óptica: Obtenha as temperaturas ambientes basais e observe a mudança de temperatura na sala de ressonância magnética. Observe a magnitude da deriva de temperatura para cada sonda devido à intensidade do campo magnético. Insira a sonda de temperatura do tubo de deriva em um tubo de vidro preenchido com gadolínio para calibração da temperatura durante a digitalização e prenda o tubo de deriva com fita adesiva.
      NOTA: A temperatura ambiente basal (tubo de deriva) é adicionada manualmente como um parâmetro de termometria na GUI do software. Uma região de interesse (ROI) é definida dentro do tubo de deriva na imagem de RM para detectar qualquer desvio de temperatura e corrigirá automaticamente as imagens de termometria.
    3. Retirar o medicamento a ser injetado em uma seringa de 1 mL e colocá-lo na bomba de entrega automática (ver Tabela de Materiais). Prima a linha que se conectará ao cateter da veia da cauda do mouse até que o medicamento tenha preenchido completamente a linha, pressionando o botão de entrega manual na bomba de entrega automática.
    4. Use uma lâmpada de calor para aquecer os ratos nas gaiolas por ~20 minutos antes de transferir para a câmara anestésica.
      OBS: O pré-aquecimento promove vasodilatação, que será encontrada assim que o camundongo for anestesiado e auxilia na colocação do cateter.
  3. Anestesiar o camundongo com isoflurano (indução: 4% a 1,5 LPM; manutenção: 1,5%-2% a 0,75 LPM) e transferir para um cone nasal. Aplique um lubrificante corneano nos olhos para evitar danos devido à falta de reflexo de piscar sob anestesia.
  4. Aplique creme depilatório na área raspada, incluindo todo o membro posterior direito, e siga as instruções do fabricante para a depilação.
    NOTA: Posicione o mouse sob uma lâmpada de calor enquanto estiver no BSC para ajudar na termorregulação durante a depilação sob anestesia.
  5. Depois de lavar o creme depilatório com água morna, pesar o mouse em uma balança digital e registrar a dosagem do medicamento.
  6. Mova o mouse para um cone nasal compatível com ressonância magnética no trenó de ressonância magnética. Posicione uma lâmpada de calor no mouse para mantê-lo aquecido enquanto se prepara para a ressonância magnética. Coloque o camundongo em decúbito lateral com o suporte não tumoral para baixo e o tumor superior dentro de um suporte de mouse impresso em 3D no trenó (Figura 1 e Figura 2 suplementares). Garantir o posicionamento adequado do tumor (ou seja, no centro da bobina horizontal e verticalmente, com a altura logo acima das bordas do suporte do mouse para dar conta da compressão pelo transdutor de ultrassom).
    NOTA: Se necessário, corte um segmento de almofada de gel de ultrassom comprimido para colocar sob o mouse, forrando a parte inferior do suporte, com uma espessura para nivelar o tumor à parte superior do suporte.
  7. Empurre a perna não envolvida para longe da perna do tumor, sob o camundongo ou estendida com a perna do tumor flexionada. Certifique-se de que os pés não estão no campo próximo ou distante do tumor e no caminho do feixe de ultrassom. Posicione a lâmpada de calor a 15 cm da cauda para aquecer para inserção do cateter na veia caudal.
  8. Inserir a sonda de temperatura esofágica.
    1. Enfie a sonda esofágica através do cone nasal e raspe o pescoço do rato. Incline o nariz do rato para cima para criar uma linha da boca até ao estômago, estendendo a cabeça. Deslize a sonda térmica acima da língua cerca de 0,5 cm no esôfago do camundongo e substitua o cone nasal ao redor do nariz do camundongo. Fixe a sonda esofágica e o cone nasal na parte superior do trenó.
      NOTA: Monitore sinais de desconforto respiratório imediatamente após a inserção, pois pode ser inserido incorretamente na traqueia.
  9. Insira a sonda de temperatura retal.
    NOTA: As sondas de temperatura retal e esofágica devem estar a menos de 3 °C uma da outra.
  10. Coloque o monitor respiratório com o cabo de conexão em direção à cabeça do mouse para que ele não interfira na colocação do transdutor de ultrassom. Proteja com fita.
  11. Insira um cateter de agulha de cauda com agulha de borboleta de 27 G em uma veia lateral da cauda conectada à microtubulação com 20 μL de espaço morto e fita adesiva com segurança. Após a gravagem, certifique-se de que o cateter ainda esteja lavando bem.
  12. Use duas pessoas para carregar o mouse preparado, o trenó do mouse, a linha de anestesia, a linha respiratória, o cateter da veia da cauda e os cordões da sonda térmica no scanner de ressonância magnética e coloque no suporte do trenó de ressonância magnética.
  13. Peça ao operador do software HIFU (ver Tabela de Materiais) que mova o menisco do transdutor diretamente sobre o tumor por inspeção visual para um alinhamento inicial27. Aplique lubrificante ocular ou gel de ultrassom desgaseificado na pele sem pelos acima do tumor e acople o transdutor HIFU à área do tumor.
  14. Conecte a linha de administração de medicamentos da bomba automática ao cateter da veia caudal. Calcule a quantidade de espaço morto na linha da veia caudal e na linha de conexão. Deslize o trenó HIFU do mouse nos trilhos da ressonância magnética para o centro da ressonância magnética.
  15. Defina a quantidade de infusão de drogas na bomba, dependendo do tipo e concentração do medicamento e do peso do animal, e adicione a quantidade de espaço morto. Ajustar a bomba a uma taxa de perfusão de 200 μL/min.
    NOTA: Neste estudo, DF e TLD foram usados na concentração de 2 mg/mL e na dose de 5 mg/kg de peso corporal.
  16. Registre as temperaturas basais da sonda térmica.
  17. Coloque o dispositivo de aquecimento por convecção de ar (consulte Tabela de Materiais) na configuração mais quente. Aponte o tubo que sopra o ar em direção ao mouse no centro do furo da ressonância magnética e prenda com fita adesiva. O dispositivo de aquecimento será posteriormente ligado à sua configuração mais baixa (32 °C) para evitar o superaquecimento do mouse durante a sonicação.
  18. Adquirir o levantamento de imagens de RM (Ax_Loc, Sag_Loc; Tabela 1) para determinar a localização do tumor para o alvo de sonicação, incluindo a profundidade. Ajuste a posição do transdutor de acordo com o software HIFU inserindo a distância de movimento desejada medida na imagem e, em seguida, clicando na direção da seta para se mover (Figura 3A). Observe também a localização do tubo de deriva. Repita conforme necessário.
  19. Determinar a localização do ponto focal do transdutor no plano coronal realizando uma breve sonicação contínua de "test shot" de 5 s x 50 mV de amplitude durante a aquisição da termometria Test_Shot (Tabela 1).
  20. Alinhe as imagens da pesquisa de RM com a visão coronal do ponto focal dentro do software HIFU. Revisar as imagens quanto à localização do tumor, em relação à estrutura óssea e ao reto, e revisar o posicionamento do transdutor quando necessário.
  21. Repetir a sonicação do tiro de teste durante a imagem de Therm de nove repetições (Tabela 1) para confirmar se há aquecimento uniforme e preciso no volume do tumor com aquecimento mínimo fora do alvo. Ajuste a localização da fatia, a localização do transdutor e a profundidade da direção e confirme o desempenho de aquecimento com "disparos de teste" repetidos, conforme necessário.
  22. Usando o software de monitoramento de tratamento HIFU, defina o ROI para o monitoramento de termometria dentro do perfil de aquecimento final, medindo a distância a ser movida e, em seguida, alterando as coordenadas da grade no programa. Defina um ROI ao redor do tubo de deriva para correção de deriva. Insira a temperatura basal com base na temperatura da sonda retal para medições de termometria. O sistema HIFU é usado para iniciar a sonicação do tratamento HIFU e para o monitoramento da termometria.
  23. Abra as especificações de tratamento de hipertermia de 20 minutos no software e inicie a sonicação assim que as imagens de RM de referência forem coletadas e a termometria começar.
  24. Execute um tratamento de 20 min (Figura 3B) durante a imagem Therm (Tabela 1) usando o software controlador integrado de derivada integrativa proporcional (PID). Injetar o fármaco selecionado em 1,5 min, após a temperatura na ROI aquecer para a temperatura desejada (40 °C).
  25. Monitorar a temperatura central durante todo o tratamento. Se a temperatura retal estiver aumentando rapidamente durante o tratamento, o reposicionamento do camundongo pode ser necessário para evitar o aquecimento retal durante os 10 ou 20 minutos de duração do tratamento. Interromper o tratamento se a temperatura retal aumentar para >40 °C.

7. Experimento: Procedimento de imagem e sonicação de modelo de camundongo para estudos agudos

  1. Após a conclusão do tratamento, remova o camundongo do furo da ressonância magnética, garantindo a hemostasia no local de inserção do cateter da veia caudal. Transfira o camundongo para o BSC e coloque no cone nasal para continuar a anestesia.
  2. Coloque o rato de costas sobre uma almofada absorvente azul com os membros contidos e o coração exposto.
  3. Eutanásia dos camundongos através de exsanguinação via punção cardíaca seguida de remoção do coração. Tome o sangue imediatamente e centrifuja para a separação do plasma a 10,621 x g durante 10 minutos.
  4. Realizar necropsia e armazenar os órgãos conforme necessário para análise. Congelar os órgãos em azoto líquido e armazenar a -80 °C durante vários meses ou a longo prazo num tanque de azoto líquido.
  5. Homogeneizar mecanicamente o tecido tumoral adicionando um excesso de nove vezes (p/p) de água deionizada e quebrando o tecido usando um homogeneizador batendo contas. Extrair doxorrubicina de 600 μL de tecido homogeneizado adicionando sequencialmente 75 μL de 300 mg/mL de nitrato de prata, 75 μL de ácido sulfúrico 10 mM e 2,5 mL de isopropanol:clorofórmio 1:1. Vórtice por 20 min e armazene a -20 °C durante a noite.
  6. Para preparar amostras para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), centrifugar a solução da etapa 7.5 a 4.500 x g, remover a camada de solvente orgânico e secar o isopropanol:clorofórmio sob uma corrente de gás nitrogênio. Ressuspender em 100 μL de 2:1 MeOH:H2O. Medir a concentração de doxorrubicina usando HPLC-MS/MS28.

8. Experimento: Procedimento de imagem e sonicação de modelo de camundongo para estudos de sobrevivência

NOTA: Para estudos de sobrevivência, siga o procedimento de preparação do animal no dia do tratamento com HIFU (passo 6.1 a 6.25).

  1. Após a conclusão do tratamento, coloque o rato sob uma lâmpada de calor para permitir que ele se recupere e monitore sua respiração e movimento até que recupere o decúbito esternal. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola.
    NOTA: Certifique-se de que metade da gaiola esteja alinhada com uma lâmpada de calor, pois a regulação térmica dos animais é afetada pela anestesia e pelo tratamento HT.
  2. Monitore os ratos diariamente quanto ao comportamento, padrões de alimentação e frequência respiratória em busca de quaisquer sinais de angústia.
  3. Realizar tratamentos uma vez por semana seguindo os passos 6.1 a 6.25 durante 3 semanas consecutivas.
  4. Duas vezes por semana, realizar imagens de ressonância magnética dos camundongos para medição do tumor. Durante as semanas durante o tratamento, realize uma ressonância magnética e uma ultrassonografia por semana. Após o término do tratamento, realizar ultrassonografia quinzenal.
  5. Eutanasiar o camundongo 60 dias após completar a série de tratamentos, ou quando um desfecho humano tiver sido atingido (tamanho do tumor >1,5 cm3 ou morbidade do tumor), seguido de necropsia com remoção do tumor e órgão para análise.

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Resultados

Usando o protocolo de hipertermia gerada por MRgHIFU, os tumores no membro posterior foram capazes de ser consistentemente aquecidos até a temperatura desejada durante o tratamento (Figura 4 mostra um tratamento representativo, 10 ou 20 min, n = 65). Para considerar um tratamento bem-sucedido, a ROI teve que ser mantida acima de 39 °C durante todo o tratamento, com variação de <6 °C ao longo do tratamento e sem aquecimento do tecido fora do alvo. Além disso, a temperatura central deveria ...

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Discussão

O protocolo aqui desenvolvido foi utilizado para atingir tumores de membros pélvicos utilizando MRgHIFU para tratamento leve de TH e liberação de fármacos encapsulados de lipossomas in vivo. Várias etapas críticas foram encontradas nesse protocolo durante o estudo piloto, e a otimização dessas etapas críticas foi responsável pelo melhor sucesso do tratamento em relação ao estudo piloto. A primeira é a remoção completa dos pelos na área a ser sonicada. Qualquer aprisionamento de gás dentro da pele impede a passag...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros ou conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de reconhecer nossas fontes de financiamento para este projeto e o pessoal envolvido, incluindo: C17 Research Grant, Canada Graduate Scholarship, Ontario Student Opportunity Trust Fund e James J. Hammond Fund.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Eppendorf de 1,5 mLEppendorf22363204
1kb mais escada de DNAFroggabioDM015-R500
2x HS-Red Taq (mistura de PCR)Wisent801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpecBrukerT18493170/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Alemanha
C1000 TermocicladorBiorad1851148
ClippersWhal Peanut8655
Gel de ultrassom comprimidoAquaflexHF54-004
Dispositivo de aquecimento por convecção3M Bair Hugger70200791401
Creme depiliatórioNair61700222611Shopper's Drug Mart
DMEMWisent219-065-LK
Kit de extração DNeasyQiagen 69504
DPBSWisent311-420-CL
Sistema de injeção de drogasHarvard ApparatusPY2 70-2131PHD 22/2200 MRI compatível Seringa Bomba
Lubrificante ocularOptixcare50-218-8442
F10 MediaWisent318-050-CL
FBSWisent081-105
FroggaroseFroggaBioA87
Gel Molecular ImagerBioRadGelDocXR
GlutamaxWisent609-065-EL
Lâmpada de CalorMorganville ScientificHL0100 Similar a este produto
Tubo de polietileno intravascular (0,015" ID x 0,043" OD, 20G)Infusão de SAIPE-20-100
IsofluranoSigma792632
M25FV24C Linha celularGladdy LabN/A
Hamilton01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XRBiorad170-8170
Suporte para mouseO material de impressão 3D usado foi ABS-M30i, e foi impresso em máquina FDM Fortus 380mc N/ADimensões: comprimento = 43 mm, raio externo = 15 mm, largura interna (onde o mouse se sentaria) = 20,7 mm. 
MyRun MachineCosmo Bio Co LtdCBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 EspectrofotômetroThermo ScientificND-8000-GL
p53 primersEurofinsN/ACustom Primers
Tubos de PCRDiamedSSI3131-06
Penicilina/EstreptomicinaWisent450-200-EL
Software Proteus Pichardo labN/A
Sistema de monitoramento respiratórioSAIIModelo 1030Sistema de monitoramento e gating compatível com MR para pequenos animais
Dispositivo HIFU de pequeno porte, LabFUSTerapia guiada por imagemN/ALabFUS, Terapia guiada por imagem, Pessac, França Número de elementos 8
frequência 2,5 MHz
diâmetro  25 mm
raio de curvatura 20 mm
Tamanho do ponto focal 0,6 mm x 0,6 mm x 2,0 mm

Motor: eixos 2

Gerador:
Número de canais 8
Potência elétrica máxima/canal Wel 4
Potência elétrica máxima Wel 32
Largura de banda 0,5 - 5 MHz
Controle por canal: Freq., Fase e. amplitude
Medições por canal: Vrms, Irms, cos(theta)
Ciclo de trabalho a 100% % de potência 100% por 1 min.

Transdutor:
Número de elementos 8
frequência  2,5 MHz
diâmetro 25 mm
raio de curvatura 20 mm
Tamanho do ponto focal  0,6 mm x 0,6 mm x 2,0 mm
SYBR SafeThermoFisher ScientificS33102
TAEWisent811-540-FL
Cateter de veia da cauda (27G 0,5")Terumo Medical Corp15253
Sondas térmicasMonitoramento robustoL201-08
Azul tripanoThermoFisher Scientific15250061
TripsinaWisent325-052-EL
Gel de UltrassomAquasonicPLI 01-08
Seringa de microlitro

Referências

  1. Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
  2. Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
  3. Dasgupta, R. Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology. , Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019).
  4. Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
  5. Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
  6. Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
  7. Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
  8. Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
  9. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12(2017).
  10. Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
  11. Kim, A. A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019).
  12. PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021).
  13. Suelmann, B. B. M. Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018).
  14. De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107(2021).
  15. Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
  16. Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
  17. Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
  18. Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
  19. Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65(2016).
  20. Dewhirst, M. W., Lee, C. -T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
  21. Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
  22. Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
  23. Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
  24. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
  25. De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564(2021).
  26. McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
  27. Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
  28. Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
  29. Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816(2021).
  30. Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973(2022).

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 2/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

to:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

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Hipertermia LocalizadaDoxorrubicina Lipossomal TermossensívelModelo Murino de RabdomiossarcomaHipertermia Direcionada ao TumorMonitoramento da Liberação de FármacosTermometria por RMTratamento com HIFUAnálise Farmacocinética
Hipertermia gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética: um método de tratamento viável em um modelo de rabdomiossarcoma murino
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