Ensaio de ponto vazio em tempo real

Summary

Este artigo descreve um novo método para estudar o comportamento miccional de camundongos incorporando o monitoramento de vídeo no ensaio convencional de ponto vazio. Essa abordagem fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre os eventos miccionais e detalhes do comportamento do camundongo durante as fases clara e escura do dia.

Abstract

O comportamento miccional normal é o resultado da função coordenada da bexiga, da uretra e dos esfíncteres uretrais sob o controle adequado do sistema nervoso. Para estudar o comportamento miccional voluntário em modelos de camundongos, os pesquisadores desenvolveram o void spot assay (VSA), um método que mede o número e a área de manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola de um animal. Embora tecnicamente simples e barato, este ensaio apresenta limitações quando usado como um ensaio de desfecho, incluindo a falta de resolução temporal dos eventos miccionais e dificuldades em quantificar manchas de urina sobrepostas. Para superar essas limitações, desenvolvemos um VSA videomonitorado, que chamamos de VSA em tempo real (RT-VSA), e que nos permite determinar a frequência miccional, avaliar o volume miccional e os padrões miccionais e fazer medições ao longo de janelas de tempo de 6 h durante as fases escura e clara do dia. O método descrito neste relato pode ser aplicado a uma ampla variedade de estudos baseados em camundongos que exploram os aspectos fisiológicos e neurocomportamentais da micção voluntária em estados de saúde e doença.

Introduction

O armazenamento de urina e a micção são coordenados por um circuito central (sistema nervoso central) que recebe informações sobre o estado de enchimento vesical através dos nervos pélvico e hipogástrico. O urotélio, o epitélio que reveste o trato urinário da pelve renal até a uretra proximal, forma uma barreira apertada aos resíduos metabólicos e patógenos presentes na urina. É um componente integrante de uma teia sensorial, que detecta e comunica o estado de enchimento da bexiga aos tecidos subjacentes e nervos aferentes ^1,2. A ruptura da barreira urotelial ou alterações nas vias de mecanotransdução urotelia....

Protocol

Camundongos uroteliais Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO, genótipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) e controles (Pz1/2-C, genótipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) foram gerados internamente a partir de cepas parentais obtidas dos laboratórios Jax (cepa Piezo1 fl^/fl # 029213; Piezo2 fl^/fl cepa # 027720; Upk2^CRE+/- cepa # 029281). Camundongos fêmeas (1,5–3 meses de idade e 17–20 g de peso) e machos (2–4 meses de idade e 23–29 g de peso) foram utilizados nos experimentos. Para os experimentos de cistite....

Results

Comportamento miccional de camundongos knockout uroteliais Piezo1/2

Durante a fase de armazenamento do ciclo miccional, hipotetiza-se o urotélio para detectar a tensão exercida pela urina acumulada na bexiga e transduzir esse estímulo mecânico em respostas celulares, como a liberação serosa de ATP ^1,3. Demonstramos anteriormente que os canais de PIEZO1 e PIEZO2 ativados mecanicamente são expressos no urotélio.......

Discussion

A incorporação da videomonitoração é uma modificação custo-efetiva que apresenta diversas vantagens em relação à VSA clássica. No VSA clássico, que é tipicamente usado como um ensaio de ponto final, é difícil distinguir pontos vazios sobrepostos. Esta não é uma preocupação trivial, pois os ratos tendem a urinar várias vezes na mesma área quando o ensaio é prolongado por várias horas, normalmente nos cantos de sua gaiola. Assim, a primeira vantagem do RT-VSA é que o examinador pode facilmente identificar pontos individuai.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,00" X 1,00" Perfil T-Slotted - Quatro Slots T Abertos - ndash;   corte para 10 polegadas	80/20	1010	Quantidade: 20
1,00 " X 1,00" Perfil T-Slotted - Quatro Slots T Abertos - ndash;   corte para 12 polegadas	80/20	1010	Quantidade: 6
1,00" X 1,00" Perfil T-Slotted - Quatro Slots T Abertos - ndash;   corte para 40 polegadas	80/20	1010	Quantidade: 4
1,00" X 1,00" Perfil T-Slotted - Quatro Slots T Abertos - ndash; corte para 14,75 polegadas	80/20	1010	Quantidade: 12
1,00" X 1,00" Perfil T-Slotted - Quatro Slots T Abertos - ndash; corte para 32 polegadas	80/20	1010	Quantidade: 5
1/4-20 Porca em T Econômica Deslizante Dupla	80/20	3280	Quantidade: 16
1/4-20 Porca T Econômica Deslizante Tripla	80/20	3287	Quantidade: 18
10 e 25 Série 2 Furos - Suporte de Canto Interno com Fenda de 18 mm com Suporte Duplo	80/20	14061	Quantidade: 6
10 Série 3 Furos - Placa Plana Reta	80/20	4118	Quantidade: 8
10 Série 5 Furos - Placa Plana "L"	80/20	4081	Quantidade: 8
10 Série 5 Furos - Placa Plana "T"	80/20	4080	Quantidade: 8
10 Série 5 Furos - Placa Plana em T	80/20	4140	Quantidade: 2
Dobradiça de Elevação Padrão Série 10 - Conjunto de Mão Direita	80/20	2064	Quantidade: 2
Suporte de Canto Interno de Transição Lite de 2 Furos - Série 10 a 15	80/20	4509	Quantidade: 6
luzes de tubo UV de 24" de comprimento	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Quantidade: 2 lâmpada de 20W – 24" Comprimento de onda: 365nm
Folha de espelho acrílico	Plásticos		Quantidade: 1 82,5 cm x 26,5 cm
Folha de espelho acrílico	Plásticos		Quantidade: 2 26,5 cm X 30,5 cm
Folha de espelho acrílico	profissionais		Quantidade: 2 82,5 cm x 30,5 cm
Policarbonato AR (resistência aos raios UV)	80/20	65-2641	Quantidade: 2 4,5 mm de espessura, transparente, 38,5 cm x 26,5 cm
policarbonato AR (resistência UV)	80/20	65-2641	Quantidade: 4 4,5 mm de espessura, transparente, 38,5 cm x 21,5 cm
policarbonato AR (resistência UV)	80/20	65-2641	Quantidade: 4 4,5 mm de espessura, transparente, 26,5 cm x 21,5 cm
policarbonato AR (resistência UV)	80/20	65-2641	Quantidade: 4 4.5mm de espessura, transparente 37.5 cm x 23.9 cm
policarbonato AR (resistência aos raios UV)	80/20	65-2641	Quantidade: 4 4.5mm de espessura, transparente, 24.4 cm x 23.9 cm
Papel para cromatografia (papel fino)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos papel mata-borrão (papel grosso)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 9.4.0	software gráfico e estatístico
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		filme transparente
Quick Time Player 10.5 software	Leitor multimídia	Apple
Espião de segurança	Ben software		de vigilância por vídeo sistema de software de fixação
padrão, 1/4-20	80/20	3381	Quantidade: 80
UV transmitindo acrílico	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Quantidade: 2 38,5 cm x 26,5 cm
Gel de água: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Quantidade: 4