Summary
Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).
Abstract
La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall'attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l'infiammazione precoce causata dall'attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell'IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell'IPF. Coinvolge l'isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l'istituzione dell'esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell'IPF.
Introduction
La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori1. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, come TGF-β e PDGF, che promuovono la fibrosi polmonare2. Il processo patologico dell'IPF è accompagnato dall'attivazione e dall'infiltrazione dei macrofagi. L'IPF media la riparazione delle lesioni, l'infiammazione e la fibrosi attraverso il rilascio di citochine3. Poiché sono disponibili solo opzioni terapeutiche limitate, l'esplorazione dei meccanismi patologici molecolari dell'IPF ha un grande significato per lo sviluppo di nuove strategie per la prevenzione e il trattamento dell'IPF. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri ricercatori 4,5 hanno confermato l'aumento del rilascio di IL-33 nei pazienti con IPF e in modelli murini con IPF indotta da bleomicina (BLM). IL-33 viene rilasciato dalle cellule epiteliali ed endoteliali durante la fibrosi ed è coinvolto nell'attivazione dei macrofagi, con conseguente proliferazione anormale dei fibroblasti, infiltrazione leucocitaria e l'eventuale perdita della funzione polmonare5. L'attuale protocollo descrive il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali stimolati da IL-33 (IM) negli alveoli come mezzo per studiare lo sviluppo dell'IPF in modelli murini. Qui, gli IM sono stati isolati dal tessuto polmonare dei topi ospiti, coltivati in vitro, stimolati con IL-33 per 24 ore e quindi trasferiti adottivamente negli alveoli dei topi riceventi mediante iniezione tracheale. La raccolta diretta di macrofagi di topo stimolati e il loro trasferimento adottivo negli alveoli riceventi è risultato aggravare il grado di fibrosi polmonare e può illustrare più chiaramente l'influenza dei fattori stimolanti sulla fibrosi rispetto agli studi precedenti6. La tecnica descritta in questo articolo può consentire ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi stimolati da potenziali citochine nello sviluppo dell'IPF.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell'Università di Jiangnan (JN n. 20211130m1720615[501]).
NOTA: In totale, in questo studio sono stati utilizzati 10 topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 6-8 settimane e del peso di 20-25 g. I tre gruppi sperimentali nello studio includevano tre topi riceventi ciascuno e un topo ospite è stato utilizzato per l'isolamento IM.
1. Esaurimento dei macrofagi polmonari di topo
- Estrarre il flaconcino di liposomi clodronati (vedere Tabella dei materiali) dal frigorifero con 30 minuti di anticipo, riscaldarlo a temperatura ambiente e capovolgerlo più volte per garantire una miscelazione uniforme.
NOTA: I liposomi clodronati incapsulano le molecole idrofile diclorometilene bifosfonato. Quando questi liposomi vengono consumati dai macrofagi, il clodronato viene gradualmente rilasciato dall'azione della fosfatasi lisosoma e il suo accumulo innesca di conseguenza l'apoptosi cellulare e l'esaurimento dei macrofagi7. - Anestetizzare i topi con isoflurano al 3%. Controlla la profondità dell'anestesia pizzicando un piede per verificare la coscienza. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia.
- Aspirare 60 μL di liposomi clodronati utilizzando una pipetta con una punta di aspirazione sterile. Somministrare il farmaco goccia a goccia nella cavità nasale del topo anestetizzato, in modo tale che quando il topo inala, il farmaco viene inalato nella trachea. Dopo ogni goccia, assicurarsi che il topo inali completamente il farmaco e respiri in modo uniforme. Somministrare liposomi contenenti solo PBS come controllo8 (Figura 2).
- Posizionare i topi su una tabella a temperatura costante di 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il loro recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che i topi si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentenza sternale, trasferirli nella gabbia.
- Utilizzare topi con macrofagi alveolari impoveriti 2 giorni dopo il trattamento con liposomi clodronati come topi riceventi per l'esperimento di trasferimento.
NOTA: In questo studio, la deplezione dei macrofagi alveolari è stata confermata controllando l'espressione dei marcatori macrofagici come descritto in precedenza 8,9 dopo la somministrazione di liposomi clodronati per inalazione (vedere Figura supplementare 1).
2. Isolamento e cultura dei GI
- Anestetizzare il topo ospite con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg). Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la perdita del riflesso del pizzicamento della punta. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia. Quindi, disinfettare la pelle del topo anestetizzato con alcol al 75% e iodio. Usa le forbici per tagliare la pelle ed esporre il tessuto cardiopolmonare
- Aspirare 10 mL di 1x PBS in una siringa con un ago da 20 G e inserire la punta dell'ago nell'atrio destro del mouse (Figura 3A). Tagliare la vena cava inferiore del topo con le forbici chirurgiche, quindi perfondere manualmente il topo con PBS a velocità costante (10-20 ml / min) fino a quando il tessuto polmonare diventa bianco. Asportare il tessuto polmonare e trasferirlo in PBS ghiacciato in un piatto di coltura (Figura 3B).
- Tagliare il tessuto polmonare in frammenti di circa 2 mm x 2 mm x 2 mm. Quindi, aggiungere 15 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente l'1% di collagenasi A al tessuto polmonare per isolare i macrofagi. Incubare a 100 giri/min per 30 minuti su tavola vibrante a 37 °C.
- Aspirare la sospensione del tessuto polmonare attraverso una siringa da 10 ml almeno 20 volte per renderla il più fine possibile. Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare il filtrato a 400 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
- Lisare i globuli rossi nel pellet aggiungendo 3 ml di tampone di lisi RBC (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per 2-3 minuti.
- Dopo centrifugazione a 150 x g per 5 minuti, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di DMEM (contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Contare le cellule usando un emocitometro.
- Seminare le cellule in piastre di coltura cellulare aderente di 10 cm a 2 x 107 cellule/piatto e incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Ciò consente agli IM polmonari di aderire al piatto5. Dopo 1 ora, aspirare il surnatante e le cellule galleggianti e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco completo (DMEM contenente 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina). Incubare per più di 8 ore o durante la notte.
- Determinare la purezza degli IM ottenuti utilizzando citometria a flusso con colorazione per i marcatori F4/80 e CD11c, come descritto in precedenza5 (vedere Figura supplementare 1).
3. Trasferimento adottivo di IMs negli alveoli polmonari
- Sostituire il terreno di coltura della piastra contenente gli IM polmonari isolati (fase 2.7) con un terreno di coltura completo contenente 10 ng/mL IL-33 per stimolare gli IM. Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO2. Utilizzare 1x PBS al posto di IL-33 come controllo.
- Dissociare gli IM polmonari trattandoli con 1 mL di tripsina allo 0,25% per 5 minuti. Quindi, estinguere la digestione aggiungendo 3 ml di terreno completo di coltura fresca e raccogliere i macrofagi polmonari centrifugando la sospensione cellulare a 150 x g e 4 ° C per 5 minuti. Contare le cellule usando un emocitometro e risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 105 cellule / 50 μL.
- Anestetizzare i topi riceventi con il 3% di gas isoflurano. Attendere che il topo diventi incosciente (come nel punto 1.2), quindi fissare gli arti del topo anestetizzato su una piastra verticale con nastro medico. Tirare delicatamente la lingua del topo da un lato usando un batuffolo di cotone.
- Accendi la lampada di intubazione e illuminala sulla gola del topo in modo che la trachea possa essere vista. Controllare che la trachea sia vicina alla base della lingua, l'esofago è vicino alla parte posteriore del collo, ma l'apertura dell'esofago non è visibile durante l'operazione.
- Utilizzare la lampada di intubazione (22 G) per aiutare a intubare il mouse. Guidare la cannula dell'ago a permanenza nella trachea con un filo guida (diametro 0,4 mm). Rimuovere il filo guida e spingere la cannula nella trachea del topo per completare l'intubazione.
- Dopo aver osservato che la cannula entra nella trachea, iniettare 50 μL della sospensione cellulare (contenente 5 x 105 IM) nel topo ricevente attraverso la trachea.
- Posizionare i topi su un pad riscaldante costante a 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentcy sternale, trasferirli nella gabbia.
- Dopo 24 ore, somministrare bleomicina (BLM) attraverso la trachea (utilizzando la procedura nei punti 3.3-3.5) alla dose di 1,4 U/kg di peso corporeo per indurre l'IPF. Somministrare un volume uguale di soluzione salina al gruppo di controllo.
- Dopo 21 giorni, determinare il grado di gravità della fibrosi polmonare per i diversi gruppi di topi che sono stati trasferiti adottivamente con PBS o sospensione IM stimolata da IL-33 valutando l'espressione dei marcatori per la fibrosi e i punteggi di Ashcroft10.
- Estrarre l'RNA totale dal tessuto polmonare utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: L'analisi quantitativa è stata effettuata con un lettore di micropiastre. Se il rapporto OD260/OD280 è 1,8-2,0, la purezza dell'RNA è elevata. Tutti i campioni sono stati conservati a -80 ° C. - Eseguire la PCR quantitativa a fluorescenza per valutare l'espressione di actina α-liscia (SMA) e fibronectina utilizzando primer specifici.
NOTA: I primer utilizzati per α-SMA erano avanti 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' e inverso 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', e i primer utilizzati per la fibronectina erano avanti 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' e inverso 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Estrarre l'RNA totale dal tessuto polmonare utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
- Eseguire l'immunoistochimica come descritto di seguito.
- Disidratare il polmone sinistro, incorporarlo e affettarlo con un'affettatrice di paraffina per uno spessore di 4 μm.
- Posizionare le sezioni di tessuto sui vetrini e cuocere i vetrini in forno a 65-70 ° C per 30 minuti a 1 ora. Decerare i vetrini con una percentuale decrescente di alcol (cioè 100%, 95%, 90%, 80% e 70% di alcol) per 5 minuti.
- Colorare i vetrini in soluzione di colorante di ematossilina (analiticamente pura) per 5 minuti. Quindi, lavare gli scivoli con acqua di rubinetto. Immergere gli scivoli in alcool cloridrico all'1% per 3 secondi, lavare via il colore galleggiante e immergere in acqua corrente per 5 minuti. Le sezioni diventeranno blu.
- Immergere nella soluzione di eosina per 10 s a 1 min (determinare il tempo di tintura in base al colore), lavare con acqua di rubinetto e mettere in alcool al 70%, 80%, 95%, 100% e 100%, rispettivamente, per 5 minuti ciascuno. Quindi posizionare, i vetrini in soluzioni di xilene I e xilene II per 3 min. Dopo l'asciugatura, osservare e scattare foto al microscopio verticale con pellicola sigillante adesiva neutra.
- Eseguire il punteggio Ashcroft sulle sezioni per indicare la gravità della fibrosi polmonare10. Eseguire analisi statistiche dei dati utilizzando un t-test di due campioni indipendenti.
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Representative Results
Il protocollo utilizzato qui è riepilogato nel diagramma di flusso nella Figura 1. L'inalazione di liposomi clodronati attraverso il naso (Figura 2) è stata utilizzata per esaurire i macrofagi polmonari dei topi adulti C57BL / 6, e questo ha prodotto un buon modello murino ricevente. Gli IM polmonari sono stati isolati da un altro topo non trattato (ospite) (Figura 3A,B) e coltivati in vitro. I macrofagi isolati sono stati stimolati con IL-33 per 24 ore e poi instillati intratrachealmente nei topi riceventi (Figura 3C), con macrofagi non stimolati usati come controllo. Dopo 24 ore, BLM è stato somministrato ai topi riceventi per indurre un modello di fibrosi polmonare. L'entità della fibrosi polmonare dopo il trasferimento adottivo di IMs con o senza stimolazione IL-33 è stata confrontata 21 giorni dopo la somministrazione di BLM. La colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) delle sezioni di tessuto patologico ha mostrato che i tipici cambiamenti patologici della fibrosi sono stati osservati dopo la somministrazione di BLM: la struttura del tessuto polmonare dei topi è stata distrutta, è stata osservata l'aggregazione dei fibroblasti e gli alveoli normali sono scomparsi o diminuire. Il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 ha esacerbato il grado di distruzione del tessuto polmonare e aumentato l'aggregazione dei fibroblasti nei topi stimolati da BLM (Figura 4A). L'aumento del punteggio Ashcroft ha ulteriormente illustrato il grado di fibrosi polmonare (Figura 4B). Il processo patologico della fibrosi polmonare è associato all'aumentata aggregazione dei miofibroblasti, che secernono actina α-liscia (α-SMA) e fibronectina. La determinazione dei livelli di espressione di questi marcatori ha mostrato che i livelli di mRNA di α-SMA (Figura 5B) e fibronectina (Figura 5A) nei tessuti polmonari dei topi riceventi contenenti IM stimolati da IL-33 trasferiti adottivamente e trattati con BLM erano ulteriormente aumentati rispetto a quelli dei topi wild-type trattati con BLM.
Figura 1: Diagramma schematico dell'istituzione dell'esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Deplezione dei macrofagi nei topi riceventi. I liposomi clodronati sono stati lasciati cadere nella cavità nasale dei topi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Isolamento e trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali . (A) La vena cava inferiore del topo ospite è stata tagliata per facilitare la perfusione. (B) Il tessuto polmonare del topo ospite è stato tagliato in piccoli pezzi. (C) I macrofagi interstiziali sono stati purificati al 94% utilizzando citometria a flusso con marcatori F4/80 e CD11c. (D) I messaggi IM stimolati da IL-33 sono stati somministrati ai topi riceventi attraverso la trachea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'effetto del trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 nei topi stimolati da BLM. (A) Colorazione H & E di sezioni di tessuto polmonare dai topi riceventi. Barra di scala = 100 μm. (B) Punteggi di Ashcroft determinati dalle sezioni del tessuto polmonare dei topi riceventi. I dati sono indicati come media ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Livelli di espressione dei geni marcatori della fibrosi polmonare nei topi riceventi. (A) Il livello di mRNA della fibronectina. (B) Il livello di mRNA di α-SMA. I dati sono indicati come media ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Deplezione dei macrofagi alveolari e purezza degli IM. (A) La deplezione dei macrofagi alveolari è stata confermata controllando l'espressione dei marcatori F4/80 e CD11b. (B) La purezza degli IM ottenuti è stata valutata utilizzando citometria a flusso con colorazione per marcatori F4/80 e CD11c, e la purezza degli IM isolati è stata determinata al 94,4% utilizzando la citometria a flusso. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l'esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l'iniezione della vena caudale e l'inalazione nasale11. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari 8,9. Dopo la stimolazione IL-33 degli IM in coltura per 24 ore, gli IM sono stati trasferiti adottivamente ai polmoni dei topi riceventi utilizzando una via di somministrazione tracheale non invasiva, che ha causato il minor trauma ai topi. Durante l'intubazione, è stata impiegata una durata dell'anestesia di >20 minuti per garantire il regolare progresso dell'intubazione, che ha notevolmente migliorato il tasso di sopravvivenza dei topi. La somministrazione tracheale iniziale di una sospensione IM da 50 μL richiede una micropipetta per garantire l'accuratezza della somministrazione. Dopo la somministrazione tracheale, 500 μL di aria devono essere immediatamente aggiunti nei polmoni con una siringa da 1 mL per garantire che la sospensione cellulare nel catetere possa entrare completamente nel tessuto polmonare. Sebbene questo metodo elimini i macrofagi alveolari, i macrofagi di altre parti del topo possono anche migrare verso gli alveoli nel corso della malattia, diluendo così la proporzione di cellule trasferite negli alveoli. Pertanto, gli esperimenti con requisiti rigorosi per la proporzione di cellule trasferite devono esplorare ulteriormente altri metodi.
I macrofagi polmonari svolgono un ruolo importante nella funzione difensiva dei polmoni12,13. Di questi, i macrofagi alveolari esprimono principalmente i marcatori F4/80 e CD11b, mentre i macrofagi interstiziali esprimono principalmente F4/80 e CD11c12. Gli IM sono stati scelti per il trasferimento adottivo in questo studio, poiché il processo richiedeva 5 x 105 cellule e gli IM costituiscono una frazione importante dei macrofagi polmonari, il che li rende più facili da ottenere. Un gran numero di studi ha dimostrato che i macrofagi regolano la risposta infiammatoria rilasciando fattori infiammatori e svolgono un ruolo importante nel processo patologico della fibrosi polmonare14. Gli studi hanno dimostrato che IL-33 regola il TGF-β e altre citochine per regolare la funzione dei macrofagi, che promuove la fibrosi polmonare indotta da BLM4. Pertanto, i cambiamenti indotti nella funzione dei macrofagi svolgono un ruolo importante nella patogenesi della fibrosi polmonare. Questo studio fornisce un metodo per il trasferimento adottivo di IM che può aiutare i ricercatori a esplorare ulteriormente il ruolo dei macrofagi nelle malattie polmonari come l'asma e l'IPF. Attualmente non esiste un farmaco terapeutico efficace per l'IPF, ma questo studio indica che il fattore IL-33 può essere rilevante per la ricerca e il trattamento della fibrosi polmonare idiopatica e, quindi, fornisce una direzione per l'ulteriore esplorazione della ricerca sui farmaci per la fibrosi polmonare. Ad esempio, un anticorpo neutralizzante contro IL-33 può essere preparato per esplorare il suo effetto e la fattibilità come farmaco sperimentale IPF, fornendo così una direzione importante per il trattamento della fibrosi polmonare idiopatica.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il tema speciale della gestione del laboratorio dell'Università di Jiangnan: costruzione della biblioteca digitale delle fette basata su campioni patologici (JDSYS202223) e la National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
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