Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Resumo

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Resumo

Os macrófagos residentes no tecido peritoneal têm amplas funções na manutenção da homeostase e estão envolvidos em patologias nos tecidos locais e vizinhos. Suas funções são ditadas por pistas microambientais; Assim, é essencial investigar seu comportamento em um nicho fisiológico in vivo . Atualmente, metodologias específicas de direcionamento de macrófagos peritoneais empregam modelos transgênicos de camundongos inteiros. Aqui, é descrito um protocolo para modulação in vivo eficaz da expressão de mRNA e pequenas espécies de RNA (por exemplo, microRNA) em macrófagos peritoneais usando partículas de lentivírus. As preparações de lentivírus foram feitas em células HEK293T e purificadas em uma única camada de sacarose. A validação in vivo da efetividade do lentivírus após injeção intraperitoneal revelou infecção predominante de macrófagos restritos ao tecido local. O direcionamento de macrófagos peritoneais foi bem-sucedido durante a homeostase e a peritonite induzida por tioglicolato. As limitações do protocolo, incluindo inflamação de baixo nível induzida pela administração intraperitoneal de lentivírus e restrições de tempo para experimentos potenciais, são discutidas. No geral, este estudo apresenta um protocolo rápido e acessível para a avaliação rápida da função gênica em macrófagos peritoneais in vivo.

Introdução

Os macrófagos residentes no tecido (Mφ) são uma população heterogênea de células imunes fagocíticas que detectam e respondem a patógenos invasores ^1,2. Além disso, desempenham um papel essencial no desenvolvimento, remodelação e manutenção da homeostase tecidual ^1,3. Muitos tecidos Mφ derivam de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese e persistem no tecido ao longo da vida ^4,5. O fenótipo e as funções dessas células são ditados por interações colaborativas e hierárquicas de fatores de transcrição específicos e do microambiente local 6,7,8,9. Uma compreensão crescente dessa dependência aumenta a necessidade de métodos in vivo eficazes para manipulação gênica de Mφ dentro de seu nicho fisiologicamente relevante.

Os vetores lentivirais são uma ferramenta frequentemente empregada para a manipulação de ácidos nucléicos em populações celulares específicas in vivo 10,11,12, particularmente devido à sua capacidade de infectar células em divisão e não em divisão e de se integrar de forma estável ao genoma do hospedeiro^13,14. Nas últimas duas décadas, a tecnologia de entrega de lentivírus foi otimizada e envelopes alternativos e promotores sintéticos foram investigados para aumentar o direcionamento específico da linhagem ^8,15. Devido ao seu amplo tropismo celular, a glicoproteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G)^16,17 tornou-se o envelope "padrão-ouro" usado na tecnologia de lentivírus.

Neste protocolo¹⁸, partículas lentivirais pseudotipadas VSV-G são empregadas para demonstrar a entrega direcionada e eficaz de RNA de grampo curto (shRNA) e microRNA (miR) para Mφ peritoneal de camundongo (pMφ) in vivo, no estado estacionário¹⁹. A expressão do transgene foi impulsionada pelo promotor do vírus formador de foco do baço (SFFV). A infecção produtiva das células foi definida pela expressão da proteína fluorescente verde aprimorada (GFP) derivada do lentivírus. A utilização dessa abordagem permitiu uma leitura fácil para experimentos de lentivírus in vivo para definir a dose ideal e o período experimental. Finalmente, o desafio lentiviral in vivo de camundongos durante a inflamação induzida por tioglicolato revelou a propensão natural para a infecção seletiva por pMφ.

Protocolo

Todo o trabalho com animais foi conduzido de acordo com as diretrizes institucionais e do Ministério do Interior do Reino Unido.

NOTA: Todos os estudos in vivo com lentivírus devem ser realizados de acordo com as diretrizes locais e nacionais sobre o uso ético de animais em pesquisa, bem como aderir a todos os regulamentos associados ao uso de materiais infecciosos da categoria II. O bem-estar animal também deve ser monitorado de acordo com os regulamentos locais. Nesta etapa do protocolo, é preciso ter extremo cuidado ao trabalhar com partículas lentivirais e perfurocortantes.

1. Preparação de células HEK293T para transfecção

NOTA: Execute estas etapas em um gabinete de segurança biológica de cultura de tecidos estéril.

1. Prepare o meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (cDMEM) para HEK293T células combinando os 450 mL de DMEM com 10% (v / v) de soro fetal de bezerro (50 mL) e uma concentração final de 100 U / mL de penicilina / estreptomicina.
2. Descongele HEK293T células pelo menos 1 semana antes da transfecção planejada. Mantenha condições saudáveis de crescimento e passe a cada 2-3 dias usando tripsina + EDTA para separar as células do frasco.
3. Um dia antes da transfecção, aspire cuidadosamente o meio de crescimento das células e lave suavemente as células com DPBS estéril. Adicione 1-5 ml de tripsina ao balão e incube a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5% durante 2-5 min.
4. Adicione 5-10 mL de cDMEM e gire as células a 350 x g por 5 min. Remova o líquido e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de cDMEM. Contar as células e semear 10-11 x 10⁶ células HEK293T viáveis por balão T175 em 20 ml de cDMEM.
5. Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% durante a noite para permitir que as células HEK293T atinjam 70%-80% de confluência.
6. No dia seguinte, confirme a confluência das células sob um microscópio óptico.
7. Remover o meio do balão com uma faixa serológica de 25 ml sem perturbar a monocamada celular.
8. Adicione suavemente 10 mL de DPBS e balance a placa para lavar as células, tomando cuidado para não perturbar a monocamada celular.
9. Remova a SPBD com uma faixa sorológica de 25 mL.
10. Adicionar 15 ml de novo cDMEM na parede por balão T175 para não perturbar a monocamada celular e voltar a colocar a placa na incubadora a 37 °C.

2. Transfecção de células HEK293T usando reagente de transfecção lipídica não lipossomal

1. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, prepare os componentes lentivirais: 2 μg de plasmídeo lentiviral, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) e 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) com tampão EC (kit de reagentes de transfecção) para um volume final de 600 μL.
2. Adicione 36 μL de solução intensificadora. Misture os componentes usando uma pipeta de 1 mL, sugando repetidamente uma parte do líquido e colocando-a de volta gota a gota diretamente sobre a solução restante. Deixe por 5 min em temperatura ambiente (RT).
3. Adicione 120 μL de reagente de transfecção e misture como acima aproximadamente 20 vezes. Incubar por 10 min em RT.
4. Adicione 5,2 ml de cDMEM e misture como acima com uma faixa serológica de 5 ml.
5. Usando uma pipeta de transferência descartável, adicione a mistura de transfecção gota a gota diretamente na monocamada de células HEK293T (evitando as paredes do frasco), espalhando a mistura em diferentes pontos do frasco.
6. Distribuir o plasmídeo agitando suavemente o balão de um lado para o outro. Evite colocar qualquer líquido na tampa do frasco.
7. Incubar o balão a 37 °C numa estufa de CO₂ a 5 % durante 48 h. Confirme a transfecção efetiva de células HEK293T pelo aparecimento de um marcador fluorescente, aqui GFP, dentro de 24 h após a transfecção monitorada sob um microscópio fluorescente de imagem celular.
   NOTA: Para construções sem o marcador fluorescente, HEK293T células devem ser testadas quanto à presença do gene marcador usado ou por alteração de expressão no gene / proteína de interesse por técnicas apropriadas, por exemplo, qPCR. Alternativamente, a transfecção bem-sucedida pode ser verificada indiretamente durante o teste da coleção de lentivírus em células Jurkat nos estágios posteriores do protocolo pelas técnicas acima.
   CUIDADO: As células HEK293T transfectadas são consideradas infecciosas e as devidas precauções de segurança devem ser implementadas ao manusear essas células. As regras locais devem ser seguidas, o que normalmente pode incluir trabalhar sob um gabinete de segurança de biologia de categoria II, o uso de luvas duplas e solução de descontaminação apropriada para desinfecção, por exemplo, aumento da concentração de alvejante residual (2.000 ppm) ou solução equivalente de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Todas as soluções e plásticos que entram em contato com a preparação de lentivírus devem ser desinfetados de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança.

3. Coleta de partículas lentivirais

1. Prepare uma solução de descontaminação, uma solução de alvejante (hipoclorito de sódio) de alta concentração (2.000 ppm) ou agente equivalente de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança em um balde e coloque-o no gabinete de segurança biológica.
2. Prepare o gabinete de segurança de biologia removendo quaisquer itens em excesso, como racks de tubos vazios, etc.
3. Pré-rotule um tubo de centrífuga de 50 mL por frasco de células de HEK293T T175 e remova a tampa do tubo de centrífuga. Coloque os tubos em um rack estável.
4. Retirar o balão da incubadora e confirmar a expressão de GFP utilizando um microscópio fluorescente com um laser de 488 nm (figura 1A). A intensidade do sinal depende da eficiência de transfecção do procedimento e dos construtos utilizados.
5. Colete o meio das células no tubo de centrífuga pré-rotulado de 50 mL. Inclinar o balão de HEK293T T175 com células transfectadas para que o meio se acumule no canto inferior do balão. Usando uma faixa sorológica de 25 mL, colete o meio sem perturbar a monocamada celular. Algumas células flutuantes podem ser visíveis neste ponto. Transfira o meio para um tubo de centrifugação limpo de 50 mL e feche a tampa.
   1. Utilizando uma faixa serológica de 25 ml, adicionar 25 ml de cDMEM fresco e quente ao balão. Certifique-se de direcionar o fluxo do meio nas paredes do frasco para não perturbar a monocamada da célula. Retorne o frasco com células de HEK293T transfectadas para a incubadora (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Uma segunda coleta de lentivírus e purificação adicional podem ser realizadas após 24 horas adicionais após o procedimento descrito nas etapas acima.
6. Quando a coleta de lentivírus for concluída após 24 h ou 48 h, adicione solução de descontaminação às células, garantindo que ela cubra a monocamada celular. Manter o balão na horizontal durante as 24 horas seguintes e, em seguida, eliminá-lo de acordo com os regulamentos adequados da categoria II.

4. Purificação do lentivírus

1. Filtre o meio coletor da etapa 3.5.
   1. Remova o êmbolo da seringa de 50 mL e insira um filtro estéril de poliéter sulfona ou fluoreto de polivinilideno de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm na extremidade da seringa. Utilizando uma tira serológica de 25 ml, adicionar o meio recolhido do passo 3.5.1 à seringa e voltar a colocar suavemente o êmbolo.
   2. Empurre o plugue lentamente para passar o meio através do filtro para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Se o fluxo reduzir significativamente, posicione a seringa com o filtro apontando para cima e puxe o êmbolo o suficiente para retirar o meio do filtro.
   3. Com cuidado, substitua o filtro da seringa por um novo e descarte o filtro usado na solução de descontaminação. Continue a filtração média. Quando terminar, descontamine o filtro e a seringa submergindo o filtro e enchendo a seringa com a solução de descontaminação.
2. Pré-resfrie a ultracentrífuga ajustando a temperatura para 4 °C e feche a tampa para permitir que a temperatura se aclimate.
3. Adicione 3 mL de solução de sacarose a 20% (20% p / v em água ultrapura, filtro esterilizado com um filtro de 0,22 μm) no fundo do tubo cônico da ultracentrífuga.
4. Usando uma faixa sorológica de 25 mL, sobreponha o meio filtrado sobre a camada de sacarose, tomando cuidado para não perturbar as camadas.
   1. Use a configuração de velocidade mais baixa no pipeta. Incline o tubo cônico da ultracentrífuga para cerca de 45 ° e adicione lentamente o meio contendo lentivírus filtrado da etapa 4.1 à parede do tubo. Certifique-se de que o meio e a sacarose não se misturem e que a separação clara das camadas seja visível (Figura 1B). À medida que o volume da camada média aumenta, incline lentamente o tubo da ultracentrífuga de volta para a posição vertical.
5. Se o volume total, incluindo a sacarose e o meio, no tubo de ultracentrífuga for inferior a 29 mL, complete com cDMEM fresco para evitar que o tubo entre em colapso durante a centrifugação. Para várias coletas de T175 mL, misture preparações de meio filtrado e use vários tubos de ultracentrífuga. Complete o tubo de ultracentrífuga final com o meio, conforme necessário.
6. Certifique-se de que os baldes da ultracentrífuga estejam limpos; Não há resíduo médio no fundo do balde ou nas tampas. Se necessário, limpe com álcool ~ 70%. Coloque os adaptadores de tubo apropriados no fundo de cada balde (Figura 1C) e abaixe suavemente os tubos da ultracentrífuga nos baldes.
7. Feche os baldes com segurança e pendure-os nos espaços alocados no rotor giratório.
8. Certifique-se de que os baldes estejam equilibrados com os mesmos volumes de sacarose e meio. Um rotor giratório nunca deve funcionar sem caçambas, embora as caçambas opostas possam ser deixadas vazias²⁰ (Figura 1D).
9. Insira cuidadosamente o rotor na ultracentrífuga e ligue o vácuo. Defina a taxa de aceleração e desaceleração da ultracentrífuga para a configuração mais baixa e execute as preparações de lentivírus a 85.000 x g por 90 min a 4 ° C.
10. Aguarde até que a ultracentrífuga atinja a velocidade necessária (cerca de 3-5 min) antes de se afastar para garantir que o rotor seja inserido corretamente e que a centrifugação não termine.
11. Enquanto a ultracentrífuga estiver funcionando, limpe o espaço de trabalho de acordo com os requisitos de segurança da categoria II e prepare o espaço para as próximas etapas.
12. Quando a centrifugação terminar, desative o vácuo e remova cuidadosamente o rotor para não perturbar as amostras.
13. Investigue a ultracentrífuga em busca de derramamentos e confirme se não há vazamentos dos baldes. Em caso de derramamento, use luva dupla e descontamine a centrífuga e a superfície externa dos baldes com produtos antivirais.
14. Remova os baldes da ultracentrífuga e transporte-os cuidadosamente para a cabine de segurança biológica da categoria II.
    NOTA: As partículas de lentivírus se acumulam na parte inferior do tubo da ultracentrífuga. O pellet não é visível a olho nu.
15. Despeje a sacarose e o meio com um movimento suave diretamente no recipiente de resíduos com a solução de descontaminação.
16. Mantendo o tubo de ultracentrífuga invertido, transfira-o para a dupla camada de tecido e deixe secar por 10 min. Enquanto isso, limpe o interior dos baldes com lenços de papel embebidos em água e seque ao ar de cabeça para baixo.
17. Seque cuidadosamente qualquer líquido restante da borda do tubo de ultracentrífuga com lenço de papel antes de girá-lo na vertical. Desinfete o tecido e a superfície por baixo.
18. Ressuspenda o pellet de vírus em 1 mL de meio ou solução sem soro necessária para experimentação adicional, pipetando suavemente a solução para cima e para baixo. Deixe por 15 min no RT dentro do gabinete de segurança de biologia categoria II.
19. Misture delicadamente as preparações de lentivírus usando 1 mL de pipeta antes de aliquotar em tubos de rosca de 1,5 mL (por exemplo, criotubos). Preparar as alíquotas para o trabalho in vivo (multiplicidade de 100 μL) e para o título de lentivírus em células T Jurkat (1 x 20 μL) (ver passo 5).
20. Evite ciclos de congelamento e descongelamento; as preparações lentivirais podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses sem efeito negativo na infectividade.

5. Titulação da produção de lentivírus em células T Jurkat

1. Prepare o meio completo do Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) para células T Jurkat suplementando 500 mL de RPMI-1640 com 10% (v / v) de soro fetal de bezerro e concentração final de 100 U / mL de penicilina / estreptomicina.
2. Para garantir uma cultura saudável de células T Jurkat, mantenha as células em cultura por até 1 semana antes da infecção.
3. No dia da titulação do lentivírus, coloque as células T Jurkat viáveis em uma placa de 24 poços a 2 x 10⁵ células/poço em 200 μL por poço de cRPMI-1640.
4. Use lentivírus recém-coletado ou descongele o frasco para lentivírus contendo 20 μL em gelo e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.
5. Usando diluição serial em cRPMI-1640, infecte células T Jurkat com 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL e 10 μL de estoque de lentivírus. Balance suavemente a placa para garantir a distribuição igual do lentivírus. As células T Jurkat não infectadas servem como um controle negativo.
6. Incubar a placa a 37 °C. Após 4 h, complete cada poço com cRPMI até um volume total de 400 μL. Retorne a placa para a incubadora a 37 ° C por 3 dias.
7. Após 48 h após a infecção, confirme a expressão de GFP em um sistema de imagem fluorescente.
8. 3 dias após a infecção, colete cada poço da placa de 24 poços em tubos de coleta separados de 1,5 mL e centrifugue as células a 350 x g a 4 ° C por 5 min.
9. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) preparado a 2% (p / v) em DPBS e deixe-o por 15 min em gelo no escuro.
10. Centrifugue as células a 350 x g a 4 °C durante 5 min e ressuspenda o pellet em tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (DPBS estéril + 4% FCS + EDTA estéril 1 mM).
11. Analise a frequência de expressão de GFP e a intensidade fluorescente média do lentivírus infectado e suas células de controle usando citometria de fluxo (Figura 2).

6. Infecção por lentivírus in vivo de macrófagos peritoneais residentes no tecido

1. Em uma cabine de segurança biológica de categoria II, carregue as agulhas de insulina com um volume total de 200 μL de meio sem soro contendo a quantidade necessária de lentivírus (use agulhas descartáveis, 30 G para bem-estar animal e para evitar perda de fluido na agulha).
2. Coloque a bainha da agulha de volta na agulha usando a técnica de colher com uma mão. Mantenha a agulha no gelo e injete em 30 minutos.
3. Na instalação animal, instale uma cabine de segurança biológica de categoria II antes das injeções (Figura 1E).
   1. Coloque uma folha de lenço de papel limpo. Afrouxe a bainha da agulha de insulina contendo lentivírus.
   2. Prepare uma placa de Petri contendo pequenos pedaços de tecido e desinfetante à base de gluconato de clorexidina, um tubo de 50 mL contendo solução de descontaminação (2.000 ppm de solução de alvejante) e um recipiente seguro e afiado.
4. Contenha o mouse segurando a pele na nuca²¹. O mouse devidamente contido é imóvel, e isso é necessário para a segurança.
5. Com o abdômen voltado para cima, aponte a cabeça do animal ligeiramente para baixo. Injete o lentivírus por via intraperitoneal no quadrante inferior direito da cavidade abdominal. Isso é para evitar a injeção em qualquer órgão da cavidade peritoneal.
6. Antes de soltar o mouse, encha a seringa com solução de descontaminação e descarte-a com segurança no cofre afiado.
7. Limpe o local da injeção no abdômen do camundongo com lenço de papel embebido em desinfetante e devolva o animal à gaiola.
8. Alojar o camundongo injetado com lentivírus em gaiolas de categoria II ou ventiladas individualmente (IVC) (gaiolas isoladas com filtragem de ar de alta eficiência) por um período mínimo de 72 h após a injeção. Coloque um cartão de informações apropriado na frente da gaiola.
9. Mova o mouse para a nova gaiola de retenção da categoria I após 72 h após a infecção, dependendo das aprovações de segurança locais. Monitore os camundongos diariamente por um total de 3 dias a partir da injeção.

7. Coleta de células peritoneais de camundongo infectado com lentivírus

CUIDADO: Para coletas dentro de 72 h após a injeção de lentivírus, siga as regras institucionais de segurança biológica da categoria II. A cama e a gaiola de armazenamento onde os animais infectados foram mantidos nas primeiras 72 horas após a injeção de lentivírus devem ser descontaminadas de acordo com as regras institucionais de segurança biológica da categoria II.

1. Eutanásia de camundongos seguindo os regulamentos institucionais, por exemplo, por inalação de concentração crescente de CO₂, seguida de confirmação de morte por luxação cervical.
2. Limpe o abdômen do camundongo com isopropanol a 70% e corte cuidadosamente a pele para expor a membrana da cavidade peritoneal.
3. Lave a cavidade peritoneal com 6 mL de tampão FACS gelado usando uma seringa de 10 mL e agulha de 23 G. Evite perfurar quaisquer órgãos.
4. Massageie suavemente o peritônio para desalojar as células para o tampão FACS.
5. Colete o fluido peritoneal usando a mesma seringa e agulha.
6. Remova a agulha e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
7. Mantenha as lavagens peritoneais no gelo.
8. Colete outros órgãos necessários e armazene-os conforme apropriado para o estudo.
9. Descarte as carcaças de animais de acordo com as diretrizes locais de segurança e animais.

8. Coloração e análise de células peritoneais

1. Centrifugar a lavagem peritoneal a 350 x g a 4 °C durante 5 min, rejeitar o sobrenadante na solução de descontaminação e ressuspender as células em 1 ml de tampão FACS.
2. Conte as células coletadas e coloque 4 x 10⁵ células por poço em uma placa de 96 poços com fundo em V.
3. Realize a coloração de viabilidade usando um reagente corrigível (por exemplo, Kit de coloração de células mortas de infravermelho próximo corrigível usado aqui) de acordo com as instruções do fabricante.
4. Se as células foram infectadas nas últimas 72 h, fixe as células em PFA a 2% por 15 min no gelo. Adicione um volume igual de DPBS frio e centrifugue novamente a 350 x g a 4 °C por 5 min.
5. Prepare o tampão de bloqueio: Misture 4 μg / mL de anticorpo 2.4G2 em soro de rato a 10% (v / v) em tampão FACS para coloração de superfície ou tampão de permeabilização para coloração intracelular.
6. Ressuspender cada alvéolo contendo sedimento celular em 50 μL de tampão de bloqueio e incubar a 4 °C durante 15 min.
7. Prepare a mistura de anticorpos em 50 μL de tampão FACS (para coloração superficial) ou tampão de permeabilização (para coloração intracelular) para cada amostra. O volume final de coloração para cada amostra será de 100 μL, incluindo 50 μL de tampão de bloqueio. Calcule as concentrações de anticorpos em conformidade (Tabela 1).
8. Adicione 50 μL de mistura de anticorpos às amostras e 50 μL de controles de isotipo e tampão de controle às amostras de controle. Incube as amostras por 30 min no gelo no escuro. Inclua células não coradas e controles de isotipo, conforme necessário.
9. Lave cada poço com 100-200 μL de DPBS gelado e centrifugue a placa a 350 x g a 4 °C por 5 min. Repita esta etapa para remover quaisquer anticorpos não ligados. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.

9. Extração de células de órgãos

1. Prepare 1 mL de mistura de digestão por órgão: Misture a solução salina balanceada de Hank (HBSS), 2 mg / mL de colagenase tipo IV e 0,03 mg / mL de DNase I (inclua 1,5 mg / mL de hialuronidase para digestão pulmonar).
2. Transfira o órgão coletado para 1 mL de mistura de digestão e pique com uma tesoura.
3. Filtrar as células através de um filtro de 40 μm e centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
4. Se isolar células do pulmão, baço ou fígado, lise os glóbulos vermelhos usando tampão de lise ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA pH = 7.4). Filtrar as células através de um filtro de 40 μm e centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
5. Pinte e analise as células conforme descrito na seção 8.

Resultados

Quando seguido completa e corretamente, este protocolo produz um total de 1,5 mL de estoque de lentivírus de alta qualidade por preparação única, suficiente para doze injeções in vivo no volume ideal determinado neste estudo¹⁸. O sucesso da transfecção pode ser avaliado no início do protocolo. Células HEK293T saudáveis e confluentes devem exibir, se presentes nos plasmídeos, um sinal marcador facilmente detectável (por exemplo, GFP usado neste estudo) após 48 h após a transfecção do plasmídeo (Figura 1A). A baixa intensidade do sinal, o descolamento celular excessivo e a baixa confluência nas etapas iniciais do protocolo podem indicar morte celular e resultar em baixo rendimento da preparação de lentivírus. Parte do descolamento celular antes da coleta opcional II (etapa 3.5.1.) é visível e esperado.

Três plasmídeos são usados neste protocolo para geração de partículas de lentivírus: plasmídeo de empacotamento pCMV-ΔR8.91 que codifica a proteína estrutural do HIV-1 (Gag), proteínas acessórias Tat e Rev e polimerase via transcriptase reversa (Pol)²²; pMD2.G que codifica o envelope VSV-G sob o promotor¹³ do CMV; e plasmídeo pHR'SIN-cPPT-SEW (codificando o marcador GFP aprimorado)¹⁹ modificado de acordo com a expressão de shRNA ou microRNA.

As preparações de lentivírus são tituladas na linhagem celular Jurkat T devido à sua alta infectividade²³. A preparação bem-sucedida do lentivírus atingirá uma taxa de infecção de mais de 95% com uma dose tão pequena quanto 5 μL (Figura 2A). A intensidade fluorescente média das células infectadas continua a aumentar com as doses mais altas (Figura 2B, C). Se necessário, os títulos virais podem ser medidos usando PCR em tempo real de componentes virais integrados, por exemplo, o promotor SFFV, que se correlacionou linearmente com a porcentagem de células que expressam GFP e logaritmicamente com GFP MFI (Figura 2D). Dependendo da construção, particularmente aquelas com uma inserção grande²⁴, algumas preparações de lentivírus podem apresentar infectividade reduzida nas células T Jurkat, conforme demonstrado para a construção Cre-GFP usada neste estudo (Figura 2E, F). Nesse caso, várias preparações de partículas de lentivírus podem ser combinadas e ressuspensas em 1 mL. Recomendamos validar as respostas imunes a essas preparações in vivo antes da experimentação. Naturalmente, as preparações de lentivírus com receptores de entrada alternativos ao VSV-G usados aqui podem exibir diferentes eficiências de infecção na linha celular Jurkat T, dependendo da expressão do receptor nas células. As linhagens celulares utilizadas para a titulação devem ser selecionadas de forma que expressem o receptor utilizado pelas partículas de lentivírus para entrar nas células e preferencialmente não tenham ou tenham expressão muito baixa dos fatores de restrição²⁵.

A produção bem-sucedida de partículas lentivirais é ainda evidenciada pela infecção de pMφ (definida como população CD11b⁺ F4/80⁺ e Tim4⁺)¹⁸ (Figura 3A). Determinamos que a injeção intraperitoneal de 100 μL de preparação de lentivírus (em volume total de 200 μL de meio livre de soro) produz a maior porcentagem e intensidade do sinal GFP nessas células ( Figura 3B , C ). Injeções de doses mais altas (150 μL e 200 μL de preparação de lentivírus) não tiveram impacto benéfico na expressão de GFP no pMφ. Experimentos de curso de tempo em 4 h, 3 dias, 7 dias e 14 dias após a injeção intraperitoneal (i.p) com 100 μL de lentivírus revelaram uma porcentagem significativa de pMφ residente que expressa GFP nos dias 3 e 7, seguido pelo desaparecimento da população infectada no dia 14 (Figura 3D, E). Curiosamente, o pMφ que expressa GFP desaparece principalmente no dia 14 após a infecção, devido em parte ao reconhecimento imunológico do marcador GFP. De fato, experimentos de lentivírus com marcador GFP em camundongos Foxp3-DTR-eGFP seletivos para T-Reg evitam a rejeição de pMφ residente infectado até pelo menos o dia 21 (Figura 3F). Para preparações de lentivírus com eficácia diminuída em células Jurkat, uma quantidade maior seria necessária para atingir a taxa de infecção esperada in vivo. No entanto, conforme demonstrado com a preparação de lentivírus Cre-GFP, dependendo do desenho da construção, mesmo uma dose de 300 μL 7 dias após a injeção ip pode produzir um resultado ruim ( Figura 3G ). Anteriormente, demonstramos o uso bem-sucedido deste protocolo para superexpressão e knockdown de genes in vivo em pMφ de camundongo, incluindo Map3k8 mediado por shRNA lentiviral e knockdown de Gata6 ¹⁹. Aqui, mostramos que este protocolo também pode ser empregado com sucesso para superexpressão de microRNA murino 146b (mmu-miR-146b) e para knockdown da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1, CD54) usando shRNA derivado de lentivírus em pMφ residente ( Figura 3H , I ).

A infecção de células primárias, como macrófagos, requer maior entrada de lentivírus, presumivelmente devido à presença de fatores de restrição nessas células. Os fatores de restrição são mecanismos de proteção naturais das células que interferem nas etapas do ciclo de vida dos vírus, como transcrição reversa ou integração, levando à inibição da expressão gênica das construções.

Além disso, a validação in vivo do protocolo não demonstrou nenhum efeito da entrega de lentivírus i.p na viabilidade das células imunes peritoneais ( Figura 4A ) e indicou infectividade distinta das subpopulações pMφ residentes (definidas pela expressão dos marcadores CD73 e Tim4) ( Figura 4B , C ). É importante ressaltar que a infecção produtiva por lentivírus foi limitada ao Mφ residente no local da injeção, conforme evidenciado pela falta de expressão significativa de GFP no linfonodo mesentérico (mLN), pulmão, fígado ou baço Mφ após 7 dias após o desafio ( Figura 4D ). Considerando que, em muitos casos, o direcionamento genético de Mφ deve ser realizado em condições inflamatórias, investigamos a eficácia desse protocolo em camundongos desafiados por via intraperitoneal com 0,1 mL de tioglicolato a 4%. A injeção de tioglicolato desencadeia um influxo de células Mφ e monocíticas derivadas de monócitos inflamatórios que podem ser divididas em 5 populações distintas ( Figura 4E ). A análise por citometria de fluxo revelou um fenótipo refratário de células monocíticas (populações Ly6C^hi 1 e 2) à infecção por lentivírus, em linha com achados anteriores em células humanas²⁶. Em contraste, Mφ e monócitos residentes (grupos 3-5) permaneceram mais suscetíveis à infecção (Figura 4F).

A análise detalhada da citometria de fluxo detectou a expressão de GFP predominantemente em Mφ peritoneal residente e pMφ residente no complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II⁺ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (até 60% no dia 3 após a injeção) (Figura 5A). Pouco ou nenhum sinal de GFP foi detectado em outras populações de células peritoneais, incluindo Mφs/DCs peritoneais derivados da medula óssea (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), células B (CD19⁺), células T (CD3⁺), mastócitos (CD11b^-, FcεR1⁺), eosinófilos (Siglec-F⁺), células NK (CD19^-, NK1.1⁺) e neutrófilos (Ly6G⁺) (Figura 5A, B). A longevidade da expressão de GFP (Figura 5C) em todas as populações seguiu a de Mφ peritoneal residente (Figura 1D). Um aumento transitório na frequência de neutrófilos foi registrado após 4 h após a injeção i.p de 100 μL (em um volume total de 200 μL de meio livre de soro) de lentivírus (Figura 5D), indicando inflamação leve precoce presente em animais desafiados. Finalmente, o pMφ residente experimentou uma grande queda na frequência entre os dias 7 e 14 pós-infecção (Figura 5E), sugerindo a melhor janela experimental entre os dias 3 e 7 pós-injeção.

Figura 1: Produção de lentivírus em células HEK293T . (A) Imagens representativas de imunofluorescência de células HEK293T 48h após a transfecção bem-sucedida (microscópio fluorescente [pico de excitação de 488 nm, pico de emissão de 510 nm], ampliação de 20x, barra de escala = 400 μm). (B) Fotografia do tubo cônico da ultracentrífuga contendo uma camada de sacarose a 20% (inferior, transparente) e uma camada de meio coletada de células HEK293T transfectadas (superior, vermelho). (C) Fotografia da inserção correta da ultracentrífuga cônica no balde, incluindo o adaptador. (D) Fotografias mostrando o balanceamento correto e incorreto do rotor da ultracentrífuga. (E) Fotografia da configuração ideal do gabinete Cat II e materiais para injeções in vivo para um indivíduo destro. Esta figura foi modificada com permissão de Ipseiz N et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Titulação de lentivírus em células T Jurkat. (A) Análise de citometria de fluxo representativa de células T Jurkat 72 h após a infecção com doses crescentes de lentivírus contendo um plasmídeo GFP mostrando a porcentagem de células GFP ⁺ (GFP ⁺), (B) intensidade média de fluorescência (MFI) de células GFP ⁺ e (C) um histograma representativo da expressão de GFP. (D) Gráfico de dispersão mostrando MFI (Y esquerdo) e a porcentagem de células infectadas com um lentivírus que expressa GFP (Y direito) versus o número de cópias do vírus detectado por pg de DNA (eixo x). (E) Um histograma representativo da infecção de células T Jurkat com lentivírus Cre-GFP subótimo (Cre-GFP LV) preparação e controle de lentivírus GFP (GFP LV) e (F) dados resumidos mostrando a porcentagem de células T Jurkat infectadas com lentivírus Cre-GFP (GFP ⁺). Esta figura foi modificada com permissão de Ipseiz N et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Eficiência de infecção do pMФ residente. (A) Estratégia de gating de células pMφ residentes (CD11b ⁺, Tim4 ⁺, F4 / 80 ⁺) e Tim4^-, F4 / 80 ⁺ . As células foram fechadas em singletos, seguidas por CD11b⁺. (B) Gráficos de pontos representativos e (C) um resumo da frequência de infecção (% de células GFP+) e intensidade (MFI) de células GFP⁺ isoladas 3 dias após a infecção in vivo com diferentes quantidades de preparação de lentivírus GFP. (D) Gráfico de pontos representativo e (E) um resumo da frequência de infecção (% de células GFP +) e intensidade (MFI) de células GFP + isoladas em diferentes momentos após infecção in vivo com 100 μL de lentivírus em um volume total de 200 μL de meio livre de soro. (F) Um resumo do número de células nos dias 7, 14 e 21 após a entrega intraperitoneal de lentivírus que expressa GFP em camundongos Foxp3-DTR-eGFP mostrando o número de pMφ que expressam GFP e macrófagos inflamatórios e células dendríticas (InfMØs / DCs [F480^baixo]). (n= 1-2 por grupo). (G) Gráfico de pontos representativo da infecção in vivo subótima de Gata6-KO ^{mye 19} pMφ residente com 300 μL de lentivírus Cre-GFP 7 dias após a injeção ip. (H) Quantificação de RT-qPCR da expressão de mmu-miR-146b-5p de Mφ peritoneal residente desafiado in vivo com 100 μL de lentivírus que codifica microRNA-146b murino (miR-146b) ou controle (C). Células residentes pMφ (círculos brancos) e Tim4^-, F4/80⁺ (círculos cinzas). (I) Um gráfico de pontos representativo da regulação negativa bem-sucedida de ICAM1 em pMφ em camundongos 129S6 fêmeas, 7 dias após a injeção ip de lentivírus contendo shRNA direcionado. O shRNA de controle é mostrado. A sobreposição mostra o controle de isotipo. Dados expressos como média ± camundongos SEM, n≥2. Esta figura foi modificada com permissão de Ipseiz N et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Eficiência de infecção das subpopulações pMφ residentes. (A) Porcentagem do total de células individuais e Mφ residente viável 7 dias após 100 μL de meio livre de soro (-) ou injeção de lentivírus GFP (+) ip. (B) Estratégia de gating mostrando quatro populações principais de pMφ encontradas in vivo: CD73 ⁺ Tim4 ⁺, CD73-Tim4^-, CD73 ⁺ Tim4^-, CD73-Tim4 ⁺ e (C) frequência de infecção correspondente (% células GFP +) e intensidade (MFI de células GFP +) dessas populações. (D) Porcentagem de células GFP+ em múltiplos órgãos 7 dias após a injeção de 100 μL de lentivírus ip. Abreviaturas: mLN, linfonodo mesentérico. (E) Os camundongos foram injetados i.p com 0,1 mL de tioglicolato a 4% por 5 dias, seguido de injeção i.p com lentivírus. Estratégia de gating de pMφ e monócitos após 3 dias após a injeção de lentivírus i.p. (F) Frequência de infecção, MFI e análise do número de células de monócitos GFP+ (Ly6C⁺) e Mφ (Ly6C^-). Dados expressos como média ± camundongos SEM, n≥3. Esta figura foi modificada com permissão de Ipseiz N et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Impacto da injeção de lentivírus na inflamação peritoneal. Os camundongos foram injetados in vivo i.p com lentivírus expressando GFP. (A) Frequência de infecção de populações de células na cavidade peritoneal após várias quantidades de injeções de lentivírus (50 μL, 100 μL, 150 μL ou 200 μL). (B) Intensidade da expressão de GFP em populações de células infectadas produtivamente 7 dias após a injeção ip. (C) Frequência de infecção de populações de células na cavidade peritoneal em vários momentos após a injeção ip. (D) e (E) Porcentagem de células em vários pontos de tempo após a injeção ip. Todas as injeções de lentivírus foram realizadas com o mesmo volume total de 200 μL completado por meio sem soro. Salvo indicação em contrário, foi utilizada uma dose de 100 μL de lentivírus. Os camundongos controle ("C") receberam 200 μL de meio puro sem soro. Dados expressos como média ± camundongos SEM, n≥3. Esta figura foi modificada com permissão de Ipseiz N et ^al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Alvo de anticorpos	Fluoróforo	Clone	Diluição utilizada	concentração final [μg/mL]
Antígeno central do HIV-1	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5	1A8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17A2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500A2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	N418	1/800	0.25
CD11c	BV605	N418	1/400	0.5
CD226	AF647	10 E 5	1/400	1.25
Timóteo 4	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	APC	GK1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70	1/400	0.5
F4/80	Azul Pacífico	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	2.5
CD19	V450	1D3	1/400	0.5
CD19	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	APC/Cy7	PK136	1/400	0.5
FceR1	eFluor450	1º DE MARÇO	1/400	0.5
ICAM1	PE	1A29	1/100	2
IgG1 de rato, controle do isotipo κ	PE		1/100	2

Tabela 1: Lista de anticorpos

Discussão

Os macrófagos residentes no tecido desempenham uma variedade de funções homeostáticas e inflamatórias específicas do tecido ^1,2 ditadas por seu ambiente fisiológico ^6,7,8,9. Neste protocolo, um método eficaz¹⁸ para manipulação de macrófagos residentes peritoneais in vivo usando partículas de lentivírus foi introduzido para investigar a função dos macrófagos em seu microambiente biológico.

É essencial para o sucesso do protocolo usar células HEK293T saudáveis. É a melhor prática descongelar as células pelo menos uma semana antes do início deste protocolo para garantir a recuperação das células e bons números. As células devem ser semeadas em um volume apropriado de meio um dia antes da transfecção planejada e devem atingir cerca de 80% de confluência no dia da transfecção. Preparações celulares sub ou superconfluentes resultarão em redução do rendimento de lentivírus. Recomendamos a transfecção de células HEK293T com o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante para obter os melhores resultados. As etapas essenciais da transfecção incluem a mistura apropriada dos plasmídeos e reagentes e a adição gota a gota da mistura diretamente à monocamada da célula HEK293T. A transfecção de fosfato de cálcio de células HEK293T^27,28 poderia ser empregada neste protocolo. No entanto, o usuário deve estar ciente de que a eficácia desse método pode variar e pode resultar em diminuição da eficiência da transfecção.

As precauções de segurança devem ser consideradas no protocolo a partir do dia da HEK293T transfecção celular. Isso inclui trabalhar em um armário de segurança de categoria II, usar luvas duplas ao manusear material contaminado e branqueamento adequado do material contaminado (com solução de descontaminação, por exemplo, 2.000 ppm de solução de alvejante) por no mínimo 4 h. Os usuários devem consultar seus regulamentos institucionais sobre o trabalho com patógenos e resíduos da categoria II.

Neste protocolo, a preparação de lentivírus é primeiro purificada usando um filtro de 0,45 μm para remover HEK293T detritos celulares. O uso de filtros menores (0,22 μm) e membranas de éster de celulose deve ser evitado, pois resultará na perda de partículas de lentivírus. Recomenda-se o uso de filtros de poliéter sulfona ou fluoreto de polivinilideno de baixa ligação a proteínas²⁹. A segunda etapa de purificação é realizada na camada única de sacarose a 20% em uma ultracentrífuga para remover as impurezas restantes, o que é particularmente importante para a consequente administração in vivo da preparação de lentivírus. Nas instituições em que a ultracentrífuga não está disponível, outros³⁰ descreveram a purificação de lentivírus à base de sacarose usando uma centrífuga de laboratório padrão. Isso poderia ser implementado neste protocolo como uma alternativa. A preparação de lentivírus é titulada em células T Jurkat na expressão do sinal do marcador (por exemplo, GFP usado neste protocolo). Para construtos sem marcadores, as partículas físicas de lentivírus podem ser avaliadas pela quantificação da proteína p24gag do HIV-1 pelo kit^{ELISA 31}, análise de citometria de fluxo do antígeno central¹⁸ do HIV-1 ou medição das alterações no gene alvo (preferencialmente usando os métodos que permitem a medição de alterações em células individuais, por exemplo, citometria de fluxo ou microscopia). Se a titulação do controle e do lentivírus diferir significativamente nas células T Jurkat, os volumes usados para os estudos in vivo podem ser ajustados para atingir a infecção mais comparável entre as preparações de lentivírus.

A principal limitação do protocolo é o desaparecimento observado de Mφ peritoneal residente em GFP⁺ dentro de 14 dias após a injeção de lentivírus i.p. Para estudos de longo prazo, linhagens de camundongos com alteração genética estável em um tipo de célula ou tecido específico devem ser consideradas³². Por exemplo, como os macrófagos peritoneais não expressam Foxp3 (uma proteína T-Reg), utilizamos camundongos Foxp3-DTR-eGFP³³ e confirmamos que a expressão de GFP é mantida em Mφ peritoneal 21 dias após a infecção ( Figura 3F ). No entanto, é importante notar que os lentivírus contêm outros componentes estranhos, e essa extensão na persistência de células infectadas nos camundongos Foxp3-DTR-GFP pode não ser permanente. Uma fraqueza adicional deste método é um baixo nível de inflamação que pode ser observado na cavidade peritoneal após a injeção de lentivírus, conforme testemunhado pelo influxo de neutrófilos 4 h após a injeção (Figura 5D), o que pode significar que infecções repetidas acelerariam a perda associada à inflamação de Mφ peritoneal residente que expressa GFP. Embora não tenhamos detectado interferons tipo I (IFNs) na cavidade peritoneal, as partículas de lentivírus pseudotipadas VSV-G demonstraram anteriormente induzir alguns dos genes estimulados por IFN em Mφ humano na ausência de IFNs detectáveis³⁴. Isso deve ser considerado ao usar este protocolo para experimentos que investigam respostas imunes antivirais. A ocorrência de inflamação aguda e sustentada após a injeção intravenosa de preparação de lentivírus pode indicar contaminação da preparação.

As áreas de solução de problemas incluem: 1) para baixo título de lentivírus, garantir a saúde das células HEK293T e a transfecção eficaz (por exemplo, expressão de marcadores, se presente, em HEK293T células). Se a taxa de infecção permanecer baixa, considere o tamanho do construto. Construções com inserções maiores ou estruturas secundárias mais complexas podem afetar o título final de lentivírus e a infectividade²⁴. Portanto, cada construção deve ser testada independentemente e em paralelo ao seu respectivo vetor de controle; 2) Se for necessária uma grande quantidade de lentivírus, recomenda-se preparar vários frascos T175 de células HEK293T e aumentar a produção de acordo. Para evitar a variação das preparações de lentivírus, é a melhor prática mesclar as coleções finais antes da alíquota e armazenamento. Para uma produção tão maior, a mistura de plasmídeos (seção 2) deve ser preparada em tubos de 50 mL para garantir a mistura eficaz dos componentes.

Apesar de seu amplo tropismo, as partículas lentivirais pseudotipadas do VSV-G visam predominantemente os macrófagos teciduais como demonstrado anteriormente para o alveolar³⁵ e, aqui,¹⁸ para o pMФ quando administradas pelas respectivas vias. Alterações no envelope nas partículas de lentivírus podem, em alguns casos, resultar em diminuição da transdução de macrófagos in vivo³⁶ e são desnecessárias para este protocolo. Em comparação com outras abordagens virais para manipulação gênica in vivo em macrófagos (revisado em³⁷), o uso de vetores lentivirais oferece integração estável do transgene em macrófagos teciduais³⁵, expressão transgênica eficiente e o maior limite de tamanho do vetor (aproximadamente 8 Kb).

A Mφ peritoneal desempenha um papel importante na prevenção, início, progressão e resolução de várias doenças, incluindo câncer abdominal, pancreatite e peritonite³⁸. Este protocolo descreve uma ferramenta eficaz para modificação gênica em pMφ murino, permitindo a investigação dos processos biológicos por trás dessas patologias em um microambiente fisiologicamente relevante. Embora os próprios vetores lentivirais estejam se tornando uma ferramenta de interesse para intervenções clínicas³⁹, devido à origem do vírus da imunodeficiência e a uma integração genômica estável, as preocupações de segurança impedem sua implementação terapêutica. Uma compreensão mais aprofundada das respostas dos macrófagos à modulação do gene lentiviral pode avançar na aplicação dessa ferramenta altamente eficaz em um ambiente clínico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina-EDTA (1x) (Tripsina 500 mg/L ou 0,02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0,22 μ m filtro estéril millex GP	Merck	SLGS033SS
0,45 μ m filtro estéril millex GP	Merck	SLHP033RS
seringa de insulina U-100 de 0,5 mL com agulha, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
recipiente para objetos cortantes de 1 litro	N/A	N/A
2.4G2 anticorpo (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ filtro	Thermo Fisher Scientific	22363547
meio AimV (grau de pesquisa), Suplemento AlbuMax	Thermo Fisher Scientific	31035025
Tampão de bloqueio	preparado em casa
Meio tioglicolato de cerveja	Sigma-Aldrich	B2551	Solução estoque a 4% preparada em água, autoclavada e mantida congelada.
CD11b	Biolegend	101222	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11b	BD	550993	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11c	Biolegend	117317	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11c	Biolegend	117333	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD19	BD	560375	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD19	Biolegend	152410	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD226	Biolegend	128808	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD3e	BD		560527 Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD3e	Biolegend	152313	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD4	Biolegend	100412	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD73	eBioscience	16-0731-82	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Frasco de cultura de células (frasco T175, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Tubos de centrífuga, tubos de fundo cônico 25 mm x 89 mm	Centrífugas Beckman Coulter	358126
Centrífuga	Ultracentrífuga Beckman Coulter		e centrífuga TC
Colagenase tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138
(15 mL e 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Criotubos	Greiner Bio One	123277	ou criotubos
DMEM médio (1x) + 4,5g/L D-glicose, 400 µ M L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Reagente de transfecção Effectene	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
F4/80	Biolegend	123133	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
F4/80	Biolegend	123147	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Soro fetal de bezerro (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	inativado por calor por 30 min a 56 &graus; C e estéril filtrado através de 0,22 μ filtro m
Citômetro de fluxo	Thermo Fisher Scientific	Tampão de citometria de fluxo Attune NxT
(FACS)	preparado internamente
Microscópio fluorescente de cultura de tecidos	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Fórceps	N/A	N/A Preferência	do usuário
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
Linha		celular HEK293T	cultivado por pelo menos uma semana antes da transfecção. Antígeno central do HIV-1 livre de micoplasma
	Beckman Coulter	6604667
Hialuronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex esfoliante cirúrgico, gluconato de clorexida 4% p/v limpador de pele	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
linha			cultivada por pelo menos uma semana antes do uso. Kit de coloração de
células mortas de infravermelho próximo corrigível VIVO/MORTO	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Os camundongos			aqui usaram fêmeas C57BL/6, com idade entre 8 e 12 semanas (Charles Rivers), a menos que especificado de forma diferente
Pipetas microcapilares (faixa de volume 0,5-1.000 μ L)	Fisher Científico & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148-500G	preparado a 2% p/v em PBS
pCMV-Δ Plasmídeo de embalagem R8.91	Zuffrey, R., et al. 1997		Resistência à ampicilina.
Penicilina/Estreptomicina (100x, 10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
placa de Petri	Greiner Bio One	664160
plasmídeo pHR'SIN-cPPT-SEW	Rosas, M. et al. 2014		Codifica o marcador EGFP a jusante do promotor SFFV e a montante do intensificador do vírus hepatitivo Woodchuck. Resistência à ampicilina.
O plasmídeo		Naldini, L. et al. 1996	codifica o envelope da glicoproteína g do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Resistência à ampicilina.
Controle de isotipo IgG1 de rato, κ	Becton Dickinson	550617	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração Soro
de rato	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Tampão de lise ACK de sangue vermelho	preparado em casa
Meio RPMI 1640 (1x) + 400 uM L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponina	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Comprimidos de hipoclorito de sódio (alvejante, 2.000 ppm)	Guest Medical	H8818
Placa de cultura de células estéril de 24 poços	Greiner Bio One	662160
PBS estéril de Dulbecco (DPBS) (1x) Mg++ e Ca2+ - grátis	Thermo Fisher Scientific	14190144
EDTA estéril	Thermo Fisher Scientific	15575020
Pipetas de transferência descartáveis VWR estéreis (23,0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sacarose	Thermo Fisher Scientific	15503022
tesouras cirúrgicas	N/A	N/A	Preferência do utilizador
Seringas (50 mL e 1 0 mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
placa de cultura de células de 96 poços com fundo em U	Greiner Bio One	650180