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Artigo de método

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

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DOI:

10.3791/64926

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16 de fevereiro de 2024

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1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity, Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science, Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Neste artigo

Resumo

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Resumo

Os macrófagos residentes no tecido peritoneal têm amplas funções na manutenção da homeostase e estão envolvidos em patologias nos tecidos locais e vizinhos. Suas funções são ditadas por pistas microambientais; Assim, é essencial investigar seu comportamento em um nicho fisiológico in vivo . Atualmente, metodologias específicas de direcionamento de macrófagos peritoneais empregam modelos transgênicos de camundongos inteiros. Aqui, é descrito um protocolo para modulação in vivo eficaz da expressão de mRNA e pequenas espécies de RNA (por exemplo, microRNA) em macrófagos peritoneais usando partículas de lentivírus. As preparações de lentivírus foram feitas em células HEK293T e purificadas em uma única camada de sacarose. A validação in vivo da efetividade do lentivírus após injeção intraperitoneal revelou infecção predominante de macrófagos restritos ao tecido local. O direcionamento de macrófagos peritoneais foi bem-sucedido durante a homeostase e a peritonite induzida por tioglicolato. As limitações do protocolo, incluindo inflamação de baixo nível induzida pela administração intraperitoneal de lentivírus e restrições de tempo para experimentos potenciais, são discutidas. No geral, este estudo apresenta um protocolo rápido e acessível para a avaliação rápida da função gênica em macrófagos peritoneais in vivo.

Introdução

Os macrófagos residentes no tecido (Mφ) são uma população heterogênea de células imunes fagocíticas que detectam e respondem a patógenos invasores 1,2. Além disso, desempenham um papel essencial no desenvolvimento, remodelação e manutenção da homeostase tecidual 1,3. Muitos tecidos Mφ derivam de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese e persistem no tecido ao longo da vida 4,5. O fenótipo e as funções dessas células são ditados por interações colaborativas e hierárquicas de fatores de transcrição específicos e do microambiente local 6,7,8,9. Uma compreensão crescente dessa dependência aumenta a necessidade de métodos in vivo eficazes para manipulação gênica de Mφ dentro de seu nicho fisiologicamente relevante.

Os vetores lentivirais são uma ferramenta frequentemente empregada para a manipulação de ácidos nucléicos em populações celulares específicas in vivo 10,11,12, particularmente devido à sua capacidade de infectar células em divisão e não em divisão e de se integrar de forma estável ao genoma do hospedeiro13,14. Nas últimas duas décadas, a tecnologia de entrega de lentivírus foi otimizada e envelopes alternativos e promotores sintéticos foram investigados para aumentar o direcionamento específico da linhagem 8,15. Devido ao seu amplo tropismo celular, a glicoproteína de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G)16,17 tornou-se o envelope "padrão-ouro" usado na tecnologia de lentivírus.

Neste protocolo18, partículas lentivirais pseudotipadas VSV-G são empregadas para demonstrar a entrega direcionada e eficaz de RNA de grampo curto (shRNA) e microRNA (miR) para Mφ peritoneal de camundongo (pMφ) in vivo, no estado estacionário19. A expressão do transgene foi impulsionada pelo promotor do vírus formador de foco do baço (SFFV). A infecção produtiva das células foi definida pela expressão da proteína fluorescente verde aprimorada (GFP) derivada do lentivírus. A utilização dessa abordagem permitiu uma leitura fácil para experimentos de lentivírus in vivo para definir a dose ideal e o período experimental. Finalmente, o desafio lentiviral in vivo de camundongos durante a inflamação induzida por tioglicolato revelou a propensão natural para a infecção seletiva por pMφ.

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Protocolo

Todo o trabalho com animais foi conduzido de acordo com as diretrizes institucionais e do Ministério do Interior do Reino Unido.

NOTA: Todos os estudos in vivo com lentivírus devem ser realizados de acordo com as diretrizes locais e nacionais sobre o uso ético de animais em pesquisa, bem como aderir a todos os regulamentos associados ao uso de materiais infecciosos da categoria II. O bem-estar animal também deve ser monitorado de acordo com os regulamentos locais. Nesta etapa do protocolo, é preciso ter extremo cuidado ao trabalhar com partículas lentivirais e perfurocortantes.

1. Preparação de células HEK293T para transfecção

NOTA: Execute estas etapas em um gabinete de segurança biológica de cultura de tecidos estéril.

  1. Prepare o meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (cDMEM) para HEK293T células combinando os 450 mL de DMEM com 10% (v / v) de soro fetal de bezerro (50 mL) e uma concentração final de 100 U / mL de penicilina / estreptomicina.
  2. Descongele HEK293T células pelo menos 1 semana antes da transfecção planejada. Mantenha condições saudáveis de crescimento e passe a cada 2-3 dias usando tripsina + EDTA para separar as células do frasco.
  3. Um dia antes da transfecção, aspire cuidadosamente o meio de crescimento das células e lave suavemente as células com DPBS estéril. Adicione 1-5 ml de tripsina ao balão e incube a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante 2-5 min.
  4. Adicione 5-10 mL de cDMEM e gire as células a 350 x g por 5 min. Remova o líquido e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de cDMEM. Contar as células e semear 10-11 x 106 células HEK293T viáveis por balão T175 em 20 ml de cDMEM.
  5. Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% durante a noite para permitir que as células HEK293T atinjam 70%-80% de confluência.
  6. No dia seguinte, confirme a confluência das células sob um microscópio óptico.
  7. Remover o meio do balão com uma faixa serológica de 25 ml sem perturbar a monocamada celular.
  8. Adicione suavemente 10 mL de DPBS e balance a placa para lavar as células, tomando cuidado para não perturbar a monocamada celular.
  9. Remova a SPBD com uma faixa sorológica de 25 mL.
  10. Adicionar 15 ml de novo cDMEM na parede por balão T175 para não perturbar a monocamada celular e voltar a colocar a placa na incubadora a 37 °C.

2. Transfecção de células HEK293T usando reagente de transfecção lipídica não lipossomal

  1. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, prepare os componentes lentivirais: 2 μg de plasmídeo lentiviral, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) e 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) com tampão EC (kit de reagentes de transfecção) para um volume final de 600 μL.
  2. Adicione 36 μL de solução intensificadora. Misture os componentes usando uma pipeta de 1 mL, sugando repetidamente uma parte do líquido e colocando-a de volta gota a gota diretamente sobre a solução restante. Deixe por 5 min em temperatura ambiente (RT).
  3. Adicione 120 μL de reagente de transfecção e misture como acima aproximadamente 20 vezes. Incubar por 10 min em RT.
  4. Adicione 5,2 ml de cDMEM e misture como acima com uma faixa serológica de 5 ml.
  5. Usando uma pipeta de transferência descartável, adicione a mistura de transfecção gota a gota diretamente na monocamada de células HEK293T (evitando as paredes do frasco), espalhando a mistura em diferentes pontos do frasco.
  6. Distribuir o plasmídeo agitando suavemente o balão de um lado para o outro. Evite colocar qualquer líquido na tampa do frasco.
  7. Incubar o balão a 37 °C numa estufa de CO2 a 5 % durante 48 h. Confirme a transfecção efetiva de células HEK293T pelo aparecimento de um marcador fluorescente, aqui GFP, dentro de 24 h após a transfecção monitorada sob um microscópio fluorescente de imagem celular.
    NOTA: Para construções sem o marcador fluorescente, HEK293T células devem ser testadas quanto à presença do gene marcador usado ou por alteração de expressão no gene / proteína de interesse por técnicas apropriadas, por exemplo, qPCR. Alternativamente, a transfecção bem-sucedida pode ser verificada indiretamente durante o teste da coleção de lentivírus em células Jurkat nos estágios posteriores do protocolo pelas técnicas acima.
    CUIDADO: As células HEK293T transfectadas são consideradas infecciosas e as devidas precauções de segurança devem ser implementadas ao manusear essas células. As regras locais devem ser seguidas, o que normalmente pode incluir trabalhar sob um gabinete de segurança de biologia de categoria II, o uso de luvas duplas e solução de descontaminação apropriada para desinfecção, por exemplo, aumento da concentração de alvejante residual (2.000 ppm) ou solução equivalente de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Todas as soluções e plásticos que entram em contato com a preparação de lentivírus devem ser desinfetados de acordo com os procedimentos institucionais de biossegurança.

3. Coleta de partículas lentivirais

  1. Prepare uma solução de descontaminação, uma solução de alvejante (hipoclorito de sódio) de alta concentração (2.000 ppm) ou agente equivalente de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança em um balde e coloque-o no gabinete de segurança biológica.
  2. Prepare o gabinete de segurança de biologia removendo quaisquer itens em excesso, como racks de tubos vazios, etc.
  3. Pré-rotule um tubo de centrífuga de 50 mL por frasco de células de HEK293T T175 e remova a tampa do tubo de centrífuga. Coloque os tubos em um rack estável.
  4. Retirar o balão da incubadora e confirmar a expressão de GFP utilizando um microscópio fluorescente com um laser de 488 nm (figura 1A). A intensidade do sinal depende da eficiência de transfecção do procedimento e dos construtos utilizados.
  5. Colete o meio das células no tubo de centrífuga pré-rotulado de 50 mL. Inclinar o balão de HEK293T T175 com células transfectadas para que o meio se acumule no canto inferior do balão. Usando uma faixa sorológica de 25 mL, colete o meio sem perturbar a monocamada celular. Algumas células flutuantes podem ser visíveis neste ponto. Transfira o meio para um tubo de centrifugação limpo de 50 mL e feche a tampa.
    1. Utilizando uma faixa serológica de 25 ml, adicionar 25 ml de cDMEM fresco e quente ao balão. Certifique-se de direcionar o fluxo do meio nas paredes do frasco para não perturbar a monocamada da célula. Retorne o frasco com células de HEK293T transfectadas para a incubadora (37 °C, 5% CO2).
      NOTA: Uma segunda coleta de lentivírus e purificação adicional podem ser realizadas após 24 horas adicionais após o procedimento descrito nas etapas acima.
  6. Quando a coleta de lentivírus for concluída após 24 h ou 48 h, adicione solução de descontaminação às células, garantindo que ela cubra a monocamada celular. Manter o balão na horizontal durante as 24 horas seguintes e, em seguida, eliminá-lo de acordo com os regulamentos adequados da categoria II.

4. Purificação do lentivírus

  1. Filtre o meio coletor da etapa 3.5.
    1. Remova o êmbolo da seringa de 50 mL e insira um filtro estéril de poliéter sulfona ou fluoreto de polivinilideno de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm na extremidade da seringa. Utilizando uma tira serológica de 25 ml, adicionar o meio recolhido do passo 3.5.1 à seringa e voltar a colocar suavemente o êmbolo.
    2. Empurre o plugue lentamente para passar o meio através do filtro para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Se o fluxo reduzir significativamente, posicione a seringa com o filtro apontando para cima e puxe o êmbolo o suficiente para retirar o meio do filtro.
    3. Com cuidado, substitua o filtro da seringa por um novo e descarte o filtro usado na solução de descontaminação. Continue a filtração média. Quando terminar, descontamine o filtro e a seringa submergindo o filtro e enchendo a seringa com a solução de descontaminação.
  2. Pré-resfrie a ultracentrífuga ajustando a temperatura para 4 °C e feche a tampa para permitir que a temperatura se aclimate.
  3. Adicione 3 mL de solução de sacarose a 20% (20% p / v em água ultrapura, filtro esterilizado com um filtro de 0,22 μm) no fundo do tubo cônico da ultracentrífuga.
  4. Usando uma faixa sorológica de 25 mL, sobreponha o meio filtrado sobre a camada de sacarose, tomando cuidado para não perturbar as camadas.
    1. Use a configuração de velocidade mais baixa no pipeta. Incline o tubo cônico da ultracentrífuga para cerca de 45 ° e adicione lentamente o meio contendo lentivírus filtrado da etapa 4.1 à parede do tubo. Certifique-se de que o meio e a sacarose não se misturem e que a separação clara das camadas seja visível (Figura 1B). À medida que o volume da camada média aumenta, incline lentamente o tubo da ultracentrífuga de volta para a posição vertical.
  5. Se o volume total, incluindo a sacarose e o meio, no tubo de ultracentrífuga for inferior a 29 mL, complete com cDMEM fresco para evitar que o tubo entre em colapso durante a centrifugação. Para várias coletas de T175 mL, misture preparações de meio filtrado e use vários tubos de ultracentrífuga. Complete o tubo de ultracentrífuga final com o meio, conforme necessário.
  6. Certifique-se de que os baldes da ultracentrífuga estejam limpos; Não há resíduo médio no fundo do balde ou nas tampas. Se necessário, limpe com álcool ~ 70%. Coloque os adaptadores de tubo apropriados no fundo de cada balde (Figura 1C) e abaixe suavemente os tubos da ultracentrífuga nos baldes.
  7. Feche os baldes com segurança e pendure-os nos espaços alocados no rotor giratório.
  8. Certifique-se de que os baldes estejam equilibrados com os mesmos volumes de sacarose e meio. Um rotor giratório nunca deve funcionar sem caçambas, embora as caçambas opostas possam ser deixadas vazias20 (Figura 1D).
  9. Insira cuidadosamente o rotor na ultracentrífuga e ligue o vácuo. Defina a taxa de aceleração e desaceleração da ultracentrífuga para a configuração mais baixa e execute as preparações de lentivírus a 85.000 x g por 90 min a 4 ° C.
  10. Aguarde até que a ultracentrífuga atinja a velocidade necessária (cerca de 3-5 min) antes de se afastar para garantir que o rotor seja inserido corretamente e que a centrifugação não termine.
  11. Enquanto a ultracentrífuga estiver funcionando, limpe o espaço de trabalho de acordo com os requisitos de segurança da categoria II e prepare o espaço para as próximas etapas.
  12. Quando a centrifugação terminar, desative o vácuo e remova cuidadosamente o rotor para não perturbar as amostras.
  13. Investigue a ultracentrífuga em busca de derramamentos e confirme se não há vazamentos dos baldes. Em caso de derramamento, use luva dupla e descontamine a centrífuga e a superfície externa dos baldes com produtos antivirais.
  14. Remova os baldes da ultracentrífuga e transporte-os cuidadosamente para a cabine de segurança biológica da categoria II.
    NOTA: As partículas de lentivírus se acumulam na parte inferior do tubo da ultracentrífuga. O pellet não é visível a olho nu.
  15. Despeje a sacarose e o meio com um movimento suave diretamente no recipiente de resíduos com a solução de descontaminação.
  16. Mantendo o tubo de ultracentrífuga invertido, transfira-o para a dupla camada de tecido e deixe secar por 10 min. Enquanto isso, limpe o interior dos baldes com lenços de papel embebidos em água e seque ao ar de cabeça para baixo.
  17. Seque cuidadosamente qualquer líquido restante da borda do tubo de ultracentrífuga com lenço de papel antes de girá-lo na vertical. Desinfete o tecido e a superfície por baixo.
  18. Ressuspenda o pellet de vírus em 1 mL de meio ou solução sem soro necessária para experimentação adicional, pipetando suavemente a solução para cima e para baixo. Deixe por 15 min no RT dentro do gabinete de segurança de biologia categoria II.
  19. Misture delicadamente as preparações de lentivírus usando 1 mL de pipeta antes de aliquotar em tubos de rosca de 1,5 mL (por exemplo, criotubos). Preparar as alíquotas para o trabalho in vivo (multiplicidade de 100 μL) e para o título de lentivírus em células T Jurkat (1 x 20 μL) (ver passo 5).
  20. Evite ciclos de congelamento e descongelamento; as preparações lentivirais podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses sem efeito negativo na infectividade.

5. Titulação da produção de lentivírus em células T Jurkat

  1. Prepare o meio completo do Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) para células T Jurkat suplementando 500 mL de RPMI-1640 com 10% (v / v) de soro fetal de bezerro e concentração final de 100 U / mL de penicilina / estreptomicina.
  2. Para garantir uma cultura saudável de células T Jurkat, mantenha as células em cultura por até 1 semana antes da infecção.
  3. No dia da titulação do lentivírus, coloque as células T Jurkat viáveis em uma placa de 24 poços a 2 x 105 células/poço em 200 μL por poço de cRPMI-1640.
  4. Use lentivírus recém-coletado ou descongele o frasco para lentivírus contendo 20 μL em gelo e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo.
  5. Usando diluição serial em cRPMI-1640, infecte células T Jurkat com 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL e 10 μL de estoque de lentivírus. Balance suavemente a placa para garantir a distribuição igual do lentivírus. As células T Jurkat não infectadas servem como um controle negativo.
  6. Incubar a placa a 37 °C. Após 4 h, complete cada poço com cRPMI até um volume total de 400 μL. Retorne a placa para a incubadora a 37 ° C por 3 dias.
  7. Após 48 h após a infecção, confirme a expressão de GFP em um sistema de imagem fluorescente.
  8. 3 dias após a infecção, colete cada poço da placa de 24 poços em tubos de coleta separados de 1,5 mL e centrifugue as células a 350 x g a 4 ° C por 5 min.
  9. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) preparado a 2% (p / v) em DPBS e deixe-o por 15 min em gelo no escuro.
  10. Centrifugue as células a 350 x g a 4 °C durante 5 min e ressuspenda o pellet em tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (DPBS estéril + 4% FCS + EDTA estéril 1 mM).
  11. Analise a frequência de expressão de GFP e a intensidade fluorescente média do lentivírus infectado e suas células de controle usando citometria de fluxo (Figura 2).

6. Infecção por lentivírus in vivo de macrófagos peritoneais residentes no tecido

  1. Em uma cabine de segurança biológica de categoria II, carregue as agulhas de insulina com um volume total de 200 μL de meio sem soro contendo a quantidade necessária de lentivírus (use agulhas descartáveis, 30 G para bem-estar animal e para evitar perda de fluido na agulha).
  2. Coloque a bainha da agulha de volta na agulha usando a técnica de colher com uma mão. Mantenha a agulha no gelo e injete em 30 minutos.
  3. Na instalação animal, instale uma cabine de segurança biológica de categoria II antes das injeções (Figura 1E).
    1. Coloque uma folha de lenço de papel limpo. Afrouxe a bainha da agulha de insulina contendo lentivírus.
    2. Prepare uma placa de Petri contendo pequenos pedaços de tecido e desinfetante à base de gluconato de clorexidina, um tubo de 50 mL contendo solução de descontaminação (2.000 ppm de solução de alvejante) e um recipiente seguro e afiado.
  4. Contenha o mouse segurando a pele na nuca21. O mouse devidamente contido é imóvel, e isso é necessário para a segurança.
  5. Com o abdômen voltado para cima, aponte a cabeça do animal ligeiramente para baixo. Injete o lentivírus por via intraperitoneal no quadrante inferior direito da cavidade abdominal. Isso é para evitar a injeção em qualquer órgão da cavidade peritoneal.
  6. Antes de soltar o mouse, encha a seringa com solução de descontaminação e descarte-a com segurança no cofre afiado.
  7. Limpe o local da injeção no abdômen do camundongo com lenço de papel embebido em desinfetante e devolva o animal à gaiola.
  8. Alojar o camundongo injetado com lentivírus em gaiolas de categoria II ou ventiladas individualmente (IVC) (gaiolas isoladas com filtragem de ar de alta eficiência) por um período mínimo de 72 h após a injeção. Coloque um cartão de informações apropriado na frente da gaiola.
  9. Mova o mouse para a nova gaiola de retenção da categoria I após 72 h após a infecção, dependendo das aprovações de segurança locais. Monitore os camundongos diariamente por um total de 3 dias a partir da injeção.

7. Coleta de células peritoneais de camundongo infectado com lentivírus

CUIDADO: Para coletas dentro de 72 h após a injeção de lentivírus, siga as regras institucionais de segurança biológica da categoria II. A cama e a gaiola de armazenamento onde os animais infectados foram mantidos nas primeiras 72 horas após a injeção de lentivírus devem ser descontaminadas de acordo com as regras institucionais de segurança biológica da categoria II.

  1. Eutanásia de camundongos seguindo os regulamentos institucionais, por exemplo, por inalação de concentração crescente de CO2, seguida de confirmação de morte por luxação cervical.
  2. Limpe o abdômen do camundongo com isopropanol a 70% e corte cuidadosamente a pele para expor a membrana da cavidade peritoneal.
  3. Lave a cavidade peritoneal com 6 mL de tampão FACS gelado usando uma seringa de 10 mL e agulha de 23 G. Evite perfurar quaisquer órgãos.
  4. Massageie suavemente o peritônio para desalojar as células para o tampão FACS.
  5. Colete o fluido peritoneal usando a mesma seringa e agulha.
  6. Remova a agulha e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
  7. Mantenha as lavagens peritoneais no gelo.
  8. Colete outros órgãos necessários e armazene-os conforme apropriado para o estudo.
  9. Descarte as carcaças de animais de acordo com as diretrizes locais de segurança e animais.

8. Coloração e análise de células peritoneais

  1. Centrifugar a lavagem peritoneal a 350 x g a 4 °C durante 5 min, rejeitar o sobrenadante na solução de descontaminação e ressuspender as células em 1 ml de tampão FACS.
  2. Conte as células coletadas e coloque 4 x 105 células por poço em uma placa de 96 poços com fundo em V.
  3. Realize a coloração de viabilidade usando um reagente corrigível (por exemplo, Kit de coloração de células mortas de infravermelho próximo corrigível usado aqui) de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Se as células foram infectadas nas últimas 72 h, fixe as células em PFA a 2% por 15 min no gelo. Adicione um volume igual de DPBS frio e centrifugue novamente a 350 x g a 4 °C por 5 min.
  5. Prepare o tampão de bloqueio: Misture 4 μg / mL de anticorpo 2.4G2 em soro de rato a 10% (v / v) em tampão FACS para coloração de superfície ou tampão de permeabilização para coloração intracelular.
  6. Ressuspender cada alvéolo contendo sedimento celular em 50 μL de tampão de bloqueio e incubar a 4 °C durante 15 min.
  7. Prepare a mistura de anticorpos em 50 μL de tampão FACS (para coloração superficial) ou tampão de permeabilização (para coloração intracelular) para cada amostra. O volume final de coloração para cada amostra será de 100 μL, incluindo 50 μL de tampão de bloqueio. Calcule as concentrações de anticorpos em conformidade (Tabela 1).
  8. Adicione 50 μL de mistura de anticorpos às amostras e 50 μL de controles de isotipo e tampão de controle às amostras de controle. Incube as amostras por 30 min no gelo no escuro. Inclua células não coradas e controles de isotipo, conforme necessário.
  9. Lave cada poço com 100-200 μL de DPBS gelado e centrifugue a placa a 350 x g a 4 °C por 5 min. Repita esta etapa para remover quaisquer anticorpos não ligados. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.

9. Extração de células de órgãos

  1. Prepare 1 mL de mistura de digestão por órgão: Misture a solução salina balanceada de Hank (HBSS), 2 mg / mL de colagenase tipo IV e 0,03 mg / mL de DNase I (inclua 1,5 mg / mL de hialuronidase para digestão pulmonar).
  2. Transfira o órgão coletado para 1 mL de mistura de digestão e pique com uma tesoura.
  3. Filtrar as células através de um filtro de 40 μm e centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
  4. Se isolar células do pulmão, baço ou fígado, lise os glóbulos vermelhos usando tampão de lise ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA pH = 7.4). Filtrar as células através de um filtro de 40 μm e centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
  5. Pinte e analise as células conforme descrito na seção 8.

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Resultados

Quando seguido completa e corretamente, este protocolo produz um total de 1,5 mL de estoque de lentivírus de alta qualidade por preparação única, suficiente para doze injeções in vivo no volume ideal determinado neste estudo18. O sucesso da transfecção pode ser avaliado no início do protocolo. Células HEK293T saudáveis e confluentes devem exibir, se presentes nos plasmídeos, um sinal marcador facilmente detectável (por exemplo, GFP usado neste estudo) após 48 h após a transfecção do plasm...

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Discussão

Os macrófagos residentes no tecido desempenham uma variedade de funções homeostáticas e inflamatórias específicas do tecido 1,2 ditadas por seu ambiente fisiológico 6,7,8,9. Neste protocolo, um método eficaz18 para manipulação de macrófagos residentes peritoneais in vivo...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada, no todo ou em parte, pelo Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. PRT também é apoiado pelo Instituto de Pesquisa de Demência do Reino Unido. O M.A.C é apoiado pela Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship (BB/T009543/1). Para fins de Acesso Aberto, o autor aplicou uma licença de direitos autorais públicos CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. L.C.D é professor na Universidade de Swansea e pesquisador honorário da Universidade de Cardiff. Este trabalho é apoiado pelo trabalho realizado por Ipseiz et al. 202018.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina-EDTA (1x) (Tripsina 500 mg/L ou 0,02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0,22 μ m filtro estéril millex GPMerckSLGS033SS
0,45 μ m filtro estéril millex GPMerckSLHP033RS
seringa de insulina U-100 de 0,5 mL com agulha, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)BD324892
recipiente para objetos cortantes de 1 litroN/AN/A
2.4G2 anticorpo (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μ filtroThermo Fisher Scientific22363547
meio AimV (grau de pesquisa), Suplemento AlbuMaxThermo Fisher Scientific31035025
Tampão de bloqueiopreparado em casa
Meio tioglicolato de cervejaSigma-AldrichB2551Solução estoque a 4% preparada em água, autoclavada e mantida congelada.
CD11bBiolegend101222Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11bBD550993Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11cBiolegend117317Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD11cBiolegend117333Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD19BD560375Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD19Biolegend152410Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD226Biolegend128808Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD3eBD560527 Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD3eBiolegend152313Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD4Biolegend100412Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD73eBioscience16-0731-82Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
CD8aeBioscience48-0081-82Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Frasco de cultura de células (frasco T175, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Tubos de centrífuga, tubos de fundo cônico 25 mm x 89 mmCentrífugas Beckman Coulter358126
CentrífugaUltracentrífuga Beckman Coultere centrífuga TC
Colagenase tipo IVSigma-AldrichC5138
(15 mL e 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CriotubosGreiner Bio One123277ou criotubos
DMEM médio (1x) + 4,5g/L D-glicose, 400 µ M L-glutaminaThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Reagente de transfecção EffecteneQiagen301425
F4/80Biolegend123123Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
F4/80Biolegend123133Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
F4/80Biolegend123147Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
FceR1eBioscience48-5898-80Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Soro fetal de bezerro (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106inativado por calor por 30 min a 56 &graus; C e estéril filtrado através de 0,22 μ filtro m
Citômetro de fluxoThermo Fisher Scientific  Tampão de citometria de fluxo Attune NxT
(FACS)preparado internamente
Microscópio fluorescente de cultura de tecidosThermo Fisher ScientificEVOS FL
FórcepsN/AN/A Preferênciado usuário
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
Linhacelular HEK293Tcultivado por pelo menos uma semana antes da transfecção. Antígeno central do HIV-1 livre de micoplasma
Beckman Coulter6604667
HialuronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex esfoliante cirúrgico, gluconato de clorexida 4% p/v limpador de peleEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
ICAM1Becton Dickinson554970Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
linhacultivada por pelo menos uma semana antes do uso. Kit de coloração de
células mortas de infravermelho próximo corrigível VIVO/MORTOThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Os camundongosaqui usaram fêmeas C57BL/6, com idade entre 8 e 12 semanas (Charles Rivers), a menos que especificado de forma diferente
Pipetas microcapilares (faixa de volume 0,5-1.000 μ L)Fisher Científico & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148-500Gpreparado a 2% p/v em PBS
pCMV-Δ Plasmídeo de embalagem R8.91Zuffrey, R., et al. 1997 Resistência à ampicilina.
Penicilina/Estreptomicina (100x, 10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
placa de PetriGreiner Bio One664160
plasmídeo pHR'SIN-cPPT-SEWRosas, M. et al. 2014 Codifica o marcador EGFP a jusante do promotor SFFV e a montante do intensificador do vírus hepatitivo Woodchuck. Resistência à ampicilina.
O plasmídeoNaldini, L. et al. 1996codifica o envelope da glicoproteína g do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Resistência à ampicilina.
Controle de isotipo IgG1 de rato, κBecton Dickinson550617Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração Soro
de ratoSigma-AldrichR9759-10ML
Tampão de lise ACK de sangue vermelhopreparado em casa
Meio RPMI 1640 (1x) + 400 uM L-glutaminaThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinaSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
Comprimidos de hipoclorito de sódio (alvejante, 2.000 ppm)Guest MedicalH8818
Placa de cultura de células estéril de 24 poçosGreiner Bio One662160
PBS estéril de Dulbecco (DPBS) (1x) Mg++ e Ca2+ - grátisThermo Fisher Scientific14190144
EDTA estérilThermo Fisher Scientific15575020
Pipetas de transferência descartáveis VWR estéreis (23,0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SacaroseThermo Fisher Scientific15503022
tesouras cirúrgicasN/AN/APreferência do utilizador
Seringas (50 mL e 1 0 mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração
placa de cultura de células de 96 poços com fundo em UGreiner Bio One650180
Tubos de centrífuga cônicos da celular Jurkat T livre de micoplasma codifica a proteína Gag-Pol HIV impulsionada pelo promotor do citomegalovírus. modificado para estudos de expressão de shRNA e miR. pMD2.G da

Referências

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