Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Resumo

A visualização de organelas autofágicas em nível ultraestrutural por microscopia eletrônica (ME) é essencial para estabelecer sua identidade e revelar detalhes importantes para a compreensão do processo autofágico. No entanto, os métodos de EM frequentemente carecem de informações moleculares, obstruindo a correlação das informações ultraestruturais obtidas por EM com a localização baseada em microscopia de fluorescência de proteínas específicas de autofagia. Além disso, a raridade dos autofagossomos em condições celulares inalteradas dificulta a investigação por ME, que requer alta magnificação e, portanto, fornece um campo de visão limitado.

Em resposta a ambos os desafios, um método de microscopia óptica-eletrônica correlativa (CLEM) baseado em marcação fluorescente foi aplicado para correlacionar um marcador autofagossomal comum, LC3, à ultraestrutura EM. O método foi usado para selecionar rapidamente células em microscopia de fluorescência para marcação de LC3 em combinação com outros marcadores relevantes. Posteriormente, as características ultraestruturais subjacentes de pontos marcados com LC3 selecionados foram identificadas pelo CLEM. O método foi aplicado em células carentes sem adição de inibidores da acidificação lisossômica.

Nessas condições, a CL3 foi encontrada predominantemente em autofagossomos e raramente em autolisossomos, nos quais a CL3 é rapidamente degradada. Esses dados mostram a viabilidade e a sensibilidade dessa abordagem, demonstrando que o CLEM pode ser usado para fornecer informações ultraestruturais sobre a autofagia mediada por LC3 em condições nativas - sem tratamentos medicamentosos ou alterações genéticas. Em geral, este método apresenta uma ferramenta valiosa para estudos de localização ultraestrutural de proteínas de autofagia e outros antígenos escassos através da ponte entre a microscopia de luz e os dados de EM.

Introdução

A autofagia é um processo chave para a depuração e reciclagem de proteínas citoplasmáticas e organelas. O processo de macro-autofagia (doravante denominado autofagia) envolve a formação de organelas de membrana dupla, autofagossomos, que permite às células envolver moléculas citoplasmáticas e organelas para degradação lisossômica. A autofagia ocorre em nível basal na maioria das células e é regulada para cima em resposta a condições celulares, como fome ou estresse celular. A autofagia ocorre de maneira específica do substrato, visando estruturas ou proteínas específicas para degradação, ou como um processo não seletivo em massa abrangendo partes do citosol. Na autofagia seletiva, os autofagossomos são formados pela conjugação de proteínas da família Atg8 (proteínas associadas a microtúbulos 1A/B cadeia leve 3A/B/C [LC3] e GABARAPs) a membranas derivadas da reciclagem de endossomos, o Golgi e/ou retículo endoplasmático (RE)¹. A LC3 reconhece a carga autofágica no citosol diretamente ou através de adaptadores de autofagia seletiva como P62/SQSTM. Novas membranas autofágicas podem então ser conjugadas à LC3, expandir-se e fundir-se para formar uma membrana dupla completa envolvendo a carga - chamada de autofagossomo. O autofagossomo amadurece e eventualmente se funde com um endossomo ou lisossomo, após o qual a carga autofágica e os adaptadores são degradados².

Estudos sobre formação, maturação e fusão de autofagossomos frequentemente fazem uso de tecnologias de microscopia de luz. A microscopia de fluorescência da CL3 é geralmente usada para avaliar o número e a localização celular de autofagossomos sob diferentes condições. Além disso, acoplando LC3 a GFP sensível ao pH e RFP estável ao pH em uma sonda chamada tandem, o fluxo global de autofagia pode ser medido em células vivas em função da perda de fluorescência da GFP³. Essas abordagens são ferramentas valiosas para os pesquisadores entenderem o papel e o mecanismo da autofagia sob diferentes condições. Outra ferramenta valiosa é a microscopia eletrônica (ME), que revela a ultraestrutura de organelas autofágicas em diferentes estágios da autofagia4,5,6,7,8. Até o momento, o EM ainda é o método de escolha para identificar os estágios precisos da formação do autofagossomo, discriminando diferentes membranas autofágicas por morfologia: fagóforo (membrana dupla não totalmente fechada), autofagossomo (membrana dupla fechada ao redor da carga citosólica) e autolisossomo (perda [parcial] da membrana autofágica interna). A morfologia sem informação molecular, no entanto, pode ser propensa a erros de identificação ou ambiguidade. Immuno-EM é o método mais abrangente para caracterização molecular simultânea e classificação morfológica de organelas autofágicas. Por exemplo, a marcação imunogold de CL3 em criossecções descongeladas permite a localização ultraestrutural de CL3 e a identificação precisa de organelas marcadas com CL39^.

Uma desvantagem do EM é o pequeno campo de visão que vem com a alta ampliação necessária para observar a fina ultraestrutura das membranas autofágicas e, no caso do imuno-EM, localizar o rótulo que marca a proteína de interesse. Devido à sua escassez e baixos níveis de proteínas, isso geralmente dificulta a análise quantitativa de EM de autofagossomos. Para aumentar o número de autofagossomos, as células são frequentemente esfomeadas e tratadas com Bafilomicina A1 (BafA1), um inibidor da acidificação e degradação lisossomal. Sem o tratamento com BafA1, a pesquisa de autofagossomos pela EM é demorada, devido à escassez dessas organelas. O método apresentado neste manuscrito aborda essa questão por meio de marcação fluorescente e obtenção de imagens de CL3 endógena em criosecções descongeladas em microscópio de fluorescência antes de preparação adicional para ME. As imagens fluorescentes então orientam a busca por estruturas marcadas com LC3 no ME. Após a coleta, as imagens EM são correlacionadas com as imagens de fluorescência para adicionar informações moleculares – a presença de LC3 – à ultraestrutura da célula. Este método "on-section CLEM" aumenta consideravelmente a capacidade de encontrar estruturas marcadas com LC3, especialmente em condições não tratadas, para posterior identificação e classificação por EM.

Este método foi aplicado em células HEPG2¹⁰ derivadas do hepatoblastoma para encontrar autofagossomos em condições inalteradas (ou seja, nenhum BafA1 foi usado). Relativamente poucos pontos fluorescentes (menos de um por perfil celular em um corte de 90 nm) foram encontrados, o que está de acordo com o alto turnover da CL3¹¹. Essa esparsidade da CL3-puncta enfatizou o valor do CLEM; ao selecionar regiões com vários pontos fluorescentes para obtenção de imagens no ME, organelas CL3-positivas foram encontradas e caracterizadas de maneira muito mais eficaz do que através do imuno-ME convencional. Isso revelou que a maioria das organelas positivas para LC3 eram autofagossomos, como definido por sua morfologia, o que contrasta com os resultados obtidos em células tratadas com BafA1, onde os autolisossomos são mais^comuns9. Esses dados mostram que, com o CLEM em secção, a autofagia pode ser estudada em nível ultraestrutural sem a necessidade de inibir o fluxo autofágico.

Protocolo

1. Preparação de ferramentas e reagentes

Observação : para reagentes, buffers e soluções necessárias, consulte Arquivo suplementar 1 ou ¹² para obter mais informações. Para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo, consulte a Tabela de Materiais.

1. Fixador
   1. Prepare tampão fosfato 0,2 M (PB) ou 0,2 M PIPES, HEPES, EGTA, MgSO₄ (PHEM) buffer, conforme descrito no Arquivo Suplementar 1, para usar como base para soluções fixadoras.
      NOTA: Os fixadores são rotineiramente tampolados em tampão 0,1 M PB ou PHEM para tamponar contra a acidificação causada pela reação de aldeído com o material biológico.
   2. Como a qualidade do paraformaldeído (PFA) é fundamental para a fixação confiável da ultraestrutura das amostras, use PFA grau EM. Para seguir este protocolo, use soluções estoque de 16%, preparadas a partir de prills PFA de alta qualidade (consulte o Arquivo Suplementar 1).
      CUIDADO: O paraformaldeído é um produto químico perigoso (advertências de perigo H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Ao trabalhar com PFA, use equipamentos de proteção (luvas, jaleco e óculos de proteção) e trabalhe com capuz químico. Os resíduos que contêm PFA devem ser coletados e descartados de acordo com as diretrizes e regulamentos dos institutos.
   3. Combinar 10 mL de 0,2 M PB, 5 mL de PFA a 16% (em água desmineralizada [dH 2 O]) e 5 mLde dH₂O para preparar uma solução fixadora de PFA a 4%.
   4. Opcional: A adição de glutaraldeído (GA) a 0,02%-0,5% à solução fixadora a partir do passo 1.1.3 melhora a preservação da ultraestrutura, mas reduz a antigenicidade da amostra em direção a muitos anticorpos.
      NOTA: Quando a fixação de GA é desejada, use GA de grau EM de um fornecedor adequado.
      CUIDADO: O glutaraldeído é um produto químico perigoso (advertências de perigo H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Trabalhe com capuz químico e use equipamentos de proteção (luvas, jaleco e óculos de proteção) ao manipular AG. Os resíduos contendo AG devem ser coletados e descartados de acordo com as diretrizes e regulamentos dos institutos.
2. Ferramentas e materiais
   1. Risque a superfície dos pinos do porta-amostras de alumínio e sonice-os em etanol 3 x 10 min para remover restos de metal e garantir a aderência ideal quando blocos de células embutidos em gelatina são montados nos pinos.
   2. Use um recipiente de armazenamento adequado para armazenar os pinos do porta-amostras de alumínio com suas amostras em nitrogênio líquido (LN₂).
   3. Faça um manipulador fixando um único cabelo ou cílio na extremidade de um espeto de madeira usando esmalte.
   4. Faça um loop de captação. Dobre um fio de aço inoxidável de 0,3 mm de espessura em torno de uma barra redonda de 3 mm de diâmetro e torça as extremidades juntas, formando um laço em uma extremidade. Insira as extremidades torcidas em uma ponta de pipeta. Insira um espeto de madeira da outra extremidade e afixe com cola ou resina.
      NOTA: Um loop de coleta também está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
   5. Para preparar os laços de secagem em grade, siga os mesmos passos para fazer loops de captação: forme um fio de aço inoxidável em um laço de 4 mm e fixe em uma ponta de pipeta grande com cola ou resina.
   6. Revestir as grades usando uma fina película de suporte como formvar (protocolo no Arquivo Suplementar 1). Antes de usar, cubra as grades com uma fina camada de carbono.
      NOTA: As grelhas prontas a utilizar estão comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de Materiais). As grades revestidas com formvar podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente (TR); As grades revestidas de carbono podem ser armazenadas por vários meses na RT.
   7. Prepare corrediças de vidro limpas e grandes lamínulas (24 mm x 24 mm é ideal com lâminas de vidro de 25 mm de largura), como em ¹³.

2. Fixação e preparação da amostra

1. Fixação
   1. Utilizar o fixador preparado no passo 1.1.3 (PFA a 4% em PB 0,1 M). Para linhagens celulares aderentes, cultura de 1-5 × 10 6 células em placas de⁶ cm. Adicionar o fixador ao meio de cultura na proporção de 1:1 e incubar a amostra por 5 min em TR. Em seguida, substitua a mistura médio-fixadora apenas por fixador e incube por 2 h no TR.
      NOTA: As contagens exatas de células, confluência e condições de cultura podem variar de acordo com o sistema de modelo usado.
   2. Armazenar as amostras durante a noite ou até 3-4 semanas em PFA 0,5% em 0,1 M PB a 4 °C.
      NOTA: O GA pode ser adicionado à fixação (ver passo 1.1.4) e o comprimento de fixação pode ser alterado para encontrar um equilíbrio ideal entre a preservação da morfologia e antigenicidade, que difere por espécime e marcação. Para obter mais informações, consulte¹⁴.
2. Incorporação de amostra
   1. Lave o prato com células fixas 3x com PBS na RT. Em seguida, substituir por PBS contendo glicina a 0,15% e incubar por 10 min no TR.
   2. Substitua o PBS contendo glicina a 0,15% por gelatina a 1% em PBS pré-aquecido a 37 °C e raspe e transfira as células em gelatina a 1% para um tubo de microcentrífuga. Pellet as células a 6.000 × g por 1 min em RT em uma microcentrífuga. Em seguida, retire a gelatina a 1% sem perturbar o pellet e adicione a 12% de gelatina aquecida a 37 °C. Ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo com pontas de pipeta ou pipetas de vidro Pasteur pré-aquecidas a 37 °C.
   3. Incubar a 37 °C durante 10 min; Em seguida, pastilha as células a 6.000 × g por 1 min. Solidifique a gelatina no gelo por 30 min.
   4. Para remover as células embutidas em gelatina do tubo, corte a extremidade do tubo que contém o pellet do resto do tubo com uma lâmina de barbear. Em seguida, perpendicularmente ao primeiro corte, corte a extremidade do tubo com o pellet de célula ao meio.
   5. Incubar as duas metades da extremidade do tubo contendo a pastilha de células emblocadas em gelatina em sacarose 2,3 M durante 10 min a 4 °C. Isso faz com que as metades do pellet de células embutidas em gelatina encolhem ligeiramente e se desloquem do tubo de plástico.
      NOTA: Os pellets de células embebidos em gelatina devem ser mantidos a 4 °C ou gelados tanto quanto possível para evitar que a sacarose 2,3 M se torne demasiado viscosa e a gelatina demasiado macia. Durante a manipulação dos pellets de células embutidas em gelatina nas próximas etapas, trabalhe com apenas uma amostra de cada vez e mantenha as outras no gelo, ou trabalhe em uma sala fria (~4 °C). Evite o superaquecimento dos pellets de células embutidas em gelatina pela luz solar, lâmpadas quentes do microscópio ou outras fontes de calor.
   6. Remova as metades do tubo com o pellet de célula embebido em gelatina da sacarose de 2,3 M. Em seguida, remova as metades de pastilha de células embutidas em gelatina das metades do tubo de plástico com uma pinça. Corte manualmente o pellet em blocos de tamanho apropriado (~1 mm³) com uma lâmina de barbear. Use um microscópio dissecante estéreo para ampliar o objeto durante o corte.
   7. Infundir os blocos celulares embebidos em gelatina com sacarose 2,3 M por 3-16 h, girando de ponta a ponta em um rotor a 4 °C.
   8. Coloque um bloco de células embebido em gelatina num pino de suporte de amostras de alumínio (ver passo 1.2.1). Deixe sacarose suficiente de 2,3 M ao redor das bordas do bloco para que ele forme um "colarinho" fino entre o bloco e o pino. Evite muita sacarose de 2,3 M cobrindo a parte superior do bloco. Congele e armazene no LN₂.

3. Seccionamento

1. Corte (ver também¹²)
   1. Pegue um pino com um bloco de células embutidas em gelatina fora do armazenamento de LN₂ e coloque-o dentro de um criomirótomo regulado a -80 °C.
   2. Corte a frente do bloco para achatar sua superfície e obter seções de ~250 nm. Mergulhe a alça de 3 mm na solução de captação (1:1 2,3 M de sacarose e 2% de metilcelulose), insira a alça na criocâmara do micrótomo e espere até que o gelo comece a se formar na gota (tipicamente 5-7 s). Em seguida, pegue imediatamente a seção pressionando rapidamente, mas suavemente, a gotícula contra eles. Retire o laço da criocâmara, espere até que a gotícula tenha descongelado completamente e pressione a gota em uma lâmina de vidro.
   3. Verificar a orientação celular pela coloração azul de toluidina dos cortes.
      1. Colocar uma gota de solução de azul de toluidina (ver Ficheiro Suplementar 1) sobre as secções numa lâmina de vidro e secar numa placa de aquecimento a 80 °C até que as bordas da gota estejam secas.
      2. Retire a lâmina de vidro da placa de aquecimento e lave suavemente o azul de toluidina com dH₂O, recolhendo-o num recipiente de resíduos adequado.
      3. Seque a lâmina de vidro e verifique a orientação da célula nas seções através de um microscópio de luz simples de bancada.
   4. Corte os lados do bloco seccionando 50-100 μm na lateral da face do bloco de amostra com o canto da faca. Aparar quatro lados da face do bloco de amostra girando o suporte da amostra 90° depois de aparar cada lado para criar um retângulo saliente de ~250 μm x 375 μm. Selecione a área saliente com base na orientação da célula determinada na etapa anterior.
2. Seccionamento e recolha
   1. Arrefecer o criomicótomo a -100 °C. Separe uma fita do retângulo saliente, sendo as seções de 70-90 nm de espessura e com um brilho prateado-dourado. Guie as secções para longe da ponta da faca de diamante com um fio de cabelo num bastão (ver secção 1.2.3) para criar uma fita longa (2-5 mm).
   2. Depois que uma fita adequada tiver se formado, pare de seccionar para pegar a fita. Mergulhe o ciclo de captação de 3 mm em sacarose 2,3 M e metilcelulose 2% misturada 1:1, insira o laço na criocâmara do micrótomo e espere até que a gotícula comece a congelar (tipicamente 5-7 s). Em seguida, pegue imediatamente as seções pressionando rapidamente, mas suavemente, a gotícula contra elas. Retire o laço da criocâmara, aguarde até que a gotícula tenha descongelado completamente e pressione a gota sobre uma grade preparada (passo 1.2.6).
      NOTA: As grelhas com secções podem ser armazenadas a 4 °C durante vários meses.

4. Marcação e microscopia de luz

1. Rotulagem
   1. Coloque as grades com seções (Figura 1A) do lado de baixo em ~1 mL de PBS em um prato pequeno ou placa de vários poços. Incubar a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: Esta etapa remove a gelatina que está entre as células; A gelatina não é necessária após a secção e interfere com o protocolo restante.
   2. Processe as grades do lado de baixo em ~75 μL de gotículas no parafilme (veja a Figura 1B). Iniciar com PBS + lavagens de glicina a 0,15% (3 x 2 min) em TR. Em seguida, incubar as grades com albumina de soro bovino (BSA)-c a 0,1% + gelatina de pele de peixe (GES) a 0,5% em PBS por 10 min no TR como etapa de bloqueio. Diluir os anticorpos primários em BSA-c a 0,1% + FSG a 0,5% em PBS e incubar as grades em gotículas de ~10 μL dessa solução por 1 h no TR (Figura 1C).
   3. Lave as grades em BSA 0,1% em PBS 5x em RT. Em seguida, diluir os anticorpos secundários e o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 10 μg/mL) em BSA-c a 0,1% + FSG a 0,5% em PBS e incubar as grades em gotículas de ~10 μL dessa solução por 30+ min em TR (Figura 1C). Lave as grades em PBS 5x no RT.
      NOTA: Opcionalmente, um anticorpo secundário pode ser marcado com partículas de ouro coloidal de 5, 10, 15 ou 20 nm conjugadas à proteína A (PAG) para localização da proteína de interesse na EM. Se isso for desejado, incubar as grades com PAG por 20 min no TR após a etapa 4.1.3. Em seguida, lave 5x com PBS na RT. Evite o uso simultâneo de múltiplos anticorpos primários e tome nota da reatividade da PAG às IgGs de diferentes espécies para evitar reações cruzadas indesejadas. Para obter mais informações, consulte¹².
2. Montagem de amostras para microscopia de luz
   1. Submergir as grades em glicerol 50% em dH 2 O₂x 5 min no TR. Sanduíche as grades entre uma lâmina de vidro e lamínula em glicerol 50%, uma grade por lamínula, com seções voltadas para a lamínula (Figura 1D).
      NOTA: A qualidade da rotulagem pode deteriorar-se quando as grades são mantidas montadas em glicerol a 50% por mais de 30 min. Portanto, recomenda-se montar e criar imagens de duas ou três grades de cada vez e deixar as outras na solução de etiquetagem secundária.
3. Microscopia óptica
   1. Leve uma lâmina de vidro com grades sanduíche para um microscópio de campo largo com um estágio automatizado. Selecione uma objetiva de óleo de alta ampliação (63x ou 100x). Crie um conjunto de blocos de imagem de (parte de) da faixa de opções de seções (Figura 1E).
      NOTA: Alguns anticorpos secundários podem formar agregados fluorescentes em grades, especialmente ao redor de dobras ou rasgos nas seções. Além disso, alguns tipos celulares e tecidos contêm estruturas autofluorescentes. Se tais problemas são esperados, recomenda-se incluir uma grade de controle negativo não incubada com anticorpo primário.
4. Desmontagem e EM contrastantes
   1. Adicione 10 μL de dH₂O ao lado do sanduíche deslizante de vidro e aguarde a ação capilar para preencher a interface sanduíche de tampa de vidro. Remova cuidadosamente a lamínula sem misturar óleo de imersão no glicerol. Recupere as grades com uma pinça e submerja em dH₂O 3x no RT para lavar o glicerol a 50%.
      NOTA: O óleo pode interferir na coloração de uranila e deteriorar o contraste EM.
   2. Seque cuidadosamente a parte de trás da grade com papel de seda sem fiapos.
      NOTA: Se a amostra também foi marcada com partículas de ouro coloidal, execute as seguintes etapas: coloque a grade com seções do lado de baixo em gotículas PBS e lave 2x em RT. Postfix em 1% GA por 5 min em RT (ver nota de cautela em 1.1.4). Lave em PBS 2x no RT.
   3. Coloque as grades do lado de baixo em gotículas de dH₂O e lave 8x no RT.
   4. Para coloração dos cortes para contraste em ME, incubar com acetato de uranila (AU), pH 7, por 5 min em TR (Figura 1F).
   5. Antes de colocar as grades, resfriar o UA:metilcelulose, pH 4, colocando gotículas no parafilme em uma placa de metal sobre gelo. Em seguida, lavar as grades com ácido ácido UA:metilcelulose, pH 4, 2x e incubar com ácido ácido UA:metilcelulose, pH 4, por 10 min (Figura 1F).
      CUIDADO: O acetato de uranila é um produto químico perigoso (advertências de perigo H300, H330, H373, H411). Em etapas que exigem UA, trabalhe com capuz químico e use equipamentos de proteção (jaleco, luvas e óculos de proteção). Coletar e destinar resíduos contendo AI de acordo com as diretrizes e regulamentos dos institutos.
   6. Loop para fora das grades inserindo um loop de secagem de grade na gota UA:metilcelulose abaixo da grade e levantando-a suavemente até que a grade seja retirada da gota¹². Limpe o excesso de UA:metilcelulose tocando o laço em um ângulo de ~60° (seções voltadas para baixo) em papel de filtro sem fiapos (consulte Tabela de Materiais) e arrastando-o lentamente ao longo do papel até que não mais UA:metilcelulose seja absorvido. Em seguida, coloque o laço com a grade em um rack adequado e deixe secar por >10 min no RT (Figura 1G).

5. EM

1. Use a visão geral obtida pela microscopia de luz para localizar uma região de interesse (ROI) para obtenção de imagens no microscópio eletrônico de transmissão (MET; Figura 1H). Anote o ROI no conjunto de dados de microscopia de luz. Depois que uma região for selecionada, obtenha um conjunto de blocos de imagem com ampliação de 20.000x-50.000x no MET. Reconstruir o conjunto de mosaicos da imagem em software de pós-processamento^15,16.

6. Correlação e análise

1. Carregue a microscopia de luz e o conjunto de dados EM em software de processamento de imagem adequado, como o ImageJ/Fiji¹⁷, o plug-in ec-CLEM no Icy¹⁸ ou o Photoshop. Recorte e gire o conjunto de dados de microscopia de luz para corresponder ao conjunto de blocos EM.
   1. Realizar a correlação baseada no sinal DAPI em fluorescência e contornos nucleares em EM (Figura 1I). Mude as imagens para sobrepô-las com precisão e execute a correlação manual com precisão. Para tornar a abordagem mais exata, aplique a correlação baseada em pontos de referência através, por exemplo, do plugin ec-CLEM no Icy ou do plugin BigWarp no ImageJ, para correlacionar as imagens através da seleção manual dos pontos correspondentes. Um protocolo detalhado e passo-a-passo para correlação com ec-CLEM está disponível¹⁹.
      NOTA: Esta abordagem também funciona bem com o uso de sondas fiduciais bimodais^20,21.
2. Analise as imagens correlacionadas selecionando ROIs com base no sinal fluorescente em um programa adequado (por exemplo, ImageJ). Para análise quantitativa, crie uma coleção de ROIs para todas as organelas rotuladas. Em seguida, inspecione a ultraestrutura correspondente das ROIs individuais e classifique-as com base em elementos morfológicos.

Resultados

Um protocolo imuno-EM otimizado para marcação imuno-ouro de CL3 em criossecções ultrafinas foi recentemente publicado por De Maziere et ^al.9. Este estudo incluiu condições de fome sem BafA1, nas quais a CL3 estava presente, mas relativamente rara e difícil de encontrar por ME. Um método CLEM em secção foi introduzido em um estudo separado, que usa a sensibilidade da marcação por fluorescência para visualizar proteínas endógenas relativamente raras e pouco expressas e correlacioná-las com a ultraestrutura^EM14. Aqui, essas duas abordagens são combinadas pelo uso do protocolo de marcação LC3 otimizado como parte de uma abordagem CLEM.

As células HEPG2, células derivadas do fígado com níveis relativamente altos de autofagia basal²², foram submetidas à privação em meio mínimo (solução salina balanceada de Earle [EBSS]) por 2 h antes da fixação em PFA a 4%. Seguiu-se a preparação da amostra pelo método de criossecção ultrafina de Tokuyasu (seções 1-3; ver Slot e Geuze¹²), que é altamente compatível com a seção CLEM ^14,23. Criosecções descongeladas foram marcadas fluorescentemente (protocolo seção 4 e Figura 1) usando anticorpo primário anti-LC3 de camundongo⁹. Adicionalmente, anti-LAMP1 de coelho foi usado para indicar endolisossomos, seguido por anticorpos secundários anti-camundongo AlexaFluor488 e anti-coelho AlexaFluor568. As grades foram prensadas entre uma lamínula e uma lâmina de vidro e obtidas em RT em um microscópio de campo largo (objetiva de óleo 100x 1,47 NA, câmera sCMOS).

Uma vantagem da marcação por fluorescência de seções finas sobre o FI convencional de células inteiras é o aumento da resolução em Z, uma vez que a espessura física da seção é de 60-90 nm. Com essa resolução Z aprimorada, a marcação por fluorescência de CL3 e LAMP1 em cortes finos revela muito pouca colocalização (Figura 2A). Em células tratadas com inibidores lisossômicos, como o BafA1, ocorre alta colocalização, uma vez que a CL3 lisossômica permanece indegradada⁹. Em células não tratadas, a CL3 é rapidamente degradada ao entrar em contato com lisossomos enzimaticamente ativos positivos para LAMP1 e, portanto, a co-localização é rara nessas condições. Em geral, observou-se menos de um ponto de CL3 por perfil celular. Isso indica que, mesmo em condições de fome, o turnover dos autofagossomos é rápido, mantendo baixos os números de autofagossomos. Também destaca a importância do uso do CLEM para encontrar as raras estruturas marcadas com LC3, usando o grande campo de visão proporcionado pela microscopia de luz. Além disso, a maior sensibilidade da marcação por fluorescência em comparação à marcação com ouro permite a identificação de mais organelas CL3-positivas do que em imuno-ME convencionais, auxiliando ainda mais sua caracterização.

Após a aquisição de um conjunto completo de azulejos da fita de cortes, as grades foram retiradas do microscópio e pós-coradas para ME usando AI e o método loop-out (passos do protocolo 4.4-4.6; Figura 1F,G). Este método de "loop-out" garante que uma fina camada de UA:metilcelulose permaneça na grade, o que cria o contraste desejado no EM. A espessura da camada depende da velocidade e do ângulo com que o UA:metilcelulose é apagado no papel de filtro. Arrastar o loop muito rapidamente pode deixar muito UA:metilcelulose na grade e escurecer a aparência das seções em EM. Arrastar muito devagar pode afastar muito UA:metilcelulose, resultando em pouca coloração e morfologia ruim, e corre o risco de a grade cair fora do circuito. A coloração «mancha de óleo» (Figura 1G) nas grelhas secas indica uma espessura adequada da camada de UA:metilcelulose.

Após loop-out e secagem, as grades foram fotografadas em um ETM em ROIs selecionadas por fluorescência. Os conjuntos de dados IF e EM foram correlacionados sobrepondo o sinal DAPI aos contornos dos núcleos visíveis no ME, gerando uma imagem integrada contendo informações de ambas as modalidades.

Encontrar a mesma área em EM selecionada em IF pode ser um desafio. Portanto, recomenda-se manter uma imagem geral do conjunto de blocos IF à mão durante a pesquisa no EM. Os usuários devem procurar recursos reconhecíveis em ambas as modalidades, como dobras ou rasgos nas seções, barras de grade ou disposição de núcleos. Também é importante ter em mente que a amostra pode aparecer girada e espelhada em EM. As "grelhas do Finder" com características específicas para identificar áreas podem ser utilizadas para facilitar a correlação (ver Tabela de Materiais).

A correlação das organelas CL3-positivas com a ultraestrutura EM revelou que os diferentes pontos representaram estágios distintos de autofagia (Figura 2B). Embora a preservação da ultraestrutura autofagossomal seja desafiadora em criossecções, organelas com conteúdo citoplasmático e membranas duplas foram frequentemente observadas (Figura 2C, setas nas organelas 1-5; Figura Suplementar S1), que são características morfológicas definidoras dos autofagossomos. Curiosamente, manchas fluorescentes bastante fracas foram identificadas pelo ME como autolisossomos CL3-positivos (Figura 2C, organela 6; conteúdo autofágico é marcado *), caracterizados por conteúdo denso e vesículas intraluminais. Isso mostrou que quantidades muito pequenas de CL3 são visíveis no FI de criossecções ultrafinas, e indicou que, apesar do meio degradativo, algumas CL3 são detectáveis em autolisossomos em estado estacionário. No entanto, a maioria dos pontos positivos para LC3 representou autofagossomos, enquanto os autolisossomos foram muito raros. Isso contrasta com as células tratadas com BafA1, que acumulam primariamente autolisossomos e não autofagossomos⁹.

Em resumo, este protocolo descreve um método CLEM em seção para ligar informações moleculares obtidas por microscopia de fluorescência à ultraestrutura do ME. Este método aumenta a sensibilidade dos imuno-ME, uma vez que apenas fluoróforos são usados para marcação e estes geralmente produzem mais sinal do que as sondas EM. O método é especialmente adequado para o uso de criosecções ultrafinas, nas quais altos níveis de fluorescência específica sobre coloração de fundo insignificante podem ser obtidos. Usando fluorescência para rastrear estruturas ou eventos raros e correlacionando ROIs selecionadas com EM, o tempo de operação do EM e os custos associados podem ser muito reduzidos. A sensibilidade e a viabilidade do método são demonstradas pela visualização da CL3 em células carentes não tratadas, mostrando que a CL3 associa-se predominantemente a autofagossomos nessas condições, com níveis muito baixos visíveis nos autolisossomos.

Figura 1: Visão geral esquemática do CLEM na seção . (A) As criossecções de células emblocadas em gelatina são coletadas em uma grade de cobre revestida com formvar. (B) As grades são processadas seccionadas em gotículas das soluções apropriadas. (C) As grades são marcadas com anticorpos secundários primários e fluorescentes. (D) As grades são prensadas entre uma lamínula e uma lâmina de vidro em glicerol a 50%. (E) As imagens de fluorescência são coletadas em microscópio de campo largo. (F) As grades são recuperadas da lâmina de vidro e posteriormente processadas por coloração de uranila para EM. (G) Após a secagem, as grades podem ser fotografadas por MET. (H) O conjunto de imagens TEM de alta magnificação é adquirido a partir de uma área selecionada a partir de dados de fluorescência. (I) As imagens de microscopia de fluorescência e ME são correlacionadas e sobrepostas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: CLEM de CL3 e LAMP1 em células HEPG2 famintas. As células HEPG2 ficaram sem fome por 2 h em EBSS antes da fixação com PFA a 4% por 2 h. (A) As imagens de IF de CL3 (verde) e LAMP1 (vermelho) em cortes revelam relativamente poucos pontos de CL3 e pouca colocalização com LAMP1. (B) Ligar a informação molecular do FI (painel esquerdo) à informação ultraestrutural obtida no EM (painel do meio) sobrepondo as duas modalidades de imagem baseadas em DAPI e contornos nucleares (linhas tracejadas, painel direito). A ultraestrutura dos compartimentos individuais marcados com LC3, exemplificada pela caixa 1 (painel direito), é mostrada em C. (C) Ultraestrutura dos compartimentos CL3-positivos. As imagens CLEM são mostradas à esquerda e as imagens EM pseudocoloridas (bege) à direita (imagens EM não coloridas são mostradas na Figura Suplementar S1). As membranas autofagossomal interna e externa são indicadas por pontas de setas brancas e pretas, respectivamente. O conteúdo autofágico dentro do autolisossomo no exemplo 6 é indicado por *. Barras de escala = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Imagens EM não coloridas de organelas CL3-positivas. (A-F) Imagens EM não coloridas dos exemplos pseudocoloridos 1-6 mostradas na Figura 2C. As organelas foram selecionadas por fluorescência da CL3, conforme descrito na Figura 2. As membranas autofagossomal interna e externa são indicadas por pontas de setas brancas e pretas, respectivamente. O conteúdo autofágico dentro do autolisossomo no exemplo 6 é indicado por *. Barras de escala = 200 nm. Abreviações: AL = autolisossomo; PA = autofagossomo; M = mitocôndria. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: Buffers e soluções usados neste estudo. Este arquivo suplementar contém as receitas e protocolos necessários para fazer os buffers e soluções usados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O método aqui apresentado aproveita os recentes avanços na criossecção baseada na secção CLEM - a alta sensibilidade da marcação do FI e a correlação precisa (erro de <100 nm) entre FM e ME^14,24. Isso resulta em um método com a sensibilidade a marcar fluorescentemente proteínas endógenas escassas e a capacidade de sobrepô-las com alta precisão à ultraestrutura EM. Assim, este método evita a necessidade de (sobre)expressão de proteínas marcadas exogenamente e o uso de rótulos EM menos sensíveis. A viabilidade do método é demonstrada por exemplos de CLEM sobre CL3 endógena em células carentes, sem o uso de inibidores lisossomais.

As criossecções descongeladas obtidas pelo método de Tokuyasu são amostras ideais para imuno-EM, pois ao contrário das seções de resina, são permeáveis a anticorpos. Combinado com procedimentos de fixação suave e contraste, geralmente proporciona excelente eficiência de marcação em relação a outros métodos, sem comprometer a ultraestrutura detalhada, e visualiza de forma excelente as membranas celulares 12,25,26. Além disso, as criossecções são altamente compatíveis com a microscopia de fluorescência, o que as torna substratos valiosos para CLEM. Tanto a marcação clássica do imunoouro quanto o CLEM em criossecções forneceram insights seminais na compreensão da organização subcelular 14,27,28,29,30.

Atualmente, as aplicações de CLEM em criossecções descongeladas estão se tornando mais prevalentes, como resultado de desenvolvimentos e otimizações contínuas 14,20,24,31,32,33,34 que melhoraram a qualidade, aplicabilidade e precisão da abordagem. Já por meio da correlação precisa de grandes conjuntos de imagens IF e EM, a técnica facilita o rastreamento da ultraestrutura de componentes celulares endógenos marcados fluorescentemente 14,32,33. Esta é uma vantagem em relação ao imuno-ME clássico, onde a busca por estruturas marcadas com ouro normalmente requer alta magnificação e, portanto, é mais trabalhosa e demorada. É por esta razão que a localização da CL3 para a ultraestrutura se beneficia muito do CLEM. Organelas positivas para LC3 são comuns quando a depuração autofágica é bloqueada (ou seja, quando as células são tratadas com BafA1 ou agentes elevam o pH), enquanto organelas autofágicas são rapidamente eliminadas em células inalteradas ou famintas, resultando em níveis muito baixos de estado estacionário. Em tais condições, encontrar organelas marcadas com LC3 usando imuno-EM clássico pode ser um desafio, e o CLEM oferece uma clara vantagem.

Anteriormente, CLEM em cortes de resina foi aplicado em estudos utilizando expressão ectópica de LC3-GFP ou uma sonda tandem LC3-GFP-RFP35,36,37,38,39. Nesses estudos, imagens de fluorescência foram realizadas antes da incorporação ou diretamente em seções de resina acrílica⁴⁰, e as amostras foram posteriormente triadas por ME. Existem várias vantagens da incorporação de resina; A ultraestrutura autofagossomal é geralmente bem preservada, especialmente se o material for congelado a alta pressão⁴⁰. Além disso, o contraste do material corado com resina de metais pesados é geralmente mais pronunciado do que o das criossecções coradas com uranil. Cortes embutidos em resina são compatíveis com métodos de ME volumétricos, como tomografia por arranjo, FIB-MEV ou MEV blockface seriada, enquanto criossecções não são. Em abordagens que realizam imagens antes da incorporação, a imagem de células vivas é uma opção⁴¹ que não está disponível no CLEM em criossecções. A principal vantagem do CLEM em criossecções sobre essas alternativas é o alto sinal de FI, permitindo a imunolocalização de proteínas raras sem a necessidade de permeabilização ou superexpressão da membrana. Isso evita potencial extração de membrana, artefatos de superexpressão⁴² e modificação genética do indivíduo, o que, combinado com a possibilidade de correlacionar grandes áreas em FI e ME, o torna uma excelente ferramenta para estudar CL3 e autofagia.

Aqui, a aplicação de CLEM em secção em células HEPG2 famintas revelou que a CL3 se localizava predominantemente em estruturas identificadas como autofagossomos. Além disso, alguns pontos fracamente fluorescentes foram encontrados nos autolisossomos. Isso contrasta diretamente com as células tratadas com BafA1⁹ e reflete a rápida degradação das proteínas autofagossomais, uma vez que o autofagossomo se funde com os lisossomos. Em geral, os dados demonstraram que o CLEM de criossecções descongeladas pode fornecer informações sobre a autofagia mediada por LC3 em condições nativas. Os dados também destacam a sensibilidade da tecnologia, uma vez que a LC3 foi detectada mesmo em autolisossomos que contêm apenas baixos níveis de epítopos intactos de LC3. A aplicação adicional desta técnica por meio de imagens de CL3 em diferentes modelos e condições melhorará nossa compreensão da autofagia e de outros processos biológicos mediados por LC3, como fagocitose associada à LC3 ou conjugação de ATG8 a membranas únicas.

Além da autofagia, o CLEM em secção pode ser aplicado a outros eventos ou estruturas raras, como divisão celular, infecção, tipos celulares raros em tecidos, cinetócoros, cílios primários ou organelas específicas do tipo celular. A triagem eficaz do assunto de interesse pelo FI pode facilitar sobremaneira o estudo ultraestrutural dessas raridades. Além disso, demonstrou-se¹⁴ que a técnica pode ser usada para localizar proteínas de maneira mais sensível do que o imuno-ME clássico. O ajuste do comprimento de fixação pode ampliar ainda mais essa sensibilidade, permitindo a localização ultraestrutural de proteínas muito pouco abundantes ou pouco antigênicas. Finalmente, o método CLEM em secção facilita a seleção rápida de um número quantitativo de organelas, facilitando uma análise mais robusta da distribuição ultra-estrutural de uma dada proteína.

CLEM em criossecções requer o equipamento e experiência para a criossecção. Em grupos com acesso a essas ferramentas (por exemplo, criomicótomos), a implementação do CLEM na seção é simples e requer apenas a disponibilidade de um microscópio de campo largo automatizado, uma configuração à qual a maioria dos laboratórios tem acesso. Além disso, o método está disponível em instalações de EM em todo o mundo. Como o CLEM na secção combina a aplicação de métodos estabelecidos de FI e EM, o método é facilmente adaptado e pode ser combinado, por exemplo, com tomografia 20,33,43^, volume de secção seriada EM de um número limitado de cortes⁴⁴ ou microscopia de super-resolução ⁴⁵. Essa versatilidade do método suporta aplicações em uma ampla gama de questões biológicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos e reagentes
Anticorpo burro anti-rato Alexa Fluor 488	Life Technologies	#A21202	uso 1:250
Anticorpo burro anti-coelho Alexa Fluor 568	Life Technologies	A#10042	uso 1:250
Anticorpo rato anti-LC3	Cosmo Bio	CTB-LC3-2-IC	uso 1:100
Anticorpo Albumina	soro do 1:250 do uso	sinalização	9091
, fração V	Sigma-Aldrich	A-9647
BSA-c	Aurion	900,099
BSA-núcleo conjugado da	microscopia de pilha do ouro, UMC Utrecht	BSAG 5 nanômetro
Clorofórmio sem água	Merck	1,02447,0500
DAPI	Invitrogen	10184322	Use na concentração final de 10 µ g/ml
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Gelatina de pele de peixe	Sigma-Aldrich	G7765
Gelatina de grau alimentício	Merck	G1890
Formvar, Vinylec E	SPI	02492-RA
Gluteraldeído	Serva	23115.01	Ver nota de CUIDADO
Glicerol	Boom	MBAK 7044.1000
Glicina	Merck	1042010250
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Metilcelulose, 25 polegadas	Sigma-Aldrich	M-6385
MgSO4	Riedel-de Haen	12142
Na2HPO4 (PB componente A)	Merck	106580-0500
NaBH4	Merck	806373
NaH2PO4 (PB componente B)	Merck	106346
NH4OH	Sigma-Aldrich	221228-0025
Ácido oxálico	Merck	100495
Paraformaldeído grânulos	Sigma-Aldrich	441244	Ver CUIDADO nota
PIPES	Merck	110220
de células de ouro conjugado com proteína-A	, UMC Utrecht	PAG 5, 10, 15 ou 20 nm
Sacarose D(+)	VWR	27483294
Acetato de uranilo	SPI	020624-AB	Consulte a nota de
CUIDADOFerramentas e consumíveis
Pick-up loop	Electron Microscopy Sciences	70944
Papel de filtro, qualitativo, médio-rápido	LLG	6.242 668
Grades Finder	Ted Pella	G100F1
Grids	Cell Microscopy Core, UMC Utrecht	100 mesh
Microscópios
Leica Thunder microscópio de campo amplo	Leica		Componentes: 100x, objetiva TIRF de 1,47 NA; Câmera sCMOS Photometrics prime 95B; Software LAS X;
Ultracriomicrótomo Leica UC7	Leica
Tecnai T12	FEI		Componentes: Câmera Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM; Software SerialEM
Software
ec-CLEM em	código		Paul-Gilloteaux et al., 2017
Fiji	código aberto		Schindelin et al., 2012
IMOD	código aberto		Mastronarde et al., 2017
Photoshop	Adobe
SerialEM	aberto fonte		Mastronarde et al., 2018