Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Investigar o desenvolvimento (pato)fisiológico e a evolução do córtex cerebral é uma tarefa formidável que é dificultada pela falta de sistemas modelo adequados. Anteriormente, tais estudos estavam confinados a modelos bidimensionais de cultura celular (como progenitor neural primário ou culturas de células neuronais) e modelos animais evolutivamente distantes (como roedores)^1,2. Embora esses modelos sejam úteis para abordar certas questões, eles são limitados na modelagem da complexidade, composição do tipo celular, arquitetura celular e padrões de expressão gênica do neocórtex humano em desenvolvimento em estados saudáveis e doentes. Essas limitações levam, por exemplo, à baixa traduzibilidade de modelos murinos de doenças humanas para a situação humana, como descrito para certos casos de microcefalia (por exemplo, Zhang et ^al.3). Recentemente, primatas não humanos transgênicos, que são um modelo evolutiva, funcional e morfologicamente mais próximo do desenvolvimento do neocórtex humano, têm entrado em foco 4,5,6,7,8 à medida que superam muitas limitações dos modelos baseados em cultura celular e roedores. No entanto, o uso de primatas não humanos em pesquisas não é apenas altamente caro e demorado, mas também levanta preocupações éticas. Mais recentemente, o desenvolvimento da tecnologia de organoides^{cerebrais9,10} surgiu como uma alternativa promissora que resolve muitas das limitações de modelos anteriores11,12,13,14,15,16.

Os organoides cerebrais são estruturas tridimensionais (3D), multicelulares, que emulam as principais características da citoarquitetura e composição celular-tipo de uma ou múltiplas regiões cerebrais para uma janela de tempo de desenvolvimento definida11,12,13,14,17. Essas estruturas 3D são geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou, se disponíveis para a espécie de interesse, a partir de células-tronco embrionárias (CTEs). Em geral, dois tipos de organoides cerebrais podem ser distinguidos com base na metodologia utilizada: organoides cerebrais não guiados e regionalizados (guiados)¹⁸. Na geração deste último tipo de organoides, são fornecidas pequenas moléculas ou fatores que orientam a diferenciação das células-tronco pluripotentes em organoides de uma determinada região do cérebro (por exemplo, organoides do prosencéfalo)¹⁸. Por outro lado, em organoides não guiados, a diferenciação não é guiada pela adição de pequenas moléculas, mas depende exclusivamente da diferenciação espontânea das iPSCs/ESCs. Os organoides cerebrais resultantes consistem em tipos celulares que representam diferentes regiões cerebrais (por exemplo, organoides cerebrais)¹⁸. Os organoides cerebrais combinam muitas características-chave do desenvolvimento cerebral com uma geração relativamente eficiente em termos de custo e tempo a partir de qualquer espécie de interesse para a qual as iPSCs ou ESCs estejam disponíveis^11,12,13,14. Isso faz dos organoides cerebrais um excelente modelo para muitos tipos de estudos neurobiológicos, desde questões evolutivas e de desenvolvimento até modelagem de doenças e testes de drogas^15,16. No entanto, a abordagem de tais questões usando organoides cerebrais depende fortemente da disponibilidade de diferentes métodos para modificação genética.

Um aspecto fundamental do estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução é a análise funcional de genes e variantes gênicas. Isso geralmente é conseguido pela expressão (ectópica) e/ou por knock-down (KD) ou knock-out (KO) desses genes. Tais modificações genéticas podem ser classificadas em modificações genéticas estáveis e transitórias, bem como em modificações restritas temporal e espacialmente ou não restritas. A modificação genética estável é definida pela introdução de uma alteração genética no genoma do hospedeiro que é transmitida a todas as gerações celulares subsequentes. Dependendo do momento da modificação genética, pode afetar todas as células de um organoide ou pode ser restrito a determinadas populações celulares. Mais frequentemente, a modificação genética estável é obtida em organoides cerebrais no nível iPSC/ESC através da aplicação de lentivírus, sistemas semelhantes a transposons e a tecnologia CRISPR/Cas9 (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20). Isso tem a vantagem de que todas as células do organoide cerebral carregam a modificação genética e que ela não é restrita temporal ou espacialmente. No entanto, a geração e a caracterização dessas linhagens estáveis de iPSC/ESC são muito demoradas, muitas vezes levando vários meses até que os primeiros organoides cerebrais modificados possam ser analisados (revisados por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 ou Teriyapirom et ^al.20).

Em contraste, a modificação genética transitória é definida pela entrega de carga genética (por exemplo, um plasmídeo de expressão gênica) que não se integra ao genoma do hospedeiro. Embora essa modificação possa, em princípio, ser passada para as gerações celulares subsequentes, a carga genética entregue será progressivamente diluída a cada divisão celular. Portanto, esse tipo de modificação genética costuma ser restrita temporal e espacialmente. A modificação genética transitória pode ser realizada em organoides cerebrais por vírus adenoassociados ou por eletroporação (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20), sendo esta última descrita em detalhes neste artigo. Em contraste com a modificação genética estável, esta abordagem é muito rápida e econômica. De fato, a eletroporação pode ser realizada em poucos minutos e, dependendo da(s) população(ões) de células-alvo, os organoides eletroporados estão prontos para análise em poucos dias (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19). No entanto, alterações morfológicas macroscópicas do organoide cerebral, como diferenças de tamanho, não podem ser detectadas por esse método, pois esse tipo de modificação genética é restrita temporal e espacialmente. Essa restrição também pode ser uma vantagem, por exemplo, no caso de estudar populações celulares individuais dentro do organoide ou os efeitos sobre organoides cerebrais em momentos específicos de desenvolvimento (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19).

Uma abordagem clássica para estudar a função gênica durante o desenvolvimento e evolução cerebral é a eletroporação in utero. A eletroporação in utero é uma técnica bem conhecida e útil para a liberação de construções de expressão gênica em cérebros de roedores 21,22,23 e furões ^24,25. Primeiro, uma solução contendo o(s) construto(s) de expressão de interesse é microinjetada através da parede uterina em um determinado ventrículo do cérebro embrionário, dependendo da região a ser alvo. Na segunda etapa, pulsos elétricos são aplicados para transfectar as células que revestem diretamente o ventrículo alvo. Essa abordagem não se limita apenas à expressão ectópica ou à superexpressão de genes, como também pode ser aplicada em estudos de KD ou KO por microinjeção de hairpin curto (shRNA) ou CRISPR/Cas9 (na forma de plasmídeos de expressão ou ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente^26,27. No entanto, a eletroporação in utero de embriões de camundongos, ratos e furões tem as mesmas limitações descritas acima para esses modelos animais.

O ideal seria realizar eletroporação in utero diretamente em primatas. Embora isso seja, em princípio, tecnicamente possível, a eletroporação in utero não é realizada em primatas devido a preocupações éticas, altos custos de manutenção animal e pequenos tamanhos de ninhada. Para certos primatas, como grandes símios (incluindo humanos), isso não é possível. No entanto, esses primatas têm o maior potencial para o estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex humano e sua evolução. Uma solução para esse dilema é aplicar a técnica de eletroporação aos organoides cerebrais de primatas²⁸.

Este trabalho apresenta um protocolo para a eletroporação de um subtipo de organoides cerebrais de primatas, organoides cerebrais de primatas. Essa abordagem permite a modificação genética rápida e econômica de populações celulares dentro das estruturas semelhantes aos ventrículos dos organoides. Especificamente, descrevemos um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas a partir de iPSCs humanas (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) e sagui-comum (Callithrix jacchus). Além disso, descrevemos a técnica de microinjeção e eletroporação em detalhes e fornecemos critérios "go" e "no-go" para a realização da eletroporação organoide cerebral de primatas. Esta abordagem é uma ferramenta eficaz para estudar o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução em um modelo especialmente próximo da situação humana.

1. Cultura de iPSCs de primatas

NOTA: Devido à sua robustez, o método aqui apresentado pode ser aplicado a qualquer linhagem iPSC de primatas. Neste artigo, descrevemos a produção de organoides cerebrais a partir de linhagens iPSC humana (iLonza2.2)29, chimpanzé (Sandra A)³⁰, macaco rhesus (iRh33.1)²⁹ e sagui-comum (cj_160419_5)³¹. As condições de cultivo estão resumidas na Tabela 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Para o cultivo das respectivas iPSCs, siga as condições de cultura originalmente descritas. Em geral, para o sucesso da geração e eletroporação de organoides cerebrais, use linhas iPSC que não tenham sido cultivadas por mais de 90 passagens. Além disso, no início da geração de organoides cerebrais, certifique-se de que as iPSCs exibem características de pluripotência sem sinais de diferenciação.

2. Geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs de primatas

NOTA: O protocolo para geração de organoides cerebrais é baseado em uma versão modificada 28,30,32,33 do protocolo organoide cerebral original ^10,34 com algumas modificações espécie-específicas (detalhadas abaixo).

1. Semeadura de iPSCs para geração de corpos embrionários (EBs)
   1. Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80%-90% de confluência, lave-as com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco e adicione 500 μL de substituto de tripsina recombinante ou 1 mL de mistura proteolítica e colagenolítica.
      NOTA: Normalmente, as iPSCs são cultivadas em uma placa de cultura celular de 60 mm para obter aproximadamente 900.000 células, o que é suficiente para gerar 96 organoides cerebrais. Os números de células podem ser ajustados dependendo do número de organoides necessários. Esteja ciente de que nem todos os organoides cerebrais gerados podem ser adequados para eletroporação.
   2. Incubar a placa a 37 °C durante 2 minutos para separar as células.
      NOTA: Até 2 minutos adicionais de incubação a 37 °C podem ser necessários, dependendo da linha iPSC ou da enzima utilizada. É aconselhável examinar o prato sob um microscópio para garantir que as células começaram a se desprender.
   3. Adicionar 1,5 ml de meio de cultura iPSC pré-aquecido (37 °C) para parar a reacção e pipetar para cima e para baixo 7x-10x (não mais de 10x) para dissociar as células da placa de cultura celular e obter uma suspensão de célula única.
   4. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrifugar as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
   5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 2 mL de meio de cultura iPSC suplementado com 50 μM Y27632 ou 50 μM de composto pró-sobrevivência.
   6. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células usando uma câmara de Neubauer.
   7. Ajustar a suspensão celular para uma concentração de 9.000 células por 150 μL (60.000 células/mL) usando meio de cultura iPSC suplementado com 50 μM Y27632 ou 50 μM composto pró-sobrevivência.
   8. Para gerar corpos embrionários (EBs), semeie 150 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Durante a pipetagem, agite suavemente o tubo que contém a suspensão celular para evitar que as células se sedimentem.
   9. Cultivar os EBs em atmosfera humificada de 5% CO₂ e 95% de ar a 37 °C (0 dias pós-semeadura [dps]). Não perturbe os EBs nas primeiras 24 h após a semeadura.
      NOTA: EBs gerados a partir de iPSCs de saguis precisam ser cultivados em atmosfera humificada sob condições hipóxicas (5% CO 2, 5% O 2 e 90% N ₂) a 37 °C.
   10. Após ~48 h (2 dps), troque o meio para meio de cultura iPSC sem composto Y27632/pró-sobrevivência. Remover 100 μL de meio por poço e adicionar 150 μL de meio fresco pré-aquecido (37 °C) sem Y27632. Vá linha por linha.
   11. Realizar novas trocas de meios a cada dois dias; remover 150 μL de meio de cada poço e adicionar 150 μL de meio fresco pré-aquecido (37 °C) sem Y27632/composto pró-sobrevivência por poço.
       NOTA: Após 4-5 dps, a periferia dos EBs deve tornar-se translúcida.
2. Indução de neuroectoderma
   NOTA: Em geral, os EBs de boa qualidade devem ter contornos suaves e bordas translúcidas nesta fase. Os pontos de tempo de indução neural diferem ligeiramente entre as espécies de primatas e as linhas iPSC. No caso das linhagens celulares usadas aqui (ver seção 1 e Tabela de Materiais), a indução neural para EBs de saguis geralmente precisa ser iniciada em 4 dps, para macaco rhesus em 5 dps e para EBs humanos e chimpanzés em 4-5 dps (Figura 1A), dependendo do estado dos EBs (veja acima).
   1. Remover 150 μL de meio de cada poço da primeira fileira da placa de 96 poços e adicionar 150 μL de meio de indução neural pré-aquecido (37 °C) (ver Tabela 2) por poço na mesma linha.
   2. Continue trocando o meio conforme descrito acima, linha por linha, para toda a placa de 96 poços. Realizar novas mudanças no meio de indução neural (NIM) a cada dois dias, removendo 150 μL de NIM de cada poço e adicionando 150 μL de NIM fresco pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: A partir deste ponto, os EBs de sagui devem ser cultivados nas mesmas condições que os outros EBs de primatas (atmosfera humificada de 5% CO₂ e 95% de ar a 37 °C).
3. Incorporação na matriz da membrana basal
   NOTA: Uma vez que as EBs tenham desenvolvido um neuroepitélio pronunciado, translúcido e radialmente organizado na superfície, é necessário fornecer suporte estrutural para o desenvolvimento de estruturas semelhantes a ventrículos. Isso é conseguido incorporando os EBs em uma matriz de membrana basal. Devido às diferenças nas taxas de desenvolvimento, os EBs de sagui e macaco rhesus estão prontos para incorporação já em 7 dps, enquanto os EBs humanos e chimpanzés são geralmente incorporados em 8-9 dps. Para simplificar, a matriz da membrana basal refere-se apenas ao Matrigel neste protocolo. No entanto, Geltrex pode ser usado como um substituto.
   1. Em preparação para incorporação, tesoura UV-esterilizar, pinças, um pequeno rack para tubos de 0,2 mL e três a seis quadrados de parafilme tratados com etanol 70% (vol/vol) sob a capela de fluxo laminar por 15 min. Deixe a matriz da membrana basal descongelar no gelo por várias horas (~1,5 mL de matriz da membrana basal é geralmente suficiente para 96 EBs).
      NOTA: Mantenha sempre a matriz da membrana basal no gelo.
   2. Crie uma grade de covinhas 4 x 4 no parafilme. Coloque a grade do parafilme no rack de tubo de 0,2 mL de modo que o lado envelopado em papel fique voltado para cima e pressione suavemente um dedo enluvado contra cada orifício do rack.
   3. Remova o papel e corte a grade de covinha do quadrado de parafilme usando tesoura para ajustar seu tamanho para caber em uma placa de cultura de células de 60 mm. Coloque o parafilme ondulado de volta no rack de tubo de 0,2 mL para fornecer uma base para a geração de gotículas da matriz da membrana basal.
   4. Usando uma pipeta com uma ponta de pipeta cortada de 200 μL, transfira cuidadosamente os EBs, um após o outro, do poço do prato de cultura para as covinhas de parafilme.
   5. Depois de mover 16 EBs para a grade, pegue uma nova ponta de pipeta de 200 μL e remova o meio restante das covinhas.
   6. Pipetar uma gota (~15 μL) de matriz de membrana basal em cada covinha contendo um EB.
   7. Pegue uma ponta de pipeta de 10 μL e mova rapidamente os EBs para o centro de cada gotícula sem perturbar as bordas da gotícula.
   8. Coloque o parafilme ondulado com as gotas da matriz da membrana basal em uma placa de cultura de células de 60 mm e incube por 15-30 min a 37 °C para permitir que a matriz se polimerize.
   9. Para separar os EBs embutidos em matriz do parafilme, adicione 5 mL de meio de diferenciação ( MS) sem vitamina A ( ver Tabela 2) à placa e vire o quadrado do parafilme de cabeça para baixo usando pinças de modo que o lado com os EBs fique voltado para o fundo da placa.
   10. Agite cuidadosamente a placa para que as gotas da matriz da membrana basal contendo os EBs se desprendam do parafilme. Se alguns deles ainda estiverem presos, pegue uma borda do quadrado de parafilme usando pinças e enrole-o rapidamente em direção ao centro do prato várias vezes.
   11. Cultivar os organoides cerebrais em agitador orbital a 55 rpm em atmosfera umedecida de 5% de CO₂ e 95% de ar a 37 °C. Mantenha-os em DM sem vitamina A com trocas de meio a cada dois dias. Para induzir a produção de neurônios, mude para DM com vitamina A (ácido retinóico, AR) após 13 dps para organoides cerebrais de saguis e macacos rhesus ou 14-15 dps para organoides cerebrais humanos e chimpanzés (Figura 1A). A partir deste ponto, troque o meio a cada 3-4 dias.
       NOTA: Para apoiar a sobrevivência neuronal, o DM com vitamina A pode ser suplementado com 20 μg/mL de neurotrofina humana 3 (NT3), 20 μg/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1 μL/mL de matriz da membrana basal a partir de 40 dps.

3. Eletroporação de organoides cerebrais de primatas

NOTA: Do ponto de vista técnico, a eletroporação de organoides cerebrais pode ser realizada assim que as estruturas semelhantes a ventrículos são pronunciadas o suficiente para serem alvo de microinjeção. A janela de tempo ótima de eletroporação depende da questão biológica e da(s) população(ões) celular(is) de interesse. Por exemplo, se os progenitores apicais (PAs) são o alvo principal, então organoides cerebrais em torno de 30 dps já são adequados. Se progenitores basais (PBs) ou neurônios forem os principais alvos, organoides cerebrais mais antigos com mais de 50 dps devem ser usados (ver, por exemplo, Fischer et ^al.28).

1. Preparação do setup da eletroporação
   NOTA: A eficiência da eletroporação é fortemente afetada pelo tamanho e pela concentração do(s) plasmídeo(s) eletroporado(s) (veja a seção de discussão para detalhes).
   1. Preparar uma quantidade suficiente de mistura de eletroporação para o controle e gene de interesse (GOI), por exemplo, 10 μL de mistura de eletroporação para cada controle e GOI para eletroporar aproximadamente 30 organoides cerebrais por condição.
      NOTA: Para a composição das misturas de eletroporação, ver Tabela 3.
   2. Pré-quente (não estéril) Dulbecco's modificado Eagle meio/nutriente mistura F-12 (DMEM/F12) e MS com vitamina A a 37 °C. Prepare uma espátula pequena e uma tesoura fina e normal, e borrife os instrumentos com etanol 70% (vol/vol).
      NOTA: As etapas a seguir podem ser executadas em condições estéreis ou não estéreis, pois o DM contém antibióticos (consulte a Tabela 2). Em nossa experiência, a ausência de esterilidade nunca causou qualquer contaminação.
   3. Prepare pratos de cultura celular de 35 mm e conecte a câmara de eletrodos da placa de Petri ao eletroporador.
      NOTA: As câmaras de eletrodos de placa de Petri estão disponíveis comercialmente. No entanto, eles podem ser facilmente produzidos de forma econômica (consulte Arquivo Suplementar 1).
   4. Usando pontas de microcarregador, preencha as agulhas de microinjeção com 8 μL de cada mistura de eletroporação. Corte as pontas das agulhas usando uma tesoura fina antes do primeiro uso para obter um fluxo estável. No entanto, remova apenas uma pequena parte da ponta, pois uma ponta romba e larga pode danificar gravemente os organoides.
      NOTA: As agulhas de microinjeção estão disponíveis comercialmente como agulhas de microinjeção pré-puxadas ou podem ser puxadas no laboratório se um extrator de agulha estiver disponível. Siga as instruções do fabricante do extrator de agulhas para gerar agulhas de microinjeção com uma conicidade longa e um diâmetro de ponta de 10 μm.
2. Microinjeção e eletroporação
   1. Sob um microscópio, escolha cinco organoides cerebrais com bordas lisas e estruturas ventriculares claramente visíveis. Mova-os para uma placa de cultura celular de 35 mm contendo DMEM/F12 pré-aquecido (37 °C) usando uma ponteira de pipeta cortada de 1.000 μL.
      NOTA: Escolha organoides cerebrais com estruturas ventrículas pronunciadas e acessíveis (ver Figura 1B).
   2. Para injetar uma estrutura semelhante a um ventrículo, insira cuidadosamente a agulha através de sua parede e infunda-a com a mistura de eletroporação até ficar visivelmente preenchida. Não aplique pressão excessiva sobre estruturas semelhantes a ventrículos para evitar que elas estourem. Proceder com seis a oito estruturas ventriculares de cada organoide cerebral desta maneira.
      NOTA: Se a agulha ficar entupida durante o processo de microinjeção, a ponta precisa ser ligeiramente aparada.
   3. Transferir um organoide cerebral microinjetado para a câmara do eletrodo da placa de Petri com uma pequena quantidade de DMEM/F12. Dispor o organoide de forma que as superfícies das estruturas semelhantes a ventrículos microinjetados estejam voltadas para o eletrodo conectado ao polo positivo do eletroporador.
      NOTA: Orientar as estruturas desta forma garante que as células sejam transfectadas no lado da estrutura semelhante ao ventrículo que não é afetada por uma estrutura adjacente.
   4. Eletroporar os organoides cerebrais um a um usando as seguintes configurações: 5 pulsos de 80 V, uma duração de pulso de 50 ms e um intervalo de 1 s. Mover os organoides eletroporados para uma nova placa de cultura celular de 35 mm preenchida com DMEM/F12 pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: As configurações de eletroporação podem depender do eletroporador de onda quadrada disponível. Essas configurações são otimizadas para o sistema de eletroporação referenciado. O aumento da tensão pode levar ao deslocamento das células.
   5. Proceder da mesma maneira com os próximos cinco organoides cerebrais usando a segunda mistura de eletroporação (por exemplo, GOI).
      NOTA: Repita os passos 3.2.1-3.2.5 até atingir o número desejado de organoides cerebrais electroporados.
   6. Se a microinjeção e a eletroporação foram conduzidas em condições não estéreis, transferir os organoides eletroporados para uma placa de cultura celular estéril de 35 mm sob uma capela de fluxo laminar enquanto move o mínimo possível de DMEM/F12 para a nova placa de cultura celular.
3. Posterior cultura e fixação de organoides cerebrais
   1. Cultivar organoides eletroporados em MS com vitamina A em agitador orbital a 55 rpm em atmosfera umedecida de 5% CO₂ e 95% de ar a 37 °C.
   2. No dia seguinte após a eletroporação, verificar os organoides cerebrais quanto ao sucesso da eletroporação em microscópio convencional de fluorescência invertida.
      NOTA: Dependendo do comprimento da cultura adicional após a eletroporação, diferentes populações de células dentro do organoide cerebral são afetadas (ver também a seção de resultados representativos).
   3. Prosseguir com as aplicações a jusante após a cultura dos organoides cerebrais eletroporados por um período de tempo adequado à questão biológica de interesse.
      NOTA: Os organoides cerebrais eletroporados podem ser processados para diferentes aplicações a jusante (por exemplo, fixação para coloração de imunofluorescência ou snap-frozen para isolamento de RNA e qRT-PCR). Descrevemos aqui a fixação de organoides cerebrais eletroporados.
   4. Transfira os organoides eletroporados para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL usando uma ponta de pipeta cortada de 1.000 μl e remova o excesso de meio.
   5. Adicionar uma quantidade suficiente de paraformaldeído (PFA) a 4% em DPBS (pH 7,5) e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
      CUIDADO: O PFA é classificado como cancerígeno humano e pode causar danos irreparáveis à saúde. Medidas de precaução adicionais, incluindo luvas e óculos de nitrilo são fortemente recomendadas.
   6. Aspirar o PFA, adicionar 5 mL de DPBS, agitar um pouco e aspirar o DPBS. Repita isso 2x. Conservar os organoides em DPBS a 4 °C até nova utilização.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, pois os organoides cerebrais fixados em PFA podem ser armazenados a 4 °C por vários meses. Os organoides eletroporados fixados em PFA podem ser analisados pela criossecção e imunofluorescência^10,28 ou pela coloração e clareamento de montagem total ^35,36. Por exemplo, imagens, consulte a seção de resultados representativos (consulte a Tabela 4 para obter detalhes sobre anticorpos).

O protocolo aqui descrito permite a geração eficiente de organoides cerebrais a partir de linhagens iPSC de saguis, chimpanzés, macacos rhesus e saguis comuns, com mínimas alterações de tempo necessárias entre as espécies (Figura 1A). Esses organoides podem ser eletroporados na faixa de 20 dps a 50 dps, dependendo da acessibilidade das estruturas semelhantes aos ventrículos e da abundância da(s) população(ões) celular(is) de interesse. No entanto, antes da eletroporação, é importante determinar se os organoides cerebrais são de qualidade suficiente para serem eletroporados.

Um organoide cerebral ideal para eletroporação deve exibir estruturas ventriculares brilhantes pronunciadas na periferia, sem sinais de degeneração (por exemplo, células destacadas, núcleo apoptótico aumentado) e uma morfologia saudável geralmente compacta (por exemplo, sem crescimento excessivo) (Figura 1B, "Go"). É preferível escolher organoides cerebrais com estruturas grandes, bem organizadas e semelhantes a ventrículos para atingir um número maior de células. Se a zona periférica de um organoide for escura e não apresentar estruturas salientes, recomenda-se não usá-la para eletroporação, pois as microinjeções precisas podem ser comprometidas pela falta de pistas visuais (Figura 1B, "No-go"). Para alcançar uma morfologia organoide cerebral ótima, é essencial garantir que etapas críticas, como a indução do neuroectoderma e a incorporação da matriz, sejam bem oportunas. Problemas relacionados à morfologia organoide cerebral tipicamente se originam de falha na formação de brotos neuroectodermas e/ou neuroepiteliais. Isso normalmente é causado pelo tempo subótimo da indução neural e/ou da incorporação da matriz da membrana basal e pode ser resolvido ajustando o tempo dessas etapas (outras dicas de solução de problemas para a formação de organoides cerebrais podem ser encontradas em Lancaster e Knoblich34).

Após a eletroporação, uma primeira avaliação de seu sucesso e de sua eficiência pode ser realizada após 12 h, quando a expressão de GFP das células transfectadas torna-se detectável em microscópio convencional de fluorescência invertida. Idealmente, nessa fase, múltiplas estruturas ventriculares emitem fluorescência verde brilhante localizada em um de seus lados (Figura 2A). Isso indica a alta precisão e eficiência do procedimento. Organoides cerebrais eletroporados com sucesso das quatro diferentes espécies de primatas (isto é, humano, chimpanzé, macaco rhesus e sagui-comum) mostram padrões semelhantes positivos para GFP dentro das estruturas semelhantes a ventrículos-alvo (Figura 2A). Além disso, após a fixação e criossecção de organoides cerebrais de primatas eletroporados, estruturas semelhantes a ventrículos eletroporadas com sucesso de todas as quatro espécies exibem colunas de células positivas para GFP dentro da zona ventricular (VZ) densamente organizada e densamente organizada (Figura 2B). A quantificação das células DAPI-positivas que também foram positivas para GFP em tais regiões dos organoides cerebrais de chimpanzé e saguis 2 dias após a eletroporação (17 ventrículos de 12 organoides quantificados) mostrou que, em média, cerca de um terço das células (33%, SD ± 12%) foram eletroporadas com sucesso.

As eletroporações subótimas são marcadas por um pequeno número de células positivas para GFP dentro da estrutura semelhante ao ventrículo (Figura 3A) ou por algumas células positivas para GFP distantes de qualquer estrutura semelhante a um ventrículo (Figura 3B). Um baixo número de células positivas para GFP é causado por uma baixa captação de plasmídeos. Isso pode ser devido a uma baixa concentração de plasmídios causada por uma quantidade insuficiente de mistura de eletroporação microinjetada ou devido a pulsos elétricos que não são bem direcionados, o que pode ser causado pelo posicionamento subótimo dos organoides cerebrais na câmara de eletrodos da placa de Petri. Um baixo número de células positivas para GFP distantes de qualquer estrutura semelhante a um ventrículo é causado pela eletroporação de células pós-mitóticas dentro do organoide cerebral (por exemplo, neurônios) devido a uma microinjeção imprecisa. Essas eletroporações subótimas precisam ser excluídas de qualquer análise posterior.

A identificação confiável dos tipos celulares presentes nos organoides cerebrais é baseada, entre outras coisas, na posição da célula dentro de uma estrutura semelhante a um ventrículo, o que requer uma definição de fronteira entre a VZ e a zona enriquecida com SVZ/neurônio. Essa borda pode ser identificada pela organização radial e características de alta densidade de núcleos celulares do VZ (ver coloração DAPI na Figura Suplementar S1). A confirmação da borda VZ/SVZ pode ser realizada pela coloração por imunofluorescência para marcadores progenitores neurais como PAX6 ou SOX2, que são expressos por praticamente todas as células VZ (PAs) e algumas células SVZ (BPs). A presença de uma zona enriquecida com neurônios pode ser validada pela coloração de imunofluorescência para marcadores neuronais como classe III β-tubulina (TUJ1) ou NeuN (Figura Suplementar S1).

A duração da cultura de organoides cerebrais pós-eletroporação depende da questão biológica e das populações celulares de interesse. Em um estudo recente, demonstrou-se que diferentes comprimentos de cultura após eletroporação afetam diferentes populações celulares em organoides cerebrais de chimpanzés, variando de APs a neurônios da camadasuperior24. Aqui, mostramos resultados semelhantes para organoides de saguis eletroporados. Especificamente, 2 dias após a eletroporação, as células positivas para GFP estão quase exclusivamente localizadas no VZ e também são positivas para PAX6 – um marcador para células progenitoras neurais – indicando que essas células são PAs ou PA recém-nascidos (Figura 4A). Se o período de cultura após a eletroporação for estendido para 10 dias, as células positivas para GFP estarão localizadas nas regiões basais (isto é, a SVZ e a zona enriquecida de neurônios) (Figura 4B,C). Essas células também podem (além do sinal da GFP) ser positivas para PAX6 (Figura 4B), que é indicativa de PAs, ou NeuN (Figura 4C), que é indicativa de neurônios. Resultados semelhantes podem ser obtidos para organoides cerebrais eletroporados humanos e macacos rhesus. Em resumo, diferentes tipos de progenitores, bem como neurônios, podem ser alvo com sucesso dessa técnica.

Quase todos os dados mostrados anteriormente foram derivados da imunomarcação de cortes histológicos gerados a partir de organoides cerebrais eletroporados. No entanto, outra maneira elegante de analisar esses organoides é realizar imunomarcação de montagem total seguida de clareamento óptico35,36. Isso permitiria a reconstrução 3D dos organoides cerebrais eletroporados para obter uma impressão da distribuição 3D das células positivas para GFP. A Figura 5 e o Vídeo 1 mostram um exemplo representativo do sinal de GFP em um organoide cerebral eletroporado e esclarecido óptico.

Em resumo, o protocolo de eletroporação descrito aqui fornece uma maneira precisa e eficiente de introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios de organoides cerebrais derivados de diferentes linhagens iPSC de primatas.

Figura 1: Visão geral esquemática da geração organoide cerebral de primatas e critérios morfológicos "go" e "no-go" para eletroporação. (A) Linha do tempo da geração e eletroporação de organoides cerebrais de primatas, destacando os diferentes tempos das etapas do protocolo para humanos e chimpanzés (azul), macaco rhesus (violeta) e sagui (magenta). Note que a cronologia da linha do tempo não é para escalar. (B) Imagens de campo brilhante de um organoide cerebral humano adequado (imagem à esquerda, Go) e inadequado (imagem direita, No-go) 32 dps. As pontas de seta indicam exemplos de estruturas semelhantes a ventrículos adequadas para microinjeção. As imagens foram adquiridas em microscópio de fluorescência invertida Zeiss Axio Observer.Z1 com objetiva de 2,5x. Barras de escala = 500 μm. Abreviações: BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro; dps = dias pós-semeadura; NT3 = neurotrofina 3; AR = ácido retinóico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de organoides cerebrais de primatas eletroporados com sucesso . (A) Imagens de campo brilhante (coluna da esquerda), fluorescência (coluna do meio) e fusão (coluna da direita) de 22 dps humanos, 32 dps chimpanzés, 32 dps macaco rhesus e 31 dps sagui organoides cerebrais (de cima para baixo) 15-48 h após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. As pontas de seta pretas indicam exemplos de estruturas individuais semelhantes a ventrículos eletroporados. As imagens foram adquiridas em microscópio de fluorescência invertida Zeiss Axio Observer.Z1 com objetiva de 2,5x. Barras de escala = 500 μm. (B) Imunofluorescência para GFP (verde) combinada com coloração DAPI (ciano) de 32 dps humano, 34 dps chimpanzé, 32 dps macaco rhesus e 32 dps sagui organoides cerebrais (de cima para baixo) 2-4 dias após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. As pontas de seta cinza claro indicam as bordas das regiões eletroporosas dentro das estruturas ventrículo-símile. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 10x. Barras de escala = 150 μm. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = dias pós-semeadura; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplos de organoides cerebrais de primatas eletroporados sem sucesso. (A,B) Imunofluorescência para GFP (verde) combinada com coloração DAPI (ciano) de um organoide cerebral de macaco rhesus (A) 34 dps 4 dias após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP e de (B) um organoide cerebral de macaco rhesus 32 dps 2 dias após a eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. As pontas de seta cinza claro indicam células eletroporadas. O contorno tracejado cinza claro indica a fronteira entre a VZ e a zona enriquecida com SVZ/neurônios de uma estrutura semelhante a um ventrículo adjacente às células eletroporadas. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 10x. Barras de escala = 150 μm. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = dias pós-semeadura; GFP = proteína fluorescente verde; ZVS = zona subventricular; VZ = zona ventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visualização das diversas populações celulares presentes nos organoides cerebrais de primatas após a eletroporação. (A-C) Imunofluorescência dupla para GFP (verde) e PAX6 (A,B; magenta) ou NeuN (C; magenta), em todos os casos combinada com coloração DAPI (ciano), de um organoide cerebral (A) 32 dps sagui 2 dias após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP, e (B,C) de um organoide cerebral de sagui 40 dps 10 dias após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. As pontas de seta cinza-claro indicam (A,B) GFP+ e PAX6+ ou (C) células NeuN+ duplamente positivas. As linhas tracejadas cinza-claro indicam a fronteira entre a zona enriquecida com VZ e SVZ/neurônio. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 20x. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = dias pós-semeadura; GFP = proteína fluorescente verde; NeuN = proteína do núcleo neuronal; PAX6 = proteína caixa 6 pareada; ZVS = zona subventricular; VZ = zona ventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Reconstrução tridimensional de imagens eletroporadas por imagem confocal 3D de organoides cerebrais de primatas eletroporados após clareamento óptico. Cortes frontal (imagem esquerda), 45° rodado (imagem do meio) e 90° rodado (imagem direita) de um organoide cerebral humano 3D reconstruído eletroporado 32 dps 2 dias após a eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. Antes da realização de exames de imagem, o organoide foi opticamente eliminado com base no método 2Eci35. Uma reconstrução 3D de organoide eletroporado total foi gerada a partir de 269 cortes ópticos (1 μM de espessura cada) que estão a 3,73 μm de distância um do outro usando um microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 10x. As imagens foram processadas para reconstrução 3D usando Fiji. Observe que as imagens foram obtidas do mesmo organoide reconstruído em 3D mostrado no Vídeo 1. Barra de escala = 500 μm. Abreviação: GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Um organoide cerebral humano eletroporado reconstruído em 3D após clareamento óptico. Vídeo de um organoide cerebral humano de 32 dps reconstruído em 3D 2 dias após a eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. Antes da realização de exames de imagem, o organoide foi opticamente eliminado com base no método 2Eci35. Uma reconstrução 3D de organoide eletroporado total foi gerada a partir de 269 cortes ópticos (1 μM de espessura cada) que estão a 3,73 μm de distância um do outro usando um microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 10x. As imagens foram processadas para reconstrução 3D usando Fiji. Observe que o vídeo foi retirado do mesmo organoide reconstruído em 3D mostrado na Figura 5. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela 1: Condições de cultura para as iPSCs de primatas utilizadas nesta publicação. Abreviação: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas.

Tabela 2: Composição dos meios utilizados para geração e cultura de organoides cerebrais de primatas.

Tabela 3: Composição da mistura de eletroporação (abordagem de plasmídeos separados) para o controle e gene de interesse. Abreviação: GOI = gene de interesse.

Tabela 4: Anticorpos utilizados para coloração por imunofluorescência.

Figura suplementar S1: Determinação da borda VZ/SVZ em organoides cerebrais de primatas eletroporados. Imunofluorescência dupla para PAX6 (magenta) e TUJ1 (amarelo) combinada com coloração DAPI (ciano) de um organoide cerebral de sagui 32 dps 2 dias após eletroporação com o plasmídeo que expressa GFP. A imunofluorescência para GFP não é mostrada. As linhas tracejadas cinza-claro indicam a fronteira entre a zona enriquecida com VZ e SVZ/neurônio. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal Zeiss LSM 800 com objetiva de 20x. Barra de escala = 100 μm. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; dps = dias pós-semeadura; PAX6 = proteína caixa 6 pareada; ZVS = zona subventricular; TUJ1 = classe III β-tubulina; VZ = zona ventricular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Instruções de montagem da câmara de eletroporação da placa de Petri. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.