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Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

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DOI:

10.3791/65176

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24 de março de 2023

 ,  ,  , 
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

Neste artigo

Resumo

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Resumo

O córtex cerebral é a estrutura cerebral mais externa e é responsável pelo processamento da entrada sensorial e da saída motora; É visto como a sede de habilidades cognitivas de ordem superior em mamíferos, em particular, primatas. Estudar as funções gênicas em cérebros de primatas é um desafio devido a razões técnicas e éticas, mas o estabelecimento da tecnologia organoide cerebral permitiu o estudo do desenvolvimento cerebral em modelos tradicionais de primatas (por exemplo, macaco rhesus e sagui-comum), bem como em espécies de primatas anteriormente inacessíveis experimentalmente (por exemplo, grandes macacos), em um sistema eticamente justificável e menos exigente tecnicamente. Além disso, organoides cerebrais humanos permitem a investigação avançada de distúrbios neurológicos e do neurodesenvolvimento.

Como os organoides cerebrais recapitulam muitos processos de desenvolvimento cerebral, eles também representam uma ferramenta poderosa para identificar diferenças e comparar funcionalmente os determinantes genéticos subjacentes ao desenvolvimento cerebral de várias espécies em um contexto evolutivo. Uma grande vantagem do uso de organoides é a possibilidade de introduzir modificações genéticas, o que permite testar as funções dos genes. No entanto, a introdução de tais modificações é trabalhosa e cara. Este artigo descreve uma abordagem rápida e econômica para modificar geneticamente populações celulares dentro das estruturas semelhantes a ventrículos de organoides cerebrais de primatas, um subtipo de organoides cerebrais. Este método combina um protocolo modificado para a geração confiável de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de saguis humanos, chimpanzés, macacos rhesus e saguis comuns com uma abordagem de microinjeção e eletroporação. Isso fornece uma ferramenta eficaz para o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos que também pode ser aplicada para modelagem de doenças.

Introdução

Investigar o desenvolvimento (pato)fisiológico e a evolução do córtex cerebral é uma tarefa formidável que é dificultada pela falta de sistemas modelo adequados. Anteriormente, tais estudos estavam confinados a modelos bidimensionais de cultura celular (como progenitor neural primário ou culturas de células neuronais) e modelos animais evolutivamente distantes (como roedores)1,2. Embora esses modelos sejam úteis para abordar certas questões, eles são limitados na modelagem da complexidade, composição do tipo celular, arquitetura celular e padrões de expressão gênica do neocórtex humano em desenvolvimento em estados saudáveis e doentes. Essas limitações levam, por exemplo, à baixa traduzibilidade de modelos murinos de doenças humanas para a situação humana, como descrito para certos casos de microcefalia (por exemplo, Zhang et al.3). Recentemente, primatas não humanos transgênicos, que são um modelo evolutiva, funcional e morfologicamente mais próximo do desenvolvimento do neocórtex humano, têm entrado em foco 4,5,6,7,8 à medida que superam muitas limitações dos modelos baseados em cultura celular e roedores. No entanto, o uso de primatas não humanos em pesquisas não é apenas altamente caro e demorado, mas também levanta preocupações éticas. Mais recentemente, o desenvolvimento da tecnologia de organoidescerebrais9,10 surgiu como uma alternativa promissora que resolve muitas das limitações de modelos anteriores11,12,13,14,15,16.

Os organoides cerebrais são estruturas tridimensionais (3D), multicelulares, que emulam as principais características da citoarquitetura e composição celular-tipo de uma ou múltiplas regiões cerebrais para uma janela de tempo de desenvolvimento definida11,12,13,14,17. Essas estruturas 3D são geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou, se disponíveis para a espécie de interesse, a partir de células-tronco embrionárias (CTEs). Em geral, dois tipos de organoides cerebrais podem ser distinguidos com base na metodologia utilizada: organoides cerebrais não guiados e regionalizados (guiados)18. Na geração deste último tipo de organoides, são fornecidas pequenas moléculas ou fatores que orientam a diferenciação das células-tronco pluripotentes em organoides de uma determinada região do cérebro (por exemplo, organoides do prosencéfalo)18. Por outro lado, em organoides não guiados, a diferenciação não é guiada pela adição de pequenas moléculas, mas depende exclusivamente da diferenciação espontânea das iPSCs/ESCs. Os organoides cerebrais resultantes consistem em tipos celulares que representam diferentes regiões cerebrais (por exemplo, organoides cerebrais)18. Os organoides cerebrais combinam muitas características-chave do desenvolvimento cerebral com uma geração relativamente eficiente em termos de custo e tempo a partir de qualquer espécie de interesse para a qual as iPSCs ou ESCs estejam disponíveis11,12,13,14. Isso faz dos organoides cerebrais um excelente modelo para muitos tipos de estudos neurobiológicos, desde questões evolutivas e de desenvolvimento até modelagem de doenças e testes de drogas15,16. No entanto, a abordagem de tais questões usando organoides cerebrais depende fortemente da disponibilidade de diferentes métodos para modificação genética.

Um aspecto fundamental do estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução é a análise funcional de genes e variantes gênicas. Isso geralmente é conseguido pela expressão (ectópica) e/ou por knock-down (KD) ou knock-out (KO) desses genes. Tais modificações genéticas podem ser classificadas em modificações genéticas estáveis e transitórias, bem como em modificações restritas temporal e espacialmente ou não restritas. A modificação genética estável é definida pela introdução de uma alteração genética no genoma do hospedeiro que é transmitida a todas as gerações celulares subsequentes. Dependendo do momento da modificação genética, pode afetar todas as células de um organoide ou pode ser restrito a determinadas populações celulares. Mais frequentemente, a modificação genética estável é obtida em organoides cerebrais no nível iPSC/ESC através da aplicação de lentivírus, sistemas semelhantes a transposons e a tecnologia CRISPR/Cas9 (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20). Isso tem a vantagem de que todas as células do organoide cerebral carregam a modificação genética e que ela não é restrita temporal ou espacialmente. No entanto, a geração e a caracterização dessas linhagens estáveis de iPSC/ESC são muito demoradas, muitas vezes levando vários meses até que os primeiros organoides cerebrais modificados possam ser analisados (revisados por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 ou Teriyapirom et al.20).

Em contraste, a modificação genética transitória é definida pela entrega de carga genética (por exemplo, um plasmídeo de expressão gênica) que não se integra ao genoma do hospedeiro. Embora essa modificação possa, em princípio, ser passada para as gerações celulares subsequentes, a carga genética entregue será progressivamente diluída a cada divisão celular. Portanto, esse tipo de modificação genética costuma ser restrita temporal e espacialmente. A modificação genética transitória pode ser realizada em organoides cerebrais por vírus adenoassociados ou por eletroporação (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20), sendo esta última descrita em detalhes neste artigo. Em contraste com a modificação genética estável, esta abordagem é muito rápida e econômica. De fato, a eletroporação pode ser realizada em poucos minutos e, dependendo da(s) população(ões) de células-alvo, os organoides eletroporados estão prontos para análise em poucos dias (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19). No entanto, alterações morfológicas macroscópicas do organoide cerebral, como diferenças de tamanho, não podem ser detectadas por esse método, pois esse tipo de modificação genética é restrita temporal e espacialmente. Essa restrição também pode ser uma vantagem, por exemplo, no caso de estudar populações celulares individuais dentro do organoide ou os efeitos sobre organoides cerebrais em momentos específicos de desenvolvimento (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19).

Uma abordagem clássica para estudar a função gênica durante o desenvolvimento e evolução cerebral é a eletroporação in utero. A eletroporação in utero é uma técnica bem conhecida e útil para a liberação de construções de expressão gênica em cérebros de roedores 21,22,23 e furões 24,25. Primeiro, uma solução contendo o(s) construto(s) de expressão de interesse é microinjetada através da parede uterina em um determinado ventrículo do cérebro embrionário, dependendo da região a ser alvo. Na segunda etapa, pulsos elétricos são aplicados para transfectar as células que revestem diretamente o ventrículo alvo. Essa abordagem não se limita apenas à expressão ectópica ou à superexpressão de genes, como também pode ser aplicada em estudos de KD ou KO por microinjeção de hairpin curto (shRNA) ou CRISPR/Cas9 (na forma de plasmídeos de expressão ou ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente26,27. No entanto, a eletroporação in utero de embriões de camundongos, ratos e furões tem as mesmas limitações descritas acima para esses modelos animais.

O ideal seria realizar eletroporação in utero diretamente em primatas. Embora isso seja, em princípio, tecnicamente possível, a eletroporação in utero não é realizada em primatas devido a preocupações éticas, altos custos de manutenção animal e pequenos tamanhos de ninhada. Para certos primatas, como grandes símios (incluindo humanos), isso não é possível. No entanto, esses primatas têm o maior potencial para o estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex humano e sua evolução. Uma solução para esse dilema é aplicar a técnica de eletroporação aos organoides cerebrais de primatas28.

Este trabalho apresenta um protocolo para a eletroporação de um subtipo de organoides cerebrais de primatas, organoides cerebrais de primatas. Essa abordagem permite a modificação genética rápida e econômica de populações celulares dentro das estruturas semelhantes aos ventrículos dos organoides. Especificamente, descrevemos um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas a partir de iPSCs humanas (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) e sagui-comum (Callithrix jacchus). Além disso, descrevemos a técnica de microinjeção e eletroporação em detalhes e fornecemos critérios "go" e "no-go" para a realização da eletroporação organoide cerebral de primatas. Esta abordagem é uma ferramenta eficaz para estudar o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução em um modelo especialmente próximo da situação humana.

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Protocolo

1. Cultura de iPSCs de primatas

NOTA: Devido à sua robustez, o método aqui apresentado pode ser aplicado a qualquer linhagem iPSC de primatas. Neste artigo, descrevemos a produção de organoides cerebrais a partir de linhagens iPSC humana (iLonza2.2)29, chimpanzé (Sandra A)30, macaco rhesus (iRh33.1)29 e sagui-comum (cj_160419_5)31. As condições de cultivo estão resumidas na Tabela 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo.

  1. Para o cultivo das respectivas iPSCs, siga as condições de cultura originalmente descritas. Em geral, para o sucesso da geração e eletroporação de organoides cerebrais, use linhas iPSC que não tenham sido cultivadas por mais de 90 passagens. Além disso, no início da geração de organoides cerebrais, certifique-se de que as iPSCs exibem características de pluripotência sem sinais de diferenciação.

2. Geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs de primatas

NOTA: O protocolo para geração de organoides cerebrais é baseado em uma versão modificada 28,30,32,33 do protocolo organoide cerebral original 10,34 com algumas modificações espécie-específicas (detalhadas abaixo).

  1. Semeadura de iPSCs para geração de corpos embrionários (EBs)
    1. Uma vez que as iPSCs tenham atingido 80%-90% de confluência, lave-as com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco e adicione 500 μL de substituto de tripsina recombinante ou 1 mL de mistura proteolítica e colagenolítica.
      NOTA: Normalmente, as iPSCs são cultivadas em uma placa de cultura celular de 60 mm para obter aproximadamente 900.000 células, o que é suficiente para gerar 96 organoides cerebrais. Os números de células podem ser ajustados dependendo do número de organoides necessários. Esteja ciente de que nem todos os organoides cerebrais gerados podem ser adequados para eletroporação.
    2. Incubar a placa a 37 °C durante 2 minutos para separar as células.
      NOTA: Até 2 minutos adicionais de incubação a 37 °C podem ser necessários, dependendo da linha iPSC ou da enzima utilizada. É aconselhável examinar o prato sob um microscópio para garantir que as células começaram a se desprender.
    3. Adicionar 1,5 ml de meio de cultura iPSC pré-aquecido (37 °C) para parar a reacção e pipetar para cima e para baixo 7x-10x (não mais de 10x) para dissociar as células da placa de cultura celular e obter uma suspensão de célula única.
    4. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrifugar as células a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente.
    5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 2 mL de meio de cultura iPSC suplementado com 50 μM Y27632 ou 50 μM de composto pró-sobrevivência.
    6. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células usando uma câmara de Neubauer.
    7. Ajustar a suspensão celular para uma concentração de 9.000 células por 150 μL (60.000 células/mL) usando meio de cultura iPSC suplementado com 50 μM Y27632 ou 50 μM composto pró-sobrevivência.
    8. Para gerar corpos embrionários (EBs), semeie 150 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Durante a pipetagem, agite suavemente o tubo que contém a suspensão celular para evitar que as células se sedimentem.
    9. Cultivar os EBs em atmosfera humificada de 5% CO2 e 95% de ar a 37 °C (0 dias pós-semeadura [dps]). Não perturbe os EBs nas primeiras 24 h após a semeadura.
      NOTA: EBs gerados a partir de iPSCs de saguis precisam ser cultivados em atmosfera humificada sob condições hipóxicas (5% CO 2, 5% O 2 e 90% N 2) a 37 °C.
    10. Após ~48 h (2 dps), troque o meio para meio de cultura iPSC sem composto Y27632/pró-sobrevivência. Remover 100 μL de meio por poço e adicionar 150 μL de meio fresco pré-aquecido (37 °C) sem Y27632. Vá linha por linha.
    11. Realizar novas trocas de meios a cada dois dias; remover 150 μL de meio de cada poço e adicionar 150 μL de meio fresco pré-aquecido (37 °C) sem Y27632/composto pró-sobrevivência por poço.
      NOTA: Após 4-5 dps, a periferia dos EBs deve tornar-se translúcida.
  2. Indução de neuroectoderma
    NOTA: Em geral, os EBs de boa qualidade devem ter contornos suaves e bordas translúcidas nesta fase. Os pontos de tempo de indução neural diferem ligeiramente entre as espécies de primatas e as linhas iPSC. No caso das linhagens celulares usadas aqui (ver seção 1 e Tabela de Materiais), a indução neural para EBs de saguis geralmente precisa ser iniciada em 4 dps, para macaco rhesus em 5 dps e para EBs humanos e chimpanzés em 4-5 dps (Figura 1A), dependendo do estado dos EBs (veja acima).
    1. Remover 150 μL de meio de cada poço da primeira fileira da placa de 96 poços e adicionar 150 μL de meio de indução neural pré-aquecido (37 °C) (ver Tabela 2) por poço na mesma linha.
    2. Continue trocando o meio conforme descrito acima, linha por linha, para toda a placa de 96 poços. Realizar novas mudanças no meio de indução neural (NIM) a cada dois dias, removendo 150 μL de NIM de cada poço e adicionando 150 μL de NIM fresco pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: A partir deste ponto, os EBs de sagui devem ser cultivados nas mesmas condições que os outros EBs de primatas (atmosfera humificada de 5% CO2 e 95% de ar a 37 °C).
  3. Incorporação na matriz da membrana basal
    NOTA: Uma vez que as EBs tenham desenvolvido um neuroepitélio pronunciado, translúcido e radialmente organizado na superfície, é necessário fornecer suporte estrutural para o desenvolvimento de estruturas semelhantes a ventrículos. Isso é conseguido incorporando os EBs em uma matriz de membrana basal. Devido às diferenças nas taxas de desenvolvimento, os EBs de sagui e macaco rhesus estão prontos para incorporação já em 7 dps, enquanto os EBs humanos e chimpanzés são geralmente incorporados em 8-9 dps. Para simplificar, a matriz da membrana basal refere-se apenas ao Matrigel neste protocolo. No entanto, Geltrex pode ser usado como um substituto.
    1. Em preparação para incorporação, tesoura UV-esterilizar, pinças, um pequeno rack para tubos de 0,2 mL e três a seis quadrados de parafilme tratados com etanol 70% (vol/vol) sob a capela de fluxo laminar por 15 min. Deixe a matriz da membrana basal descongelar no gelo por várias horas (~1,5 mL de matriz da membrana basal é geralmente suficiente para 96 EBs).
      NOTA: Mantenha sempre a matriz da membrana basal no gelo.
    2. Crie uma grade de covinhas 4 x 4 no parafilme. Coloque a grade do parafilme no rack de tubo de 0,2 mL de modo que o lado envelopado em papel fique voltado para cima e pressione suavemente um dedo enluvado contra cada orifício do rack.
    3. Remova o papel e corte a grade de covinha do quadrado de parafilme usando tesoura para ajustar seu tamanho para caber em uma placa de cultura de células de 60 mm. Coloque o parafilme ondulado de volta no rack de tubo de 0,2 mL para fornecer uma base para a geração de gotículas da matriz da membrana basal.
    4. Usando uma pipeta com uma ponta de pipeta cortada de 200 μL, transfira cuidadosamente os EBs, um após o outro, do poço do prato de cultura para as covinhas de parafilme.
    5. Depois de mover 16 EBs para a grade, pegue uma nova ponta de pipeta de 200 μL e remova o meio restante das covinhas.
    6. Pipetar uma gota (~15 μL) de matriz de membrana basal em cada covinha contendo um EB.
    7. Pegue uma ponta de pipeta de 10 μL e mova rapidamente os EBs para o centro de cada gotícula sem perturbar as bordas da gotícula.
    8. Coloque o parafilme ondulado com as gotas da matriz da membrana basal em uma placa de cultura de células de 60 mm e incube por 15-30 min a 37 °C para permitir que a matriz se polimerize.
    9. Para separar os EBs embutidos em matriz do parafilme, adicione 5 mL de meio de diferenciação ( MS) sem vitamina A ( ver Tabela 2) à placa e vire o quadrado do parafilme de cabeça para baixo usando pinças de modo que o lado com os EBs fique voltado para o fundo da placa.
    10. Agite cuidadosamente a placa para que as gotas da matriz da membrana basal contendo os EBs se desprendam do parafilme. Se alguns deles ainda estiverem presos, pegue uma borda do quadrado de parafilme usando pinças e enrole-o rapidamente em direção ao centro do prato várias vezes.
    11. Cultivar os organoides cerebrais em agitador orbital a 55 rpm em atmosfera umedecida de 5% de CO2 e 95% de ar a 37 °C. Mantenha-os em DM sem vitamina A com trocas de meio a cada dois dias. Para induzir a produção de neurônios, mude para DM com vitamina A (ácido retinóico, AR) após 13 dps para organoides cerebrais de saguis e macacos rhesus ou 14-15 dps para organoides cerebrais humanos e chimpanzés (Figura 1A). A partir deste ponto, troque o meio a cada 3-4 dias.
      NOTA: Para apoiar a sobrevivência neuronal, o DM com vitamina A pode ser suplementado com 20 μg/mL de neurotrofina humana 3 (NT3), 20 μg/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1 μL/mL de matriz da membrana basal a partir de 40 dps.

3. Eletroporação de organoides cerebrais de primatas

NOTA: Do ponto de vista técnico, a eletroporação de organoides cerebrais pode ser realizada assim que as estruturas semelhantes a ventrículos são pronunciadas o suficiente para serem alvo de microinjeção. A janela de tempo ótima de eletroporação depende da questão biológica e da(s) população(ões) celular(is) de interesse. Por exemplo, se os progenitores apicais (PAs) são o alvo principal, então organoides cerebrais em torno de 30 dps já são adequados. Se progenitores basais (PBs) ou neurônios forem os principais alvos, organoides cerebrais mais antigos com mais de 50 dps devem ser usados (ver, por exemplo, Fischer et al.28).

  1. Preparação do setup da eletroporação
    NOTA: A eficiência da eletroporação é fortemente afetada pelo tamanho e pela concentração do(s) plasmídeo(s) eletroporado(s) (veja a seção de discussão para detalhes).
    1. Preparar uma quantidade suficiente de mistura de eletroporação para o controle e gene de interesse (GOI), por exemplo, 10 μL de mistura de eletroporação para cada controle e GOI para eletroporar aproximadamente 30 organoides cerebrais por condição.
      NOTA: Para a composição das misturas de eletroporação, ver Tabela 3.
    2. Pré-quente (não estéril) Dulbecco's modificado Eagle meio/nutriente mistura F-12 (DMEM/F12) e MS com vitamina A a 37 °C. Prepare uma espátula pequena e uma tesoura fina e normal, e borrife os instrumentos com etanol 70% (vol/vol).
      NOTA: As etapas a seguir podem ser executadas em condições estéreis ou não estéreis, pois o DM contém antibióticos (consulte a Tabela 2). Em nossa experiência, a ausência de esterilidade nunca causou qualquer contaminação.
    3. Prepare pratos de cultura celular de 35 mm e conecte a câmara de eletrodos da placa de Petri ao eletroporador.
      NOTA: As câmaras de eletrodos de placa de Petri estão disponíveis comercialmente. No entanto, eles podem ser facilmente produzidos de forma econômica (consulte Arquivo Suplementar 1).
    4. Usando pontas de microcarregador, preencha as agulhas de microinjeção com 8 μL de cada mistura de eletroporação. Corte as pontas das agulhas usando uma tesoura fina antes do primeiro uso para obter um fluxo estável. No entanto, remova apenas uma pequena parte da ponta, pois uma ponta romba e larga pode danificar gravemente os organoides.
      NOTA: As agulhas de microinjeção estão disponíveis comercialmente como agulhas de microinjeção pré-puxadas ou podem ser puxadas no laboratório se um extrator de agulha estiver disponível. Siga as instruções do fabricante do extrator de agulhas para gerar agulhas de microinjeção com uma conicidade longa e um diâmetro de ponta de 10 μm.
  2. Microinjeção e eletroporação
    1. Sob um microscópio, escolha cinco organoides cerebrais com bordas lisas e estruturas ventriculares claramente visíveis. Mova-os para uma placa de cultura celular de 35 mm contendo DMEM/F12 pré-aquecido (37 °C) usando uma ponteira de pipeta cortada de 1.000 μL.
      NOTA: Escolha organoides cerebrais com estruturas ventrículas pronunciadas e acessíveis (ver Figura 1B).
    2. Para injetar uma estrutura semelhante a um ventrículo, insira cuidadosamente a agulha através de sua parede e infunda-a com a mistura de eletroporação até ficar visivelmente preenchida. Não aplique pressão excessiva sobre estruturas semelhantes a ventrículos para evitar que elas estourem. Proceder com seis a oito estruturas ventriculares de cada organoide cerebral desta maneira.
      NOTA: Se a agulha ficar entupida durante o processo de microinjeção, a ponta precisa ser ligeiramente aparada.
    3. Transferir um organoide cerebral microinjetado para a câmara do eletrodo da placa de Petri com uma pequena quantidade de DMEM/F12. Dispor o organoide de forma que as superfícies das estruturas semelhantes a ventrículos microinjetados estejam voltadas para o eletrodo conectado ao polo positivo do eletroporador.
      NOTA: Orientar as estruturas desta forma garante que as células sejam transfectadas no lado da estrutura semelhante ao ventrículo que não é afetada por uma estrutura adjacente.
    4. Eletroporar os organoides cerebrais um a um usando as seguintes configurações: 5 pulsos de 80 V, uma duração de pulso de 50 ms e um intervalo de 1 s. Mover os organoides eletroporados para uma nova placa de cultura celular de 35 mm preenchida com DMEM/F12 pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: As configurações de eletroporação podem depender do eletroporador de onda quadrada disponível. Essas configurações são otimizadas para o sistema de eletroporação referenciado. O aumento da tensão pode levar ao deslocamento das células.
    5. Proceder da mesma maneira com os próximos cinco organoides cerebrais usando a segunda mistura de eletroporação (por exemplo, GOI).
      NOTA: Repita os passos 3.2.1-3.2.5 até atingir o número desejado de organoides cerebrais electroporados.
    6. Se a microinjeção e a eletroporação foram conduzidas em condições não estéreis, transferir os organoides eletroporados para uma placa de cultura celular estéril de 35 mm sob uma capela de fluxo laminar enquanto move o mínimo possível de DMEM/F12 para a nova placa de cultura celular.
  3. Posterior cultura e fixação de organoides cerebrais
    1. Cultivar organoides eletroporados em MS com vitamina A em agitador orbital a 55 rpm em atmosfera umedecida de 5% CO2 e 95% de ar a 37 °C.
    2. No dia seguinte após a eletroporação, verificar os organoides cerebrais quanto ao sucesso da eletroporação em microscópio convencional de fluorescência invertida.
      NOTA: Dependendo do comprimento da cultura adicional após a eletroporação, diferentes populações de células dentro do organoide cerebral são afetadas (ver também a seção de resultados representativos).
    3. Prosseguir com as aplicações a jusante após a cultura dos organoides cerebrais eletroporados por um período de tempo adequado à questão biológica de interesse.
      NOTA: Os organoides cerebrais eletroporados podem ser processados para diferentes aplicações a jusante (por exemplo, fixação para coloração de imunofluorescência ou snap-frozen para isolamento de RNA e qRT-PCR). Descrevemos aqui a fixação de organoides cerebrais eletroporados.
    4. Transfira os organoides eletroporados para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL usando uma ponta de pipeta cortada de 1.000 μl e remova o excesso de meio.
    5. Adicionar uma quantidade suficiente de paraformaldeído (PFA) a 4% em DPBS (pH 7,5) e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
      CUIDADO: O PFA é classificado como cancerígeno humano e pode causar danos irreparáveis à saúde. Medidas de precaução adicionais, incluindo luvas e óculos de nitrilo são fortemente recomendadas.
    6. Aspirar o PFA, adicionar 5 mL de DPBS, agitar um pouco e aspirar o DPBS. Repita isso 2x. Conservar os organoides em DPBS a 4 °C até nova utilização.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, pois os organoides cerebrais fixados em PFA podem ser armazenados a 4 °C por vários meses. Os organoides eletroporados fixados em PFA podem ser analisados pela criossecção e imunofluorescência10,28 ou pela coloração e clareamento de montagem total 35,36. Por exemplo, imagens, consulte a seção de resultados representativos (consulte a Tabela 4 para obter detalhes sobre anticorpos).

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Resultados

O protocolo aqui descrito permite a geração eficiente de organoides cerebrais a partir de linhagens iPSC de saguis, chimpanzés, macacos rhesus e saguis comuns, com mínimas alterações de tempo necessárias entre as espécies (Figura 1A). Esses organoides podem ser eletroporados na faixa de 20 dps a 50 dps, dependendo da acessibilidade das estruturas semelhantes aos ventrículos e da abundância da(s) população(ões) celular(is) de interesse. No entanto, antes da eletroporação, é importante determi...

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Discussão

Os procedimentos aqui descritos representam um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de diferentes espécies de primatas com uma abordagem de eletroporação direcionada. Isso permite a expressão ectópica de um GOI em um sistema modelo que emula o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex de primatas (incluindo humanos). Este protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas usa os mesmos materiais (por exemplo, mídia) e etapas de protocolo para todas as quatro espécies de prim...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Pedimos desculpas a todos os pesquisadores cujos trabalhos não puderam ser citados por limitações de espaço. Agradecemos a Ulrich Bleyer dos serviços técnicos da DPZ e Hartmut Wolf da oficina do MPI-CBG pela construção das câmaras de eletrodos de placa de Petri; Stoyan Petkov e Rüdiger Behr pelo fornecimento de iPSCs humanos (iLonza2.2), macacos rhesus (iRh33.1) e saguis (cj_160419_5); Sabrina Heide pela criossecção e coloração por imunofluorescência; e Neringa Liutikaite e César Mateo Bastidas Betancourt pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho no laboratório de W.B.H. foi apoiado por uma bolsa ERA-NET NEURON (MicroKin). O trabalho no laboratório de M.H. foi apoiado por uma bolsa inicial do ERC (101039421).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
20 µ L MicroloaderEppendorf5242956003
2-MercaptoethanolMerck8.05740.0005
Placas de cultura de células de 35 mmSarstedt83.3900
Placas de cultura de células de 60 mmCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Axio Observer.Z1 Microscópio de Fluorescência InvertidaZeisssubstituível por microscópios fluorescentes comparáveis
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Suplemento com Vitamina A (ácido retinóico, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 Suplemento sem Vitamina A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Sistema de Eletroporação de Onda QuadradaBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
Linha de células-tronco pluripotentes induzidas por chimpanzés Sandra DOI: 10.7554/elife.18683 
Linha de células-tronco pluripotentes induzida por sagui comum cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered sally (DPBS)Gibco14190-094pH 7.0− 7.3; quente à temperatura ambiente antes de usar
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
GlutaMAX Suplemento (100x)Gibco35050-061suplemento substituto de glutamina
Heparina (estoque de 1 mg/mL)Sigma-AldrichH3149
Linha de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Neurotrofina-3 humana (NT-3)PeproTech450-03
InsulinaSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Estereomicroscópio Leica MS5 (base de luz transmitida MDG 17)Leica10473849substituível por estereomicroscópios comparáveis
MatrigelCorning354277/354234matriz de membrana basal; alternativamente, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) pode ser usado
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)Suplemento Sigma-AldrichM7145
N-2 (100x)Gibco17502-048
Meio neurobasalGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldeído Alça de 818715 Merckcom causão devido à cancerogenecidade
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Câmara de eletrodo de placa de Petriautoproduzida (ver Arquivo Suplementar 1)também comercialmente disponível
Pipetas de vidro pré-puxadoWPITIP10LTpipetas de vidro borossilicato com cone longo, 10 µ m diâmetro da ponta
Composto Pró-SobrevivênciaMerckMillipore529659
Recombinante Humano/Murino/RatoFator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)PeproTechAF-450-02
Linha de células-tronco pluripotentes induzidas por macaco rhesus iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
Reagente de Dissociação de Células Accutase StemProGibcoA1110501mistura de enzimas proteolíticas e colagenolíticas
TrypLEGibco12604-013substituto de tripsina recombinante; aqueça à temperatura ambiente antes
de usar Placas de 96 poços de fixação ultrabaixaCostar7007
Y27632Stemcell Technologies72305

Referências

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