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Artigo de método

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

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DOI:

10.3791/65195

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2 de junho de 2023

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1Department of Neurosurgery, Duke University Medical Center, 2Department of Anesthesiology and Pain Management, University Texas Southwestern Medical School, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University, 5Research and Surgery Services, Durham VA Medical Center

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Resumo

A detecção de respostas do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) a várias formas de ativação neuronal é crítica para a compreensão da função cerebral dinâmica e das variações no fornecimento de substrato para o cérebro. Este trabalho descreve um protocolo para medir as respostas do FSC à estimulação transcraniana por corrente alternada (tACS). As curvas dose-resposta são estimadas tanto a partir da alteração do FSC ocorrida com a tACS (mA) quanto do campo elétrico intracraniano (mV/mm). Estimamos o campo elétrico intracraniano com base nas diferentes amplitudes medidas por microeletrodos de vidro dentro de cada lado do cérebro. Neste trabalho, descrevemos o arranjo experimental, que envolve o uso de sondas bilaterais com laser Doppler (LD) ou laser speckle imaging (LSI) para medir o FSC; Como resultado, essa configuração requer anestesia para a colocação e estabilidade do eletrodo. Apresentamos uma correlação entre a resposta do FSC e a corrente em função da idade, mostrando uma resposta significativamente maior em correntes mais altas (1,5 mA e 2,0 mA) em animais controles jovens (12-14 semanas) em comparação com animais mais velhos (28-32 semanas) (p < diferença de 0,005). Também demonstramos uma resposta significativa do FSC em intensidades de campo elétrico <5 mV/mm, o que é uma consideração importante para estudos em humanos eventuais. Essas respostas do FSC também são fortemente influenciadas pelo uso de anestesia em comparação com animais acordados, pelo controle da respiração (i.e., respiração intubada vs. espontânea), fatores sistêmicos (i.e., CO2) e condução local dentro dos vasos sanguíneos, que é mediada por pericitos e células endoteliais. Da mesma forma, técnicas de imagem/gravação mais detalhadas podem limitar o tamanho do campo de todo o cérebro a apenas uma pequena região. Descrevemos o uso de eletrodos extracranianos para a aplicação da estimulação tACS, incluindo desenhos de eletrodos caseiros e comerciais para roedores, a medição concomitante do FSC e do campo elétrico intracraniano usando eletrodos de gravação DC de vidro bilateral e as abordagens de imagem. Atualmente, estamos aplicando essas técnicas para implementar um formato de circuito fechado para aumentar a FBC em modelos animais de doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral.

Introdução

A estimulação elétrica transcraniana (tES; com estimulação por onda senoidal, tACS) é uma abordagem comum, externa e não invasiva da neuromodulação cerebral 1,2. Previamente, levantamos a hipótese de que, em determinadas doses, a tES (e particularmente a tACS) poderia aumentar o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) nas regiões cerebraissubjacentes 3. Além disso, pode existir uma relação dose-resposta entre a corrente externa aplicada ou o campo elétrico intracraniano e as respostas resultantes do FSC. No entanto, a maioria dos protocolos de estimulação clínica tem focado em um nível máximo de estimulação confortável da pele (i.e., ~ 2 mA) por períodos de tempo programados (i.e., 30-45 min) como um protocolo de tratamento 4,5. Em roedores, é possível utilizar eletrodos cerebrais extracranianos invasivos aplicados diretamente no crânio para investigar os campos elétricos no cérebro induzidos pelaEET6. Assim, o objetivo desta abordagem é determinar os efeitos da intensidade da tACS em frequências relevantes sobre as mudanças do FSC em termos da relação dose-resposta. Essa curva dose-resposta baseia-se em um biomarcador fisiológico de curto prazo - medidas diretas do FSC - em relação ao campo elétrico imposto ao cérebro3. Mostramos anteriormente que, em amplitudes maiores, tipicamente além da faixa de campos elétricos dentro do cérebro induzidos clinicamente pela tACS, existe uma correlação quase linear entre o campo elétrico induzido e o FSC no córtex3. No entanto, a estimulação de campo menor (ou seja, intensidade de 1-5 mV/mm) pode ser mais relevante e viável para uso em humanos; portanto, modificamos nossas técnicas para detectar alterações menores no FSC.

Este trabalho descreve um protocolo para analisar os efeitos das correntes senoidais alternadas de tES de menor intensidade de campo (tACS) sobre o FSC (isto é, corrente de 0,5-2,0 mA, campo elétrico de 1-5 mV/mm), que pode ser tolerado por roedores acordados5. Esse protocolo envolve o uso de novas imagens de laser speckle durante a tACS, bem como eletrodos de vidro intracraniano duplos, para determinar tanto a disseminação de tACS ativa dentro do cérebro (como monitorado pelo FSC) quanto a intensidade do campo elétrico intracraniano, que é mostrado tanto como um diagrama quanto como uma fotografia experimental real (Figura 1). Existem muitos efeitos fisiológicos possíveis da EETt no cérebro, incluindo modulação neuronal direta, plasticidade neural e ativação de astrócitos 7,8. Embora o FSC tenha sido medido com ETCC 9,10, essas medidas foram lentas, indiretas e insuficientes para avaliar a função dose-resposta no cérebro. Portanto, usando biomarcadores apropriados de curto prazo (i.e., FSC, campos elétricos) e sequências rápidas de liga/desliga de tACS, podemos agora estimar a função dose-resposta com mais precisão. Além disso, podemos aplicar diferentes técnicas para medir o FSC, incluindo sondas focais laser Doppler (LD) e laser speckle imaging (LSI) com regiões de interesse definidas.

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Figura 1: Diagrama de estimulação transcraniana e exemplo fotográfico. (A) Diagrama do setup da estimulação transcraniana. O diagrama mostra um crânio de camundongo com pontos coronais e sagitais. Os eletrodos transcranianos são colocados lateral e simetricamente sobre o crânio e são montados com cola cirúrgica e pasta condutora entre os eletrodos e o crânio. Esses eletrodos são conectados a um dispositivo de estimulação de corrente constante compatível com humanos, que pode especificar a frequência, amplitude e duração da estimulação. Para a avaliação dos campos elétricos intracranianos, eletrodos de vidro bilaterais (~2 MΩ) são colocados no córtex cerebral (ou seja, dentro de 1 mm da face interna do crânio através de pequenos orifícios de rebarba), e estes são selados com óleo mineral e têm base de AgCl no músculo do pescoço (mostrados como fios maiores no centro enterrados no tecido cervical subcutâneo). Estes eletrodos de vidro são conectados a um amplificador DC, e suas saídas são gravadas através de um digitalizador com pelo menos quatro canais. Sondas laser Doppler bilaterais também são colocadas no crânio para registros. Todo o crânio também é fotografado com um dispositivo de imagem a laser speckle ou uma câmera resfriada de alta resolução (pelo menos 1.024 x 1.024 pixels, 12-14 bits de profundidade de pixel) para detecção de sinal óptico intrínseco. A frequência isosbestic da hemoglobina é tipicamente escolhida (isto é, 562 nm) para iluminação para imagens do fluxo sanguíneo. (B) Imagem em close-up de um experimento real, mostrando as sondas laser Doppler bilaterais (à esquerda), os microeletrodos de gravação de vidro intracraniano (bilateral) colocados através dos orifícios da broca e com os eletrodos estimuladores de tACS lateralmente. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como forma de avaliar os mecanismos, também podemos interrogar interações com outros processos fisiológicos que também alteram o FSC, como a despolarização disseminada induzida por K+11. Além disso, em vez de sessões agendadas em horários regulares, também é possível desenvolver um sistema de circuito fechado baseado em biomarcadores adicionais para uma variedade de doenças, como tem sido proposto para o tratamento da epilepsia12 (i.e., dispositivos clínicos Neuropace). Por exemplo, a estimulação cerebral em circuito fechado para a doença de Parkinson é comumente baseada nos potenciais de campo local (LFPs) intrínsecos e anormais intrínsecos a essa doença na ausência de dopamina suficiente (tipicamente LFPs de banda β)13.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Duke University ou pela autoridade local equivalente que regulamenta pesquisas envolvendo animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Preparação do instrumento

  1. Certifique-se de que todos os itens necessários e instrumentos cirúrgicos estejam no lugar (Figura 2): solução de limpeza do couro cabeludo (compressas de álcool), fita, pinça, tesoura e uma broca para colocação dos pequenos orifícios de rebarba (0,5 mm).
  2. Prepare os eletrodos de superfície extracraniana para aplicação no crânio e certifique-se de que qualquer cola cirúrgica tenha sido limpa deles, caso tenham sido usados anteriormente.
  3. Verifique a impedância desses eletrodos tACS diretamente antes de aplicá-los no crânio. Para isso, use a função de medição embutida do estimulador tACS com ambos os eletrodos colocados em um banho de soro fisiológico.
    NOTA: A impedância preferida é de <5 KΩ por par de eletrodos para permitir que corrente suficiente seja passada através do crânio. O dispositivo estimulador verifica a impedância antes de fornecer pulsos de corrente constante e fornece o valor diretamente.

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Figura 2: Fotografia da instrumentação necessária, incluindo instrumentos dissecadores e tesoura, para o preparo da estimulação extracraniana. 1. Tesoura microdissecante, 11,5 cm; 2. Pinças, 11,5 cm, leve curva, serrilhada; 3. Pinça Dumont #7, curva; 4. Pinça Dumont #5; 5. Micro cureta, 13 cm; 6. Q-dicas; 7. Fita cirúrgica; 8. Almofadas de álcool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparo do animal para a cirurgia

NOTA: Para estes experimentos, foram utilizados 14 camundongos controle C57BL/6 entre 12 semanas e 33 semanas de idade, sendo cinco machos e nove fêmeas.

  1. Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano emO2 a 30% a ~1,5 L/min, sendo ~4% inicialmente induzir e ~1,25%-1,5% manter em nível de anestesia com respiração espontânea e suficiente para eliminar a resposta de pinça caudal.
  2. Transfira o animal para o quadro estereotáxico após a indução e, em seguida, fixe a cabeça no cone nasal e nas barras auriculares para a subsequente aplicação do eletrodo e procedimento de furo da broca (Figura 1 e Figura 3).
  3. Conecte o cone do nariz da estrutura estereotáxica ao vaporizador através de uma entrada e a uma saída para remover qualquer resíduo de isoflurano através de um sistema de limpeza (por exemplo, carvão ou vácuo). Certifique-se de que não há vazamento de ar do cone nasal, tanto para manter o nível de anestesia com o isofluorano quanto para evitar vazamento acidental para o ar ambiente (Figura 3).
  4. Verificar a posição do camundongo no quadro estereotáxico, incluindo a posição do cone nasal, para permitir a respiração espontânea sem intubação, bem como a recuperação e o sequestro adequados da anestesia para proteger o pessoal da pesquisa (Figura 3).
  5. Colocar as sondas para medir o pulso, a saturação de oxigênio pulsada (pulso OX), a pressão arterial e a temperatura no animal; Certifique-se de que a oxigenação mínima do pulso seja de 90% e que o pulso seja de >450/min (o limite inferior do alarme é mostrado como 380 pulsos/min). Registrar esses parâmetros durante o procedimento em intervalos regulares ou contínuos, dependendo do sistema de registro (Figura 3).
  6. Antes de iniciar o procedimento, verifique o nível de sedação do animal usando (por exemplo) uma pinça do dedo do pé para verificar os reflexos. Se não houver reflexo, o nível de sedação é ótimo, desde que o animal mantenha a respiração espontânea e oxigenação de pulso adequada. Se houver um reflexo, aumente a administração de isoflurano para aprofundar o nível da anestesia e, em seguida, verifique novamente o reflexo. Observar e monitorar continuamente a frequência respiratória do animal e ajustar a administração de isoflurano de acordo.
  7. Raspe os cabelos do couro cabeludo ou remova os cabelos com creme depilatório (limpe o creme residual com passagens de almofada de álcool).
  8. Aplique pomada ocular e, em seguida, limpe assepticamente o couro cabeludo com três passagens de iodo e álcool antes da excisão usando tesoura.

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Figura 3: Imagem do animal no quadro estereotáxico, com o crânio exposto e apenas os eletrodos estimuladores tACS no local (antes da colocação da broca). Observe o aparelho de pressão arterial ao redor da cauda e o oxímetro de pulso na pata, com a leitura à esquerda. Existem tubos de remoção para o isoflurano ao redor do cone nasal. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Procedimento cirúrgico: Aplicar os eletrodos estimuladores e fazer os orifícios da broca

  1. Para um estudo terminal, remova o couro cabeludo com tesoura cirúrgica e exponha o crânio ~3 mm da sutura lambdoide caudalmente e ~3 mm frontal ao bregma para expor parte da sutura frontal posterior. Excisar parietalmente o couro cabeludo para expor a parte inicial do músculo temporal em ambos os lados (Figura 3).
  2. Remova todos os tecidos conjuntivos subcutâneos residuais para que o crânio esteja limpo e seco para a aplicação dos eletrodos estimulantes.
  3. Aplique gel condutor ou pasta na lateral dos eletrodos que estarão em contato com o crânio e fixe os eletrodos com supercola cirúrgica ao redor da borda em pontos intermitentes.
    NOTA: Não permita que o gel condutor interfira com a supercola cirúrgica para permitir uma melhor ligação à superfície do crânio. A superfície externa dos eletrodos também pode ser isolada (do couro cabeludo se este for fechado durante uma cirurgia de sobrevivência) usando supercola cirúrgica.
  4. Use eletrodos planos comerciais ou crie eletrodos internos usando fio isolado com diâmetro de 100 μm (soldado à placa) e uma placa de cobre flexível (em uma superfície) de 1 mm x 3 mm cortada de acordo com o tamanho do crânio.
  5. Aplicar pasta de lidocaína no músculo temporal e couro cabeludo em ambos os lados sem perturbar os eletrodos para reduzir a ativação muscular e nervosa periférica.
  6. Uma vez posicionados os eletrodos estimuladores extracranianos 4 mm lateralmente a cada lado do crânio (entre o bregma e o lambda), faça dois furos de broca de 0,5 mm para os eletrodos de vidro 2 mm de cada lado da linha média, distantes 4 mm um do outro, ortogonais à sutura sagital (Figura 1). Preencha esses orifícios de rebarba com óleo mineral estéril para evitar a entrada de corrente no crânio a partir dos eletrodos extracranianos.
  7. Se desejado para um experimento específico induzir depressão disseminada (isto é, depressão disseminada induzida por potássio [K+-SD]), adicione, no lado direito do crânio, um terceiro orifício de broca de 0,5 mm ~1,5 mm rostral à sutura coronal e ~1 mm lateral à sutura frontal posterior. Preencher este orifício da rebarba com soro fisiológico para posterior aplicação de KCl 1 M para induzir K+-SD.
  8. Testar a impedância dos eletrodos estimuladores extracranianos antes da colocação do orifício da broca (e em comparação com os mesmos eletrodos colocados em um banho de soro fisiológico) e após a colocação da broca para verificar se os orifícios da broca não interferem com o fluxo de corrente para o cérebro (ou seja, certifique-se de que a resistência não seja alterada).
    NOTA: A medida da impedância é fornecida diretamente pelo aparelho estimulador. Geralmente, descobrimos que a impedância geral do sistema (isto é, dos eletrodos extracranianos através da via crânio/cérebro, tipicamente ~3 KΩ) é relativamente constante, independentemente dos orifícios da broca e dos microeletrodos de vidro, indicando que há vazamento mínimo de corrente diretamente no cérebro através dos orifícios da rebarba.
  9. Coloque os eletrodos de estimulação transcraniana crônica para estimulação crônica de forma semelhante. Neste caso, isole a superfície externa dos eletrodos, feche o couro cabeludo e túnel os fios isolados através do couro cabeludo ou encaminhe-os para um estágio fixo da cabeça montado no crânio.

4. Procedimento fisiológico

  1. Comece com os aspectos fisiológicos do experimento, uma vez que o animal esteja totalmente preparado para o experimento fisiológico de não sobrevivência. Manter o nível de anestesia suficiente para a respiração espontânea e níveis adequados de pulso, respiratório e de pulso.
  2. Medir o FSC resultante da estimulação extracraniana por um dos dois métodos a seguir.
    1. Coloque o mouse sob um dispositivo de imagem a laser speckle com ou sem eletrodos de registro intracraniano para medir o campo elétrico intracraniano durante os episódios de estimulação (Figura 3).
    2. Transferir o animal para um preparo fisiológico para a colocação de sondas laser Doppler bilaterais e eletrodos intracranianos para medir o campo elétrico intracraniano durante os episódios de estimulação (Figura 1).

5. Colocação bilateral de laser Doppler e eletrodos de vidro

  1. Transferir o animal para um estágio de microscópio para aplicação de sondas laser Doppler bilateralmente. Posicionar as sondas no topo da superfície do crânio entre os orifícios bilaterais da broca e a sutura coronal (Figura 1).
  2. Preencher microeletrodos de vidro tracionados (~0,1 μM, impedância de 2-6 MΩ) com NaCl 0,2 M e colocá-los com micromanipulador nos dois orifícios de broca colocados lateralmente à sutura sagital 3,14 (Figura 1).
    OBS: Esses orifícios de broca estão entre os dois eletrodos simétricos de estimulação extracraniana (Figura 1).
  3. Uma vez inseridos no cérebro, certifique-se de que esses microeletrodos de vidro estejam ~1 mm dentro do córtex cerebral. Execute perfis de profundidade em várias profundidades simétricas. Reencha os orifícios da rebarba com óleo mineral estéril para isolar este caminho para o fluxo de corrente.

6. Procedimento de estimulação e mensuração da intensidade da estimulação transcraniana por corrente alternada (tACS) ou estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC)

  1. Registrar dados contínuos das sondas duplas de laser Doppler no crânio e das duas saídas de microeletrodos intracranianos (gravadas usando um amplificador DC com headstages) usando um sistema de digitalização e software com pelo menos quatro canais (a uma taxa de amostragem de 1 KHz). Uma vez que todos os valores tenham sido registrados ao longo de uma duração basal suficientemente estável (ou seja, >10 min), teste a estimulação extracraniana.
    OBS: A Figura 4 mostra um exemplo dos quatro canais com os dois eletrodos de registro intracraniano nos canais superiores e a resposta do FSC nos canais inferiores.
  2. Aplicar breves períodos de estimulação liga/desliga em várias amplitudes (isto é, 20-30 s, 0,5-2,0 mA, na faixa tolerável) para obter uma linha de base clara antes e depois da estimulação (Figura 4). Aplicar a estimulação entre os dois eletrodos tACS do crânio em ambos os lados (Figura 1) usando um dispositivo de estimulação comercial, compatível com humanos, que fornece uma corrente constante.
  3. Observe atentamente o mouse para contrações musculares ou outras respostas ao tACS, como uma mudança no pulso ou respiração, para criar um limite superior de tolerabilidade (geralmente ~2 mA).
  4. Continue a monitorar a impedância através dos eletrodos com épocas de estimulação para garantir que isso seja constante.
  5. Adicionar uma pequena quantidade (2-3 μL) de KCl 1 M ao orifício anterior da broca14 para induzir eventos espontâneos de K+-SD. Estes geram uma grande resposta de FSC e interações entre a resposta de FSC induzida por K+-SD e a resposta de FSC. Estimar a resposta do tACS CBF, aplicando a estimulação tACS antes e após a ocorrência do DS.
  6. Ao final do experimento, realizar a eutanásia por meio de uma overdose de isoflurano (5%) e, em seguida, decapitar assim que as respirações e os batimentos cardíacos cessarem.

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Figura 4: Dados mostrando quatro canais de dados brutos em resposta a tACS de baixa intensidade. Os dados são dispostos com as duas fileiras superiores como os registros elétricos CC diretos intracranianos (rotulados como Input 1 [IN0] e input 2 [IN1]) e as duas fileiras inferiores como os registros bilaterais do laser Doppler do fluxo sanguíneo cerebral. Note que as respostas são assimétricas entre os traços elétricos e cerebrais de fluxo sanguíneo direito (superior) e esquerdo (inferior). (A) Resposta pequena (aumento de 16% no fluxo sanguíneo) em resposta a um estímulo de 1,2 mV/mm 20 s (0,75 mA). (B) Maior resposta (aumento de 21% no fluxo sanguíneo) em resposta a um estímulo de 1,4 mV/mm (1,0 mA). Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Cálculo do campo elétrico

  1. Medir a diferença na saída dos dois eletrodos intracranianos usando a diferença na meia-onda (um ciclo) das duas ondas senoidais registradas (os dois traços superiores na Figura 4). Divida essa diferença (mV) pela distância entre os dois eletrodos (mm, aqui ~4 mm, mas medida diretamente em cada caso) para chegar à intensidade de campo (mV/mm)3,6.

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Resultados

Resultados representativos são mostrados na Figura 4, Figura 5 e Figura 6. A Figura 4 mostra um exemplo dos quatro canais com os dois eletrodos de registro intracraniano nos canais superiores e as respostas do FSC nos canais inferiores. A tACS é simétrica em todo o crânio, mas geralmente a resposta do campo intracraniano é ligeiramente assimétrica para as correntes AC aplicadas, com um lado apresentando...

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Discussão

Este protocolo concentra-se na medida in vivo e anestesiada da resposta do FSC como um biomarcador para estimar a resposta cerebral à tES14. Biomarcadores de longo prazo da resposta à tES incluem efeitos histológicos do tratamento, como a prevenção ou alterações na formação de placa amiloide (isto é, com estimulação gama a 40 Hz em vários modelos de DA)16,17,18,19, mas bio...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelos seguintes subsídios (para D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 e VA I21 BX003023.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Compressas de álcoolHenryShein112-6131
Óleo mineral para bebêsJohnson & Seringa Johnson
BD 1 mLBecton DikinsonREF 305699
C3 Eletrodos de Superfície PlanaNeuronexus
Camundongosde colônias NIH 
Eletrodos de crânio de cobrePreparação
Digidata 1440, ClampexAxon Instruments
Dumont #5 fórcepsFST#5
Dumont #7 fórceps curvoDumontRS-5047
Pomada para os olhosMajorLubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Extratorde micropipeta flamejante/marromSutter instrumento Co.Modelo P-87
Fórceps 11,5 cm curva ligeira  serrilhadaRobozRS-8254
Agulha intramédica 23 GBecton DikinsonREF 427565
KCl 1 MPreparação
Sondas DopplerMoor InstrumentsSondas doppler a laser de 0,46 mm
Micro cureta 13 cmFST10080-05
Tesoura de microdissecação, 11,5 cmRobozRS-5914
Fixação de anestesia em camundongoStoelting
Neuroconn-DSNeurocareDC-Stimulator Plus
PhysioSuite MonitoramentoKent Scientific
Q-tipsSolução salinade
Baxter281322
Sensicam QEPCO Instruments
SoftwareAxon Instruments Clampex
Cola cirúrgicaCovetrus31477
Fita cirúrgica3M TransporeT9784
C57BI internainterna a laser Dispositivo de imagem a laser Speckle RWD RFLSI-ZW NaCl de 0,9% 22363167 Fisherbrand

Referências

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