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Artigo de método

Caracterização de Transportadores de Zinco em Mamíferos Utilizando um Ensaio de Transporte de Zinco In Vitro

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DOI:

10.3791/65217

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2 de junho de 2023

 ,  , 
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, 2Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

Neste artigo

Resumo

O transporte de zinco tem se mostrado desafiador de mensurar devido às fracas ligações causais com a função proteica e à baixa resolução temporal. Este protocolo descreve um método para monitorar, com alta resolução temporal, a extrusão de Zn 2+ de células vivas utilizando um corante fluorescente sensível a Zn 2+, fornecendo assim uma medida direta do efluxo de Zn2+.

Resumo

Metais de transição como íons Zn2+ devem ser fortemente regulados devido à sua toxicidade celular. Anteriormente, a atividade dos transportadores de Zn 2+ era medida indiretamente, determinando-se o nível de expressão do transportador sob diferentes concentrações de Zn2+. Isso foi feito utilizando imunohistoquímica, medindo o RNAm no tecido ou determinando os níveis celulares de Zn2+. Com o desenvolvimento dos sensores intracelulares de Zn 2+, as atividades dos transportadores de zinco são atualmente determinadas principalmente pela correlação de alterações no Zn 2+ intracelular, detectadas usando sondas fluorescentes, com a expressão dos transportadores de Zn2+. No entanto, ainda hoje, apenas alguns laboratórios monitoram mudanças dinâmicas no Zn2+ intracelular e o utilizam para medir a atividade de transportadores de zinco diretamente. Parte do problema é que dos 10 transportadores de zinco da família ZnT, com exceção do ZnT10 (transporta manganês), apenas o transportador de zinco 1 (ZnT1) está localizado na membrana plasmática. Portanto, relacionar a atividade de transporte a mudanças na concentração intracelular de Zn2+ é difícil. Este artigo descreve uma maneira direta de determinar a cinética de transporte de zinco usando um ensaio baseado em um corante fluorescente específico de zinco, FluoZin-3. Este corante é carregado em células de mamíferos em sua forma de éster e, em seguida, aprisionado no citosol devido à atividade celular de di-esterase. As células são carregadas com Zn 2+ utilizando a piritionato ionóforo Zn2+. A atividade do ZnT1 é avaliada a partir da parte linear da redução da fluorescência após o washout celular. A fluorescência medida em uma excitação de 470 nm e emissão de 520 nm é proporcional ao Zn2+ intracelular livre. A seleção das células que expressam ZnT1 marcadas com o fluoróforo mCherry permite monitorar apenas as células que expressam o transportador. Este ensaio é usado para investigar a contribuição de diferentes domínios da proteína ZnT1 para o mecanismo de transporte de ZnT1 humano, uma proteína transmembrana eucariótica que extrai o excesso de zinco da célula.

Introdução

O zinco é um oligoelemento essencial no meio celular. Incorpora um terço de todas as proteínas e está envolvido em vários processos celulares, como catálise1, transcrição2 e motivos estruturais3. No entanto, apesar de ser inerte redox, altas concentrações de zinco são tóxicas para a célula, razão pela qual nenhum organismo mamífero sobreviveu sem a presença de mecanismos que regulam a homeostase do zinco. Em mamíferos, três mecanismos são responsáveis por esse processo: (1) metalotioneínas, que são proteínas citosólicas ricas em cisteína que se ligam ao zinco em alta afinidade, prevenindo o excesso de zinco citosólico livre4; (2) proteínas Zrt/Irt-like (ZIPs), transportadores de zinco responsáveis pelo influxo de zinco para o citosol através da membrana plasmática ou de organelas intracelulares 4,5,6,7,8; e (3) ZnTs, que são um subconjunto de mamíferos da família dos facilitadores de difusão catiônica (CDF) ubíquas e são transportadores de zinco, pois extrudem zinco do citosol através da membrana plasmática ou para as organelas intracelulares 4,5,6,7,8,9. Devido à importância do zinco para o metabolismo celular, é vital entender a dinâmica do zinco celular.

Métodos prévios para avaliar a dinâmica do zinco dependiam da avaliação dos níveis de expressão do RNAm sob diferentes condições de zinco, correlacionando-os com as medidas celulares de zinco de tecidos ou células fixas10,11,12. Esses métodos incluem detecção química e coloração imunohistoquímica. No entanto, esses métodos produzem apenas medidas indiretas e, portanto, determinam apenas uma correlação offline entre a concentração intracelular de zinco e a expressão de transportadores de zinco. Consequentemente, esses métodos não podem inferir nenhum parâmetro que exija alta resolução temporal.

Uma medida mais direta do transporte de Zn2+ utiliza isótopos radioativos de zinco13. Este método baseia-se na medição de Zn2+ radiomarcado para monitorar o transporte de zinco e sua cinética. No entanto, devido à importância do zinco na homeostase celular, múltiplos processos celulares regulam a concentração intracelular de zinco. Entre eles estão a ligação extracelular e vários sistemas de transporte que trabalham em conjunto para manter um controle rigoroso dos níveis intracelulares de Zn2+ . A combinação desses processos cria um ruído de fundo considerável, o que dificulta o teste de funções individuais de transporte relacionadas ao zinco.

Este artigo demonstra um método para monitorar diretamente a taxa de transporte de zinco medindo a concentração intracelular de zinco livre usando um corante fluorescente específico para zinco, FluoZin-3. O corante tem alta especificidade para Zn2+ e pouca interferência de outros cátions divalentes, como o cálcio. Além disso, em sua forma de éster, ele entra nas células por difusão não iônica e é então aprisionado devido à atividade da diesterase intracelular. Assim, sua fluorescência é correlacionada primariamente com a concentração citosólica livre de zinco. Estes experimentos foram conduzidos para estudar a relação estrutura-função do transportador de zinco 1 (ZnT1), um membro da família ZnT.

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Protocolo

1. Transfecção celular

  1. Cultura HEK293T células em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina e 1x penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais) em estufa umidificada a 37 °C/5% CO2 até a confluência em uma placa de 10 cm (8,8 x 106 células totais).
  2. Coloque uma lamínula de 13 mm em cada um dos poços de uma placa de 12 poços. Diluir 0,44 x 106 células tripsinizadas da etapa 1,1 em 12 mL de DMEM completo. Misture bem pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes. Encha cada poço com 1 ml da solução misturada. Crescer em uma incubadora umidificada a 37 °C/5% CO2 durante a noite.
  3. Substitua o DMEM completo em cada poço por 1 mL de DMEM sem soro (ver Tabela de Materiais) em cada poço. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada como no passo 1.1.
  4. Para cada poço de transfecção, diluir 1 μg de plasmídeo pAAV2 contendo a proteína de interesse marcada com proteína fluorescente mCherry (Arquivo Suplementar 1) em 100 μL de DMEM livre de soro em um tubo de 1,5 mL.
  5. Adicionar 3 μg de polietilenoimina (PEI, ver Tabela de Materiais) a 100 μL de DMEM sem soro por transfecção, com cada transfecção em um tubo diferente de 1,5 mL. A relação plasmídeo:PEI deve ser de 1:3 (μg:μg).
  6. Vórtice ambos os tubos do passo 1.4 e do passo 1.5 por 10 s, e deixe descansar em temperatura ambiente por pelo menos 5 min.
  7. Misturar uma parte (100 μL por poço) da solução de ADN do passo 1.4 com uma parte (100 μL por poço) da solução de PEI do passo 1.5. Vórtice a solução final por 10 s, e deixe-a descansar em temperatura ambiente por pelo menos 20 min e por até 6 h.
  8. Pegue a placa de 12 poços da incubadora. Vórtice a solução final do passo 1.7 e adicionar 200 μL a cada um dos poços da placa de 12 poços a partir do passo 1.3. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada (passo 1.1).
  9. Após 3 h, substituir o meio em cada poço por 1 mL de DMEM completo. Devolver a placa de 12 poços à incubadora humidificada como no passo 1.1.
  10. Após 2 dias, retirar a cultura celular transfectada da incubadora a 37 °C/5% CO2 e colocá-la em microscópio de fluorescência invertida com aumento de 10x.
  11. Usando a roda de foco do microscópio, concentre-se nas células enquanto usa luz de campo brilhante.
  12. Alterne para os comprimentos de onda de excitação fluorescente mCherry (587 nm) e emissão (610 nm) e desligue a luz de campo brilhante. Verifique a fluorescência das células para confirmar a expressão de ZnT1 mCherry.
  13. Prepare a solução de carregamento do corante.
    1. Tome uma alíquota de 4 μL de corante fluorescente específico para zinco (ver Tabela de Materiais) na sua forma de éster de acetóximetilo (AM), dissolvido em DMSO (1 μg/μL), a partir de um material protegido contra a luz armazenado num congelador de -20 °C. Esta forma permite que o corante entre na célula através da membrana plasmática por difusão simples.
    2. Adicionar 4 μL de ácido plurónico a 10% (ou 2 μL de ácido plurónico a 20%, ver Tabela de Materiais) à alíquota do passo 1.13.1. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo três vezes e, em seguida, adicione todos os 8 μL a um tubo de 1,5 mL.
    3. Adicionar 750 μL de solução de Ringer (preparada internamente, ver Tabela de materiais para composição) suplementada com 1 mg/mL (~0,1%) de albumina de soro bovino ao tubo a partir da etapa 1.13.2 e vórtice vigorosamente. Adicione mais 750 μL da mesma solução e volte a agitar para garantir a máxima mistura.
  14. Adicionar 750 μL da solução final do passo 1.13.3 a dois poços numa nova placa de cultura de 6 poços. Cubra com papel alumínio.
    OBS: Para evitar o clareamento, a placa de 6 poços é sempre coberta com papel alumínio a partir desta etapa.
  15. Usando um tweezer fino, pegue até quatro folhas de cobertura replicadas da placa de cultura de células transfectada e coloque-as no primeiro poço cheio (até quatro lâminas por poço) da nova placa de 6 poços a partir da etapa 1.14. Repita esse processo para o segundo bem preenchido.
    OBS: Todas as tampas do mesmo poço preenchido devem ser do mesmo estado. No entanto, cada poço pode conter condições diferentes.
  16. Cubra com papel alumínio e agite suavemente por 15-20 min.
  17. Retire a solução de carga do corante e substitua-a por uma nova solução de lavagem de Ringer mais albumina, conforme utilizado no passo 1.13.3. Cubra com papel alumínio. Deixe agitar novamente por 20 min. Isso permite a clivagem do éster de AM pelas esterases intracelulares.

2. Preparação do microscópio

  1. Organize as ferramentas necessárias (ver Tabela de Materiais) conforme mencionado: um microscópio de fluorescência invertido capaz de detectar fluoróforos de GFP e mCherry, um sistema de perfusão que permite alternar entre pelo menos duas soluções, um sistema de sucção e uma câmara de perfusão.
  2. Ligue o microscópio, sua fonte de luz e a câmera. Ligue o sistema de sucção.
  3. Lave o sistema de perfusão. Lavar a primeira câmara com solução de Ringer e a segunda câmara com solução de Ringer contendo 7 μM de solução de zinco suplementada com 7 μM de piritionato (ionóforo de zinco, ver Tabela de Materiais). Para evitar bolhas de ar ou lacunas, deixe um pouco de líquido em cada câmara.
    NOTA: Como ambos os recipientes estão conectados ao mesmo tubo acoplado à câmara de perfusão, certifique-se sempre de que o segmento compartilhado seja lavado com a solução de Ringer.
  4. Feche as torneiras e encha as câmaras apropriadas com solução de Ringer e solução de zinco de Ringer, como no passo 2.3.

3. Preparo da amostra

  1. Pegue a câmara de perfusão e coloque-a com o lado estreito do sulco voltado para cima.
    NOTA: O sulco é um orifício no meio da câmara de perfusão. Permite o acesso do fluido de perfusão às células. Um lado do sulco é estreito e o lado oposto é largo.
  2. Aplique um silicone de vedação (consulte Tabela de Materiais) ao redor do sulco. Limpe qualquer silicone de vedação do sulco usando uma ponta de pipeta.
    NOTA: Certifique-se de que há vedação de silicone suficiente ao redor do sulco para selar uma tampa de 22 mm.
  3. Usando um tweezer fino, pegue uma tampa da solução de lavagem e coloque-a em cima do sulco com as células voltadas para baixo. Desta forma, as células serão expostas à solução perfundindo o sulco durante o experimento.
  4. Coloque uma lamínula de 22 mm sobre a lamínula de 13 mm e aperte-a usando o tweezer. Tome cuidado para não rachar as tampas.
  5. Vire a câmara e pressione-a para liberar todos os líquidos presentes. Preencha o sulco com 100 μL da solução de lavagem de Ringer e pressione novamente para garantir que não haja vazamentos.
    NOTA: Se for detectado um vazamento, aplique um agente de vedação no local do vazamento e teste novamente.
  6. Monte a câmara de perfusão na plataforma e fixe-a. Coloque os tubos de perfusão e sucção para permitir a perfusão sobre as células no sulco.
  7. Alterar a velocidade de perfusão para aproximadamente 2 mL/min e ligar a perfusão da solução de Ringer. Verifique se o sistema de perfusão está funcionando sem vazamento ou transbordamento.

4. Preparação da medição

  1. Abra o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) clicando duas vezes no ícone. Faça login com as credenciais relevantes. Escolha a câmera conectada e pressione Ok.
  2. Ajuste a ampliação do microscópio para 10x usando o botão no lado esquerdo do microscópio.
  3. Escolhendo a visualização ao vivo e usando o joystick, mova a plataforma para se concentrar nas células no sulco.
  4. Enquanto a perfusão estiver ligada, apague as luzes e altere o comprimento de onda para mCherry pressionando o botão dedicado na interface. Ajuste o foco usando a roda de foco do microscópio.
  5. Uma vez que o microscópio está focado nas células, mova a plataforma usando o joystick para permitir a seleção dos adesivos celulares apropriados.
    NOTA: Uma área adequada é considerada uma área com pelo menos 10 células para uma ROI e uma área vazia para plano de fundo.
  6. Selecione o menu suspenso Ativar/desativar ROIs e escolha Desenhar ROIs circulares.
  7. Desenhe ROIs de agrupamentos de células com as células que expressam mCherry (indica a expressão de ZnT1).
  8. Na mesma barra de ferramentas da etapa 4.6, clique no botão Ativar/desativar ROIs em segundo plano e ajuste o local e o tamanho do ROI em segundo plano para uma área sem células.
    1. Verifique com os comprimentos de onda mCherry e EGFP para garantir que nenhuma célula esteja no ROI em segundo plano selecionado.
      NOTA: Os comprimentos de onda foram ajustados de modo que o mCherry usou um comprimento de onda de excitação de 520 nm e um comprimento de onda de emissão de 610 nm e o EGFP usou um comprimento de onda de excitação de 470 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.
  9. Selecione a subguia Comprimento de onda (λ). Marque sua caixa de seleção e verifique se o comprimento de onda GFP está presente e sua caixa de seleção marcada. Caso contrário, adicione e marque.
  10. Selecione a subguia Duração . Defina o intervalo de medição como a cada 5 s e altere o número de intervalos para se adequar à duração do experimento.
  11. Na seção Foco no painel do microscópio abaixo da ocular, clique no botão Ligado para ativar o sistema de foco perfeito (PFS).
  12. Usando a roda de foco PFS, ajuste o foco. Na interface do software, em ND Acquisition, verifique se o PFS está marcado.
  13. Clique em Executar agora.

5. Procedimento experimental

  1. Comece com uma medição do período basal de 90 s usando a perfusão da solução de Ringer.
  2. Após o término do período basal, desligue a perfusão da solução de Ringer e, em seguida, ligue a perfusão da solução de zinco de Ringer. Marque a troca da solução clicando na bandeira vermelha no canto inferior direito do painel de interface principal. Espera-se que apareça um aumento na fluorescência.
  3. Uma vez que a elevação da fluorescência começa a saturar, mude de volta para a perfusão com a solução de Ringer. Desligue a perfusão da solução de zinco de Ringer e, em seguida, ligue a perfusão da solução de Ringer.
  4. Aguarde até que o tempo de experimento expire. Uma diminuição notável e constante na fluorescência é esperada se o ZnT1 estiver funcionando corretamente.

6. Exportação de dados

  1. Para exportar os dados com a subtração da linha de base, pressione o botão Subtrair Linha de Base e exiba as alterações na "janela de aquisição ND".
  2. Clique no botão Exportar na interface do software na "janela de aquisição ND". Uma folha de dados do Excel será aberta. Salve no local desejado.

7. Análise dos dados

  1. Para cada ROI, crie uma fluorescência de linha de base média dos primeiros 90-100 s.
  2. Expresse a fluorescência calculada para cada ROI como uma porcentagem do plano de fundo para essa ROI.
  3. Crie uma média de linhas de todas as ROIs e plote o resultado como um gráfico de linhas. Isso cria uma média de todos os ROIs em função do tempo.
  4. Usando a função de ajuste linear, selecione a taxa inicial para a diminuição da fluorescência após a lavagem com solução de Ringer. O valor da inclinação da equação correlaciona-se com a taxa de transporte.

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Resultados

O ZnT1 é um transportador de zinco de mamíferos localizado na membrana plasmática celular13. É um membro da família de proteínas facilitadoras de difusão catiônica (CDF) que extrusa zinco do citosol para o milieu extracelular14. O ZnT1 tem uma arquitetura de dois domínios: o domínio transmembrana, que transporta os íons através da membrana, e um domínio C-terminal14. Ao contrário de outras proteínas CDF conhecidas, ZnT1 tem um domínio C-terminal não ...

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Discussão

O método descrito acima permite a medida direta da concentração intracelular de zinco com alta resolução temporal. Comparado a outros métodos, este método envolvendo o monitoramento de mudanças no Zn2+ intracelular pode diminuir substancialmente o ruído de fundo. Além disso, a seletividade do corante para o zinco elimina potenciais interações cruzadas com outros cátions metálicos18,19. Finalmente, sua ausência de citotoxicidade imediata possibilita a r...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Raz Zarivach é apoiado pela Israel Science Foundation (processo nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran são apoiados pela Israel Science Foundation (bolsa nº 2047/20). Gostaríamos de agradecer a Daniel Gitler e seu grupo na Universidade Ben-Gurion por sua cooperação, apoio e experiência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 10 cmgreiner bio-one664160
Placa de cultura de células de 12 poçosgreiner bio-one665180
13 mm lamínulasSuperior Marienfeld111530
22 mm lâminas de coberturaSuperior Marienfeld101050
Placa de cultura de 6 poçosgreiner bio-one657160
Soro bovino albuminabioWorld22070008
Cloreto de cálcio anidro, granularSigma AldrichC1016Concentração em solução de Ringer: 1 mM
D-(+)-GlucoseGlentham Life ScienceGC6947Concentração em solução de Ringer: 10 mM
Dubelco' s Modified Eagle Media (DMEM) Sartorius01-055-1A
Eclipse TiNikonTI-DHDescontinuado. Substituído por Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSH30088.03
Pinças finasDumont0203-55-PS
Fluozin-3AMInvitrogenF24195
HyClone Penicilina-Estreptomicina 100x soluçãoCytivaSV30010 
Sistema de iluminação LEDCoolLEDpE-4000
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
Cloreto de magnésio hexahidratadoMerck1.05833Concentração em solução de Ringer: 0,8 mM
[2-Hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanossulfônico] (HEPES)Para concentração de HEPES10 médioem solução de Ringer: 10 mM
Câmera Neo 5.5 sCMOSANDORDC-152Q-FI
NIS-Elements software de imagemNikonAR
Ácido plurônico F-127Millipore540025
cloreto de potássioBio-Lab163823Concentração em solução de Ringer: 5.4 mM
PyrithioneSigma AldrichH3261Concentração em solução de zinco de Ringer: 7 μ
Kit de Graxa de SiliconeM Warner InstrumentsW4 64-0378
Cloreto de sódioBio-Lab190305Concentração em solução de Ringer: 120 mM
Sulfato de zincoSigma Aldrich31665Concentração em solução de zinco de Ringer: 7 μ O
Microscópio invertido N

Referências

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