Artigo de método

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

DOI:

10.3791/65393

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21 de julho de 2023

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1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema linfático participa da regulação da vigilância imunológica, absorção de lipídios e equilíbrio de fluidos teciduais. O isolamento de células endoteliais linfáticas murinas é um processo importante para a pesquisa linfática, pois permite a realização de experimentos in vitro e bioquímicos nas células isoladas. Além disso, o desenvolvimento da tecnologia Cre-lox permitiu a deficiência específica do tecido de genes que não podem ser direcionados globalmente, levando à determinação precisa de seu papel nos tecidos estudados. A dissecação do papel de certos genes na fisiologia e fisiopatologia linfática requer o uso de promotores linfático-específicos e, portanto, a verificação experimental dos níveis de expressão dos genes-alvo.

Métodos para isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas de camundongos selvagens ou transgênicos permitem o uso de ensaios ex vivo e in vitro para estudar os mecanismos que regulam as funções linfáticas e a identificação dos níveis de expressão das proteínas estudadas. Desenvolvemos, padronizamos e apresentamos um protocolo para o isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas (DLECs) via purificação de esferas magnéticas com base na expressão de LYVE-1. O protocolo descrito visa equipar os pesquisadores com uma ferramenta para entender e elucidar ainda mais os atores importantes das funções das células endoteliais linfáticas, especialmente em instalações onde o equipamento de classificação de células ativadas por fluorescência não está disponível.

Introdução

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O sistema linfático desempenha um papel fundamental na fisiologia humana. É considerado um fator homeostático vital, que facilita funções importantes, como a manutenção do equilíbrio hídrico tecidual-plasmático, a vigilância imunológica e a absorção de lipídios1, bem como funções recentemente identificadas, como a capacidade de reparo do coração2 e a capacidade regenerativa do osso e hematopoiese3. Apesar do papel significativo do sistema linfático, vários aspectos do papel dos linfáticos, bem como os mecanismos moleculares que governam certos parâmetros e respostas fisiológicas, permanecem indefinidos. Além disso, os defeitos vasculares linfáticos são fatores desencadeantes ou deteriorantes em certas condições fisiopatológicas. Exemplos bem conhecidos são os linfedemas primários e secundários, dependendo da origem genética ou não genética da doença, respectivamente, enquanto o papel do sistema linfático no crescimento do tumor primário e na disseminação metastática é fundamental, pois pode atuar como um canal para metástases e modulador das funções imunes1.

A defasagem no estudo e conhecimento da vasculatura linfática em relação à vasculatura sanguínea deve-se principalmente à descoberta posterior do sistema linfático em comparação com o sistema vascular sanguíneo e ao atraso na identificação de marcadores moleculares linfático-específicos. Isso melhorou muito nas últimas décadas, levando à alteração do quadro convencional dos linfáticos no estado estacionário e em condições de doença1. Semelhante à angiogênese, a linfangiogênese é a formação de novos vasos linfáticos a partir de vasos pré-existentes e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de um amplo espectro de doenças 4,5,6. No entanto, ao contrário da angiogênese, a investigação da linfangiogênese tem sido limitada principalmente a modelos in vivo com foco na formação de vasos de desenvolvimento e defeitos estruturais em modelos patológicos. O isolamento das células endoteliais linfáticas é importante para estudos in vitro, e isso pode ser proporcionado pelo protocolo apresentado.

Vários protocolos para isolamento endotelial linfático de camundongos foram desenvolvidos, os quais requerem o uso de classificação de células ativadas por fluorescência7. A vantagem do classificador de células, quando disponível, é o maior grau de pureza, ao contrário do isolamento baseado em esferas, com este último proporcionando um maior rendimento. O protocolo utiliza a expressão do receptor de hialuronano endotelial linfático 1 (LYVE-1), um marcador endotelial linfático, importante para o tráfego celular dentro dos vasos linfáticos 4,8. Como a expressão de LYVE-1 é limitada aos capilares linfáticos e não aos vasos linfáticos coletores, a técnica é adequada para o isolamento de células endoteliais linfáticas especificamente dos capilares linfáticos, ao contrário de outros marcadores linfáticos, como a podoplanina, que são expressos uniformemente em todas as células endoteliais linfáticas9. Para o protocolo, outros marcadores linfáticos importantes que não eram transmembrana, como o Prox1, foram excluídos.

Como o desfecho fisiológico foi a linfangiogênese, que geralmente é iniciada nos capilares linfáticos, o LYVE-1 foi selecionado como alvo devido à sua seletividade nessas células e porque o anticorpo selecionado proporcionou um alto rendimento. As enzimas utilizadas foram a colagenase tipo II, que é geralmente conhecida por ser mais eficaz na dissociação do colágeno do que o tipo I10, e a dispase, uma protease mais ampla, regularmente usada para a separação derme-epiderme11; no entanto, outras enzimas para separação tecidual foram relatadas12,13 e podem ser usadas. O objetivo deste protocolo é descrever um método para isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas de capilares linfáticos de camundongos adultos com alto rendimento usando purificação de esferas magnéticas, especialmente em locais onde a classificação de células ativadas por fluorescência não está prontamente disponível. O método é adequado para aplicações onde a pureza das células endoteliais linfáticas pode ser comprometida para aplicações a jusante.

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Protocolo

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Os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University (TTUHSC) para os experimentos no TTUHSC e pela Administração Veterinária da Prefeitura da Grécia Ocidental de acordo com a Diretiva 2010/63 para os experimentos na Universidade de Patras. Siga diligentemente os regulamentos de descarte de resíduos ao descartar resíduos animais.

1. Isolamento da derme do camundongo

  1. Dia 1
    NOTA: No dia 1; Prepare os seguintes materiais e equipamentos: câmara de anestesia, máquina de cortar pêlos de animais, isoflurano, pinça fina, filtros de seringa de 0,2 μm.
    1. Prepare uma solução Dispase de 2 mg/mL em DMEM com 1x solução antibiótico-antimicótica e filtre-a por filtro.
      NOTA: O uso de meio ou PBS pode ser substituído pelo HBSS, pois tem sido usado com sucesso em outros protocolos relatados12. A solução antibiótico-antimicótica 1x pode ser substituída pela adição de penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e anfotericina (2,5 μg/mL).
    2. Anestesiar o camundongo colocando-o em uma câmara de anestesia com administração de isoflurano (0,5-2% de isoflurano, fluxo: 1 L/min). Depois que o camundongo parar de se mover, transfira-o para fora da gaiola e continue a anestesia ajustando um cone do nariz com um fluxo de isoflurano semelhante. Belisque o animal com o dedo do pé para confirmar níveis suficientes de anestesia e monitore constantemente o camundongo para garantir que a anestesia profunda seja preservada (sem motilidade). Prenda aproximadamente 9 cm2 do pelo dorsal e ventral (dorso e abdômen do rato, respectivamente) longitudinalmente ao longo da linha média, usando uma máquina de cortar cabelo. Deixe o camundongo se recuperar da anestesia e devolva-o à gaiola.
      NOTA: O creme de depilação (depilação) pode ser usado em seu lugar. Certifique-se de que o pelo seja completamente removido nas áreas da pele a serem isoladas, mantendo a integridade da pele. Tente cortar a área da pele o mais estendida possível. Para garantir que a inflamação potencial da depilação seja resolvida, o isolamento celular deve ocorrer no dia seguinte. Para aumentar o número de células isoladas, agrupe de 2 a 4 camundongos por grupo.
  2. Dia 2
    NOTA: Mantenha os seguintes materiais e equipamentos prontos: câmara de eutanásia, cabine de biossegurança, incubadora de CO2 , etanol, tesoura fina, pinça fina, pinça romba, placa de cultura de tecidos de 100 mm, Dispase, DMEM, 1x Solução Antibiótico-Antimicótica.
    1. Eutanasiar o camundongo pela administração de CO2 e colocá-lo em decúbito dorsal, expondo a área cortada. Pulverize etanol 70% como desinfetante.
      NOTA: A partir desta etapa, todas as etapas devem ser realizadas em condições estéreis (em um gabinete de biossegurança).
    2. Coloque uma placa de cultura de tecidos estéril de 100 mm no gelo.
    3. Faça um corte superficial de 0,5 polegada no abdômen e corte longitudinalmente ao longo da linha média até o pescoço e a parte inferior do abdômen. Faça cortes laterais para poder abrir a pele.
      NOTA: O tamanho da incisão e a área da pele isolada dependem do tamanho do mouse.
    4. Usando uma pinça romba, separe cuidadosamente a pele dos tecidos circundantes. Faça isso contornando todo o tronco do mouse, cortando a pele lateralmente ao redor do pescoço e da parte inferior do abdômen.
    5. Coloque cuidadosamente a pele na placa de cultura de tecidos de 100 mm, com o lado da derme voltado para baixo, mantendo a pele o mais esticada possível. Cubra os pratos e mantenha-os no gelo. Complete o isolamento de todos os camundongos do grupo.
    6. Depois que a pele for extraída de todos os camundongos, incube as placas por 10 min em temperatura ambiente para achatar o explante.
    7. Adicione 6 ml de solução Dispase à placa, certificando-se de que a pele está completamente imersa e incube durante a noite com agitação ligeira a 4 °C.
      NOTA: Em vez de Dispase, a digestão de tripsina também pode ser realizada12, seguida de tratamento com Liberase em vez de Colagenase Tipo II (abaixo).

2. Isolamento celular da derme

  1. Dia 3
    NOTA: Mantenha os seguintes materiais e equipamentos prontos: centrífuga, incubadora de CO2 , cabine de biossegurança, tesoura, DMEM, 1x Solução Antibiótico-Antimicótica, Colagenase Tipo II, PBS, tubo cônico de 50 mL, placas de cultura de tecidos de 100 mm e 60 mm, solução de DNAse I, Colágeno Tipo I, filtros de células de 70 μm e 40 μm, filtros de seringa de 0,2 μm, meio LEC.
    1. Prepare 500 mL de 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) e autoclave por 20 min a 15 psi ou esterilize com filtro. Como alternativa, use PBS estéril disponível comercialmente.
    2. Prepare 10 mL de solução de colagenase tipo II de 2 mg/mL em DMEM com 1x solução antibiótica-antimicótica e esterilize-a por filtro.
      NOTA: Execute as próximas etapas sob uma capa estéril para diminuir as chances de contaminação da amostra.
    3. Use uma pipeta para remover o líquido do prato.
    4. Use uma pinça para separar a derme (parte inferior da pele) da epiderme (superior) e remova qualquer tecido adiposo óbvio. Transfira a derme para uma placa de cultura de tecidos limpa.
    5. Adicione 1 mL de DMEM com 1x solução antibiótica-antimicótica na placa de cultura de tecidos limpa e incline-a para que o líquido se acumule em um lado da placa.
    6. Pique a derme em pedaços de 1-2 mm2 e transfira-os para um novo tubo cônico de 50 mL.
      NOTA: Idealmente, esta etapa deve ser concluída em 4-5 minutos, pois não se espera que o processamento mais longo forneça maior rendimento ou sobrevivência celular.
    7. Adicione 10 mL da solução de colagenase tipo II.
    8. Adicionar 50 μL (25 unidades/ml da solução) de solução de DNAse I (reduz a aglomeração celular) e digerir a solução dérmica durante 2 h a 37 °C com agitação contínua (utilizar uma incubadora rotativa/agitada a 30-50 rpm).
      NOTA: Verifique periodicamente para identificar se a maior parte da derme foi digerida. Caso contrário, aumente o tempo de digestão (1 h extra no máximo) e a velocidade de agitação, se possível.
    9. Cubra as placas de cultura de tecidos de 60 mm com 2 mL de 10 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético 0,02 M por >20 min a 37 °C. Lave 2x com PBS estéril.
    10. Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 70 μm e centrifugar a 250 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
    11. Ressuspenda em 10 mL de DMEM com 1x Solução Antibiótico-Antimicótica.
    12. Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm e centrifugar a 250 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
    13. Ressuspenda em 1 mL de meio LEC completo (Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement).
    14. Coloque as células na placa de cultura de tecidos de 60 mm revestida de colágeno em meio LEC completo. Este será o Dia 0 da cultura de células.
    15. Substitua a mídia a cada 2 dias, lavando as células com 1x PBS duas vezes e adicionando mídia LEC nova.
    16. Repita a etapa 2.1.15 até que as células estejam 80-90% confluentes.
      NOTA: Se a purificação for realizada antes que as células sejam 80-90% confluentes, menos células endoteliais linfáticas serão isoladas. Esse processo leva cerca de 7 a 10 dias.

3. Revestimento magnético do grânulo com anticorpo LYVE-1

NOTA: Um dia antes da etapa de purificação, prepare os seguintes materiais e equipamentos: Refrigerador a 4 °C, Rotor, separador magnético, PBS, Grânulos magnéticos Anti-Rabbit IgG, tubos de microcentrífuga, filtros de seringa de 0.2 μm, Solução de revestimento de grânulos magnéticos, anticorpo LYVE-1.

  1. Prepare a solução de revestimento magnético de esferas: 20 mL de PBS com 0,1% de BSA e 2 mM de EDTA e esterilize-o com filtro. Armazene-o a 4 °C.
    NOTA: Mais do que alguns dias de armazenamento não são recomendados; Verifique se há precipitados ou contaminação antes de usar.
  2. Pipete 500 μL de esferas magnéticas IgG anti-coelho para um tubo de microcentrífuga e adicione 1 mL de solução de revestimento de esferas magnéticas geladas.
  3. Use um separador magnético para lavar as contas.
  4. Repita as lavagens 2x com 1 mL da solução de revestimento magnético de esferas gelada.
  5. Ressuspenda os grânulos em 500 μL de solução de revestimento magnético de esferas e faça alíquotas de 150 μL em tubos de microcentrífuga.
  6. Adicione 15 μg do anticorpo LYVE-1 a cada tubo (15 μL de concentração de estoque de anticorpos de 1 mg / mL).
  7. Incubar durante a noite a 4 °C com agitação contínua.

4. Purificação de células endoteliais linfáticas

NOTA: Prepare os seguintes materiais e equipamentos: incubadora de CO2 , agitador, temporizador, parafilme, DMEM, 1x solução antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, solução de revestimento magnético de esferas, tripsina-EDTA, placas de cultura de tecidos de 100 mm ou 60 mm, filtros de seringa de 0.2 μm, colágeno tipo I, ácido acético, meio LEC.

  1. Prepare 50 mL de DMEM com 1x solução antibiótico-antimicótica e 0,1% de BSA e filtre-esterilize.
  2. Cubra as placas de cultura de tecidos de 60 mm com 10 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético 0,02 M por >20 min a 37 °C. Lave 2x com PBS estéril.
  3. Lave os grânulos pré-revestidos com 1 mL de solução de revestimento magnético de grânulos, usando um separador magnético.
  4. Ressuspenda os grânulos em 150 μL de DMEM com 0,1% de BSA.
    NOTA: As contas agora podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 mês.
  5. Lave as células 2x com PBS.
  6. Adicione 3 mL de DMEM com BSA a 0,1% (para uma placa de cultura de tecidos de 60 mm) e 50 μL de esferas conjugadas com anticorpos às células.
    NOTA: Se as células de dois ou mais camundongos estiverem agrupadas, use uma placa de cultura de tecidos de 100 mm e adicione 6 mL de DMEM com 0,1% de BSA.
  7. Sele o prato com parafilme.
  8. Coloque o prato em uma coqueteleira agitando a 10 RPM em RT e incube por exatamente 10 min.
    NOTA: Uma incubação mais longa resultará em ligação não específica. Para garantir que os grânulos interajam com toda a superfície da placa, gire manualmente a placa a cada poucos minutos, enquanto ela continua a tremer.
  9. Descarte o meio e lave as células uma vez com PBS. Inspecione rapidamente as células para verificar a presença de colônias LEC na placa.
  10. Tripsinizar as células: use 1 mL de tripsina-EDTA e incube por 3 min a 37 °C. Inspecione as células quanto ao desprendimento celular bem-sucedido.
  11. Neutralize a solução com 2 mL de meio LEC completo e transfira a solução para um tubo de polipropileno estéril de 5 mL.
  12. Usando um separador magnético, lave as células 4 x 3 mL de DMEM com 0,1% de BSA para remover as células não ligadas.
  13. Ressuspenda as células restantes ligadas ao cordão em meio LEC completo e aplique nas placas de cultura de tecidos de 60 mm previamente revestidas com colágeno.
  14. Incubar as células a 37 °C e mudar o meio em dias alternados após duas lavagens de PBS de cada vez.
  15. Cultive as células até atingirem a confluência (normalmente leva de 7 a 10 dias).
  16. Nesse ponto, verifique as células ao microscópio quanto à confluência e prossiga com a preparação das células para a citometria de fluxo. Se uma alta porcentagem de F4 / 80 + for identificada, repita a etapa de purificação com LYVE-1 (Etapa 4: Purificação de células endoteliais linfáticas) novamente ou, idealmente, outro marcador linfático (ou seja, podoplanina14).
    NOTA: A alta expressão da proteína alvo do anticorpo na população de células purificadas por esferas magnéticas foi demonstrada15,16. No entanto, para o LYVE-1, é importante realizar um controle de citometria de fluxo para a identificação da porcentagem de outras células do LYVE-1+, principalmente macrófagos. O LYVE-1 é expresso apenas em subconjuntos de macrófagos associados a tumores e feridas, enquanto na pele saudável, a expressão do LYVE-1 é mais restrita às células endoteliais linfáticas17. Assim, a triagem F4/80 não é obrigatória, mas sim dependente do contexto experimental. Os camundongos usados para demonstração não carregavam tumores ou feridas, apenas inflamação potencial por depilação, mas incluímos a coloração F4 / 80 como uma linha de base da porcentagem de macrófagos LYVE-1 +.

5. Citometria de fluxo

NOTA: Prepare os seguintes materiais e equipamentos: centrífuga, incubadora de CO2 , temporizador, hemocitômetro, solução de EDTA, 1x solução antibiótica-antimicótica, BSA, PBS, tripsina-EDTA, tubos de polipropileno, filtros de seringa de 0.2 μm, etanol 70%, anticorpo conjugado com F4/80 FITC.

  1. Prepare PBS contendo 0,1% de BSA e esterilize-o com filtro.
  2. Preparar a solução de EDTA 1 mM em PBS.
  3. Tripsinizar as células: incubar as células com 1 mL de solução de EDTA 1 mM por 5 min a 37 °C.
    NOTA: A incubação com solução de EDTA é um método mais suave de descolamento celular, que preserva melhor as proteínas transmembranares e é preferido, mas requer períodos de incubação mais longos. Alternativamente, a solução de tripsina-EDTA pode ser usada para incubação de 1 min a 37 ° C, mas isso pode afetar a afinidade do anticorpo para aplicações de citometria de fluxo.
  4. Neutralize a solução com 2 mL de meio LEC completo e transfira a solução para um tubo de polipropileno estéril de 5 mL.
  5. Centrifugar as amostras a 250 × g durante 5 min.
  6. Lave com PBS.
  7. Repita a centrifugação e a lavagem com PBS.
  8. Ressuspenda as células em PBS contendo 0,1% de BSA e conte-as usando um hemocitômetro ou método alternativo. Alíquota ~ 1 × 106 células em tubos de polipropileno com um volume final de 100 μl. A partir desta etapa, execute todas as etapas a 4 °C.
    NOTA: As células podem ser fixadas antes da coloração ou coradas enquanto vivas. A fixação pode ser subótima para citometria de fluxo, pois alguns anticorpos podem não detectar os antígenos após a fixação; portanto, recomendamos executar a citometria de fluxo imediatamente após a etapa anterior e pular a etapa de fixação. Se isso não for possível, a fixação antes do experimento de citometria de fluxo permitirá um atraso na etapa de citometria de fluxo. Se a fixação for realizada, o desempenho dos anticorpos no contexto de células fixas deve ser avaliado com antecedência.
  9. Realize a fixação (etapa opcional; se as células não forem fixadas, prossiga com a imunocoloração): ressuspenda as células em etanol 70% gelado e misture suavemente por 10 min no gelo.
    NOTA: A fixação de etanol pode permeabilizar as células e levar à liberação de GFP; no entanto, a fixação à base de paraformaldeído pode destruir os corantes usados para citometria de fluxo e, idealmente, pode ser evitada.
  10. Incubar por 15 min em temperatura ambiente.
  11. Lave as células 2x por centrifugação a 250 × g por 5 min em 1x PBS.
  12. Prossiga para a próxima etapa ou ressuspenda as células em 0,5-1 mL de 1x PBS e armazene a 4 ° C.

6. Imunocoloração

NOTA: Manuseie as células com cuidado e evite pipetagem extensa, quando possível, para manter a integridade da membrana celular e minimizar a morte celular, garantindo que as células não formem aglomerados. A partir das células endoteliais isoladas, prepare os seguintes grupos: células não coradas e células coradas com outro marcador de células endoteliais (ou seja, VEGFR3, podoplanina), F4/80 e ambos. Incluir células endoteliais linfáticas de ratinho e macrófagos comercialmente disponíveis, se disponíveis, como controlos positivos. Para fins de demonstração, e devido à fluorescência endógena do tdTomato (PE+), usamos a coloração F4/80 conjugada com FITC.

  1. Diluir o anticorpo primário em PBS com 0,1% de BSA de acordo com a diluição recomendada ou otimizada. Adicione 0,5 μg (1 μL de solução de anticorpo) do anticorpo conjugado com F4 / 80 FITC aos 100 μL da suspensão celular.
  2. Ressuspenda as células após a adição do anticorpo diluído conjugado com fluorescência. Misture sacudindo o tubo de polipropileno para garantir que não haja grumos e que todas as células estejam devidamente revestidas.
  3. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente (células fixas) ou 30 min em gelo (células vivas) no escuro.
  4. Lave as células 2x centrifugando-as a 250 × g por 5 min a 4 °C (para células vivas) ou à temperatura ambiente (para células fixas), usando PBS com 0,1% de BSA no escuro.
  5. Para anticorpos não conjugados com fluorescência
    1. Diluir o anticorpo secundário conjugado com fluorocromo no tampão de incubação. Para anticorpos Alexa Flour, use uma diluição de 1:500.
    2. Adicionar o anticorpo secundário a 100 μL da solução de suspensão celular.
    3. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (células fixas) ou em gelo (células vivas).
    4. Lavar duas vezes por centrifugação a 250 × g durante 5 min a 4 °C (para células vivas) ou à temperatura ambiente (para células fixas) no tampão de incubação.
  6. Ressuspenda as células em 0,5 mL de PBS 1x e analise-as usando um citômetro de fluxo.
  7. Siga estas etapas da estratégia de gating para identificar a população de macrófagos dentro das células que expressam LYVE-1:
    1. Considere o espalhamento para frente e para o lado para distinguir a população celular.
    2. Considere o espalhamento direto para tamanho, área e altura da célula para distinguir as células únicas (Singlets).
    3. Leve em consideração a expressão F4 / 80 (FITC) e a expressão RFP (PE) para identificar macrófagos (F4 / 80 +) dentro das células murinas isoladas que expressam tdTomato (PE) (devido à presença de um repórter fluorescente tdTomato nos camundongos específicos, descritos abaixo).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método foi desenvolvido para identificar a expressão proteica de uma pequena GTPase, RhoA, cujo gene codificador foi floxizado em ambos os alelos e deletado sob o efeito do promotor específico do endotélio linfático induzível por tamoxifeno Prox1-CreERT2 18. Os LECs isolados podem ser cultivados por até quatro gerações, após o que se tornam senescentes. Eles foram congelados, descongelados e estimulados com sucesso com angiopoietina-2. Devido ao número limitado de passagens c...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema linfático é um importante regulador da função homeostática do organismo, sendo as funções mais importantes a manutenção do plasma fluido, a remoção de subprodutos do metabolismo celular e moléculas tóxicas, a absorção de lipídios e o tráfego de células imunes 1,19. A identificação de marcadores apropriados provocou uma explosão de novos dados no campo linfático, revelando novas funções da vasculatura linfática, como seu papel no reparo e na capacidade r...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (00376), os Institutos Nacionais de Saúde, o Instituto Nacional do Câncer (NCI) [Grant R15CA231339], o Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University (TTUHSC) Escola de Farmácia Escritório de Ciências da bolsa (para CMM) e pela Faculdade de Farmácia, Universidade de Louisiana Monroe financiamento inicial, os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais [Grant P20 GM103424-21] e o Subprograma de Competitividade em Pesquisa (RCS) do Conselho de Regentes da Louisiana por meio do Fundo de Apoio ao Conselho de Regentes (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (para GM). O equipamento TTUHSC comum usado foi obtido por meio do Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Grants RP190524 and RP200572. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na decisão de escrever ou na preparação do manuscrito. O resumo gráfico na Figura 1A foi criado com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 μ m Filtros de SeringaFisher Scientific09-719C
100 mm Placas de Cultura de TecidosFisher ScientificFB012924
60 mm Placas de Cultura de TecidosFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Solução Antibiótico-Antimicótica 100xFisher Scientific15240-062
Pinça BluntFerramentas de Ciência Fina11992-20
Albumina de Soro BovinoSigma-AldrichA4919
Filtro de Células 40 μ mFisher Scientific542040
Filtro de Células 70 μ mFisher Scientific542070
CO2 Incubadora
Colágeno I, Cauda de Rato de Alta Concentração354249diluído em 0,02 M Ácido Acético em H2O
Colagenase Tipo IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
Solução DNAse I (2.500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Concentrador de Partículas MagnéticasInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Base de Crescimento de Células Endoteliais Medium & Suplemento (meio LEC)R& D SystemsCCM027
Câmara de eutanásiaEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Tesoura Fina-SharpFerramentas de Ciências Finas14060-10
FITC anti-mouse F4 / 80 AnticorpoBiolegend123107
Cabra Anti-Coelho IgG Contas Magnéticas NewEngland BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Câmara de Indução de AnestesiaEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Solução de Paraformaldeído 4% em PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Incubadora Rotativa/Agitada
Tubos de Polipropileno de Fundo RedondoCorning352063
Seringa Filtros w 0.2 μ m PorosFisher Scientific09-719C
Tripsina-EDTAFisher Scientific25-300-120

Referências

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