Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).
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Artigo de método
Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas histonas são altamente abundantes e conservadas entre os eucariotos e desempenham um grande papel na regulação gênica como resultado de estruturas conhecidas como modificações pós-traducionais (MPTs). Identificar a posição e a natureza de cada PTM ou padrão de PTMs em referência a fatores externos ou genéticos permite que essa informação seja estatisticamente correlacionada com respostas biológicas, como transcrição, replicação ou reparo de DNA. No presente trabalho, um protocolo analítico de alto rendimento para a detecção de PTMs de histonas a partir de amostras biológicas é descrito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massas por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite a separação e atribuição de PTM das modificações biologicamente mais relevantes em uma única análise. A abordagem descrita aproveita os recentes desenvolvimentos na aquisição de dados dependentes (DDA) usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade, seguida por fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. Os PTMs Histone são atribuídos com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.
Introdução
Em células eucarióticas, o DNA é empacotado como cromatina em unidades funcionais chamadas nucleossomos. Essas unidades são compostas por um octâmero de quatro histonas de núcleo (duas de H2A, H2B, H3 e H4)1,2,3,4. As histonas estão entre as proteínas mais abundantes e altamente conservadas em eucariotos, as quais são as grandes responsáveis pela regulação gênica5. As modificações pós-traducionais de histona (MPTs) desempenham um grande papel na regulação da dinâmica da cromatina e rigger vários processos biológicos, ....
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Protocolo
NOTA: As amostras de histona foram extraídas usando um método adaptado de Bhanu et al (2020)12.
1. Preparação da amostra
- Colheita de células cultivadas
- Quando as células são 80% confluentes, certifique-se de que são viáveis usando a exclusão de azul de tripano.
NOTA: Uma linhagem celular HeLa S3 foi usada para esses experimentos, mas este método pode ser aplicado a qualquer célula cultivada. - Aspirar o meio e, em seguida, aplicar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x em cada placa.
- Agite a(s) placa(s) para enxaguar todos os meios residuais, asp....
- Quando as células são 80% confluentes, certifique-se de que são viáveis usando a exclusão de azul de tripano.
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Resultados
Um fluxo de trabalho proteômico ascendente (Figura 7) tipicamente envolve o seguinte: extração da(s) proteína(s) alvo(s) de uma amostra bruta, seguida da quantificação da concentração da(s) proteína(s) e, em seguida, fracionamento, geralmente por eletroforese em gel ou cromatografia líquida. Após o fracionamento, as proteínas são digeridas usando uma enzima proteolítica (muitas vezes tripsina) e, finalmente, análise espectrométrica de massa dos peptídeos resultantes e identificação proteica .......
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Discussão
As histonas são proteínas básicas que regulam a estrutura da cromatina interagindo com o DNA na forma de octâmeros constituídos pelas quatro histonas centrais (duas de H2A, H2B, H3 e H4)20. As histonas contêm numerosos resíduos de lisina e arginina, que são prontamente modificados, levando a extensas MPTs que alteram a química da cromatina influenciando a função das histonas ou ligando-se a outras proteínas celulares21. As MPT podem provocar respostas biológicas trabalhando.......
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Divulgações
Melvin A. Park e Matthew Willetts são funcionários da Bruker Daltonics Inc., fabricante do instrumento timsTOF.
Agradecimentos
Este material é baseado em trabalho apoiado pela National Science Foundation sob o Grant No. HRD-1547798 e Bolsa nº. HRD-2111661. Essas bolsas da NSF foram concedidas à Florida International University como parte do Programa Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Esta é a contribuição número 1672 do Institute of Environment, um programa proeminente da Florida International University. O apoio adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde sob a Bolsa nº. R21AI135469 a Francisco Fernandez-Lima e Grant nº. R01HD106051 a Benjamin A. Garcia, bem como pela National Science Foundation sob o Grant No. CHE-2127882 para Benjamin A. Garcia. ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| -80 ° C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Livre de Origem Animal |
| 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μ L, não estéril, não filtrado, pontas em rack |
| Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use esses tubos para o processamento simples e seguro de volumes de amostra de até 1,5 mL |
| 10 µ L Ponteiras de Pipeta | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μ L, não estéril, não filtrado, em rack |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergente Solution |
| 10x Dulbecco' s PBS sem Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| Tubos Cônicos de 15 mL | Corning | 352196 | Falcon Tubos de Centrífuga Cônicos |
| 200 µ L Pontas de Pipeta de Carregamento em Gel | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Pontas de Carregamento de Gel, 1– 200 μ L |
| 200 µ L Ponteiras de Pipeta | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μ L, pontas não estéreis, não filtradas, com rack, |
| 2x Tampão de Amostra Laemmli | Bio-Rad | 1610737 | Tampão de amostra de proteína pré-misturada para SDS-PAGE |
| Tubos Cônicos de 50 mL | Corning | 352070 | Falcon Tubos de Centrífuga Cônicos |
| Placa de fundo plano de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| placa de 96 poços, V-Bottom 600 μ L | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetona | Sigma Aldrich | 179124 | reagente ACS, ≥ 99,5% |
| de acetonitrila (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher |
| Chemical Acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (v / v), Grau LC / MS | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima Grau LC / MS, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | cloridrato AEBSF, 98% |
| Bicarbonato de amônio, NH4< / sub>HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥ Solução de hidróxido de amônio a 99,5% (T), |
| NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Atende às especificações ACS, atende às especificações de reagentes para testes de monografias USP ACS |
| ARGÔNIO (AR) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH Coluna de HPLC C18 | Coluna Waters | 186003625 | XBridge Peptídeo BEH C18 Coluna, 300 Å, 5 µ m, 4.6 mm X 250 mm, 1K– |
| Albumina de Soro Bovino 15K (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Fração de choque térmico, pH 7, ≥ 98% |
| Cloreto de cálcio, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anidro, pó, ≥ 97% |
| Tampão de dissociação celular | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, Microplaca de 96 Poços, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Elevadores de Células Descartáveis | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Levantadores de Células Fisherbrand; Os levantadores descartáveis removem rapidamente as camadas de células |
| Pilões de Pellets Descartáveis | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Marca Fisher pilões de pellets; Ressuspenda proteínas e DNA ou triture tecidos moles em tubos de microcentrífuga |
| Ditiotreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Ácido fórmico (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagente, ≥ 96% |
| Capilar de sílica fundida 75 μ m ID x 363 μ m OD( | Molex (Polimicro) | TSP075375 | |
| Ácido Acético Glacial | Thermo Fisher Scientific | A38S | Ácido Acético, Glacial (Certificado ACS), Pipetas de Vidro Pasteur Fisher Chemical |
| Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | ||
| Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho | Shimadzu | Shimadzu Proeminência 20 HPLC UFLC Sistema | |
| Ácido clorídrico, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | reagente ACS, 37% |
| Hypercarb 30-40 μ m Carbono 150– 300 & | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Cartucho Hypersep | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Padrão de Calibração, para ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Cloreto de magnésio, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anidro, ≥ 98% |
| Metanol, para HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima para HPLC, Fisher Chemical |
| Adaptadores de Tubo de Microcentrífuga | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcistina | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Frasco de amostra Microcystin-LA |
| MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | Peças LEAP PAL | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Modelo científico | : ND3300 | |
| Nitrogênio (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| Tiras indicadoras de pH, Instachek | Micro Essential Modelo | de laboratório JR-113 | Cloreto de potássio Hydrion |
| , KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagente, 99,0%– Célula de Injeção de Pressão 100.5% |
| Next Advance | modelo: PC77 | ||
| Anidrido Propiônico | Sigma Aldrich | 8.00608 | Para |
| Centrífuga Refrigerada de Síntese (700– 18.000 x g) | NuAire, modelo: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| Géis SDS-PAGE Bio-Rad | 4569035 | pré-moldado | kD, 8,6 cm &vezes; 6,7 cm (W &vezes; L), para uso com Células de Eletroforese Mini-PROTEAN |
| Butirato | de Sódio Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Cloreto de Sódio, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagente, ≥ 99,0% |
| Disco SPE, C18 | VWR | 76333-134 | Disco SPE Empore, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0,5 mm, 12 µ m |
| Bomba de vácuo SpeedVac+ e rotor de placa | Modelo Savant | : SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | adequado para microbiologia |
| Ácido sulfúrico, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF | Bruker Daltonics | modelo Tims tof ms | |
| Solução de ácido tricloroacético, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 |
| N Ácido trifluoroacético (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Adequado para HPLC, ≥ 99,0% |
| Triversa Nanomate | Modelo Advion | : TR263 | |
| TripsinProtease, MS Grau | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Rotador de tubo | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Misturador de vórtice | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Água com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS Grau | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
Referências
- Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245(2019).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 25....
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Reimpressões e permissões
