Diagnóstico Rápido Baseado na Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) da Infecção por Helicobacter pylori e Resistência a Antibióticos

H. pylori é uma bactéria gram-negativa em forma espiral, altamente móvel, que vive principalmente na região do piloro do estômago¹. É um patógeno comum que infecta cerca de 50% da população mundial². A maioria das pessoas com infecção por H. pylori não tem manifestações clínicas, e a maioria desenvolve diferentes doenças após vários anos de infecção, incluindo gastrite crônica, úlceras pépticas, úlceras gástricas e câncer gástrico³. Em vários estudos baseados em diferentes populações, a eficácia da eliminação do H. pylori na prevenção do câncer de estômago e lesões pré-cancerosas tem sido demonstrada ^4,5. Por isso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer da Organização Mundial da Saúde (OMS) tem aconselhado a erradicação do H. pylori como medida preventiva⁶.

O uso de métodos não invasivos para identificar a infecção por H. pylori é um componente fundamental do tratamento para a maioria dos indivíduos com dispepsia assintomática. O teste respiratório da ureia (UBT), o teste do antígeno fecal do H. pylori (SAT) e o teste sorológico são técnicas não invasivas populares. Dentre estes, a UBT é o procedimento menos intrusivo e mais preciso disponível. A UBT usa urease, abundantemente presente em H. pylori, para hidrolisar ureia marcada isotopicamente em amônia e dióxido de carbono (13C ou 14C). Em contraste, o ensaio imunocromatográfico (ICA)⁷ é conveniente, simples e não invasivo para amostragem. No entanto, a acurácia do teste é afetada por vários fatores, como a qualidade da amostra de fezes, a temperatura e o intervalo entre a coleta da amostra e o teste. Outro teste baseado na resposta imune é o teste de anticorpos séricos contra H. pylori , que detecta anticorpos no soro do paciente. No entanto, esse teste não é adequado para análise pós-tratamento, uma vez que os anticorpos permanecem por muito tempo após a eliminação da bactéria⁸. Outra grande desvantagem é que esses métodos apenas diagnosticam a infecção por H. pylori e não permitem testes de resistência a drogas para orientar o tratamento baseado na sensibilidade.

Para métodos de teste invasivos, o tecido da biópsia gástrica precisa ser colhido por endoscopia e, em seguida, submetido à histologia, teste rápido da urease e cultura bacteriana. Esses métodos de teste também são muito limitados devido a vários fatores. Atualmente, essas técnicas são limitadas a pacientes idosos, pacientes com alto risco de doença pré-cancerosa ou maligna e pacientes que falharam na terapia de primeira linha para doença do refluxo gastroesofágico ou infecção por H. pylori9. Em segundo lugar, devido às características únicas de crescimento de H. pylori, a taxa de sucesso da cultura bacteriana atinge apenas 50%¹⁰. Assim, os métodos de detecção molecular oferecem uma nova esperança para superar as altas demandas dos métodos de detecção invasivos e orientar o tratamento baseado na sensibilidade. Dentre os métodos de detecção molecular, a PCR quantitativa evoluiu tremendamente nos últimos anos. A qPCR, ao contrário da PCR tradicional, não requer eletroforese em gel e quantifica com precisão o DNA/RNA em amostras adicionando primers e sondas na fase de recozimento. Kits de qPCR para a detecção de infecção por H. pylori e resistência a drogas estão agora disponíveis comercialmente. No entanto, cada método tem suas limitações; Portanto, o diagnóstico clínico e o tratamento de um paciente devem ser considerados em conjunto com seus sintomas, sinais, história, outros exames laboratoriais e resposta ao tratamento.

Atualmente, o principal método de tratamento das infecções por H.pylori é o uso de antibióticos, mas ultimamente, está se tornando cada vez mais difícil tratar essas infecções devido ao aumento da resistência aos antibióticos. Posteriormente, um declínio significativo na eficácia do tratamento do H. pylori foi observado em todo o mundo, tornando a erradicação do H. pylori um importante problema de saúde pública¹¹.

Claritromicina e levofloxacina são os dois antibióticos de amplo espectro usados para tratar infecções causadas por H.pylori, mas vários estudos relataram resistência generalizada contra essas duas drogas em isolados de H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C são três das numerosas mutações pontuais encontradas no gene 23S rRNA de 2,9 kb que resultam em resistência à claritromicina, impedindo que o macrolídeo se ligue. Ao mesmo tempo, os loci de mutação do gene de resistência à levofloxacina estão localizados principalmente nos seis sítios de mutação (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) do gene gyrA ¹². A descoberta desses mecanismos de resistência baseados em mutações genéticas levou a uma mudança gradual na detecção do H. pylori através de estudos de base cultural para testes moleculares.

Em geral, há uma necessidade clínica urgente de um método diagnóstico não invasivo, eficaz e simultâneo para a detecção de infecções por H. pylori e resistência a drogas. Adotamos um teste combinado de cordas e o método qPCR para superar as dificuldades de amostragem e atingir o objetivo de detecção simultânea de infecção por H. pylori e resistência a drogas usando diferentes sondas de primer.

O presente estudo foi conduzido de acordo com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY-Q-2022-384-02). Foram incluídos pacientes na faixa etária de 18 a 60 anos. Pacientes em uso de antibióticos, medicamentos antibacterianos chineses, medicamentos como inibidores da bomba de prótons (IBP) ou antagonistas do receptor H 2, etc., dentro de₂ semanas antes do teste não foram incluídos neste estudo. Os pacientes que receberam tratamento contra H.pylori nos últimos 3 meses também foram excluídos deste estudo. Aqueles com problemas cardíacos, hepáticos, renais, neuropatia grave ou doença mental graves também não foram autorizados a participar deste estudo. Não foram incluídas no estudo gestantes e lactantes. Detalhes dos insumos (reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares) utilizados neste estudo são apresentados na Tabela de Materiais.

1. Teste de cordas para amostragem de líquido gástrico

1. Solicitar ao paciente que faça jejum durante a noite antes da coleta da amostra.
2. No dia seguinte, abra o kit de teste de corda, pegue a cápsula e segure o laço no final da corda.
3. Tape o fio na bochecha do paciente e peça-lhe para colocar a cápsula em sua língua perto da parte de trás da garganta e engoli-lo com um gole de água.
4. Permitir que a cápsula seja dissolvida no estômago do paciente, expondo assim o fio dentro da cápsula para absorver o muco gástrico.
5. Peça a um assistente treinado para puxar a corda cuidadosamente 1 h depois que o paciente engoliu a cápsula.
6. Cortar a extremidade inferior da corda (40 cm) embebida no líquido gástrico, colocá-la na solução de preservação da amostra de EET (Tris/soro fisiológico/EDTA) e, em seguida, enviá-la ao laboratório clínico à temperatura ambiente (RT) para a posterior detecção de H. pylori e determinação dos perfis de resistência aos antibióticos usando qPCR.

2. Extração de DNA

1. Coloque os tubos de coleta que transportam amostras em um rack de tubo de ensaio, devidamente rotulado, e vote-os por 10 s.
2. Vire a placa de 32 poços (kit de extração ou purificação de ácido nucleico) de cabeça para baixo várias vezes para ressuspender as esferas magnéticas. Depois de um vórtice curto por 10 s, remova cuidadosamente a vedação da folha de alumínio da placa.
3. Transferir 200 μL de líquido gástrico de cada amostra e DNA de H. pylori como controle positivo para os poços separados.
4. Coloque a placa de 32 poços no slot de amostra correspondente da máquina extratora de ácido nucleico para extração automática de DNA.
5. Após a extração e confirmação do DNA, iniciar o teste de resistência a antibióticos para claritromicina e levofloxacina através de qPCR nas amostras positivas.
6. Coloque o excesso de líquido gástrico e as amostras de DNA extraídas a -20 °C para armazenamento a longo prazo e uso futuro.
7. Execute todas essas etapas em um gabinete de biossegurança para evitar qualquer contaminação.

3. qPCR para detecção de H. pylori e resistência a antibióticos (claritromicina e levofloxacina)

1. Realizar qPCR para a detecção de H. pylori e as suspeitas de mutações de resistência a antibióticos em seu genoma.
   1. Descongelar a mistura de reação qPCR (kit de detecção de ácido nucleico H. pylori ) no gelo e misturá-la agitando e girando para evitar qualquer perda de reagente.
   2. Para cada amostra em uma placa de 32 poços, misturar 20 μL de mistura de reação de PCR (pré-mistura de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação e cloreto de magnésio], com primers ureA forward e reverse e uma sonda ureA ) e 5 μL do DNA extraído.
   3. Execute a placa qPCR de 32 poços na máquina qPCR. Programar o termociclador: a mistura reacional será primeiramente reagida sequencialmente a 42 °C e 95 °C (ambas para um ciclo) por 2 min cada; em seguida, 40 ciclos a 95 °C, desnaturação por 10 s e recozimento e extensão a 58 °C por 45 s.
   4. Ajuste a aquisição do sinal de fluorescência para FAM (H. pylori) e a aquisição de dados para o período de extensão da amplificação. Depois que a reação for concluída, salve os dados para análise de resultados futuros.
   5. Analise os dados usando um software específico para qPCR, pois o instrumento selecionará automaticamente os limiares basais.
   6. Se o resultado do teste para H. pylori for positivo, a máquina iniciará automaticamente o teste de resistência a medicamentos na amostra. Substitua o kit de reagentes por reagentes de detecção para mutações no gene 23S rRNA e no gene gyrA no kit H. Pylori (qPCR).
      NOTA: O kit de reagentes (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA no Helicobacter pylori [qPCR]) inclui a mistura de reação de PCR (premix de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação, cloreto de magnésio], primers e sondas). Todos os produtos de controle de qualidade negativo são água purificada e estéril. O produto de controle de qualidade positivo no kit de detecção de ácido nucleico de H. pylori é contas padrão de H. pylori inativadas (ATCC 43504). Os produtos de controle de qualidade positivos fortes e positivos fracos do kit (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA em H. pylori) são o DNA da cepa inativada de H. pylori contendo o gene alvo e o gene mutante. Da mesma forma, com base na situação real, todos os padrões diagnósticos, incluindo a presença de infecção por H. pylori ou resistência a drogas, são ajustados para TC ≤ 35 e têm uma curva típica em forma de S. A concentração do controle de qualidade fraco é de 1,0 x 10³ cópias/mL, enquanto a concentração do controle de qualidade forte é de 1,0 x 10⁸ cópias/mL.

Detecção de infecção por H. pylori e resistência a antibióticos em fluido gástrico por qPCR
Realizamos qPCR para a detecção da infecção por H. pylori amplificando o gene ureA e determinamos seu perfil de resistência a antibióticos visando mutações pontuais no gene 23S rRNA e no gene gyrA (Tabela 1). Os valores de CT de controle de qualidade nos três grupos de experimentos de qPCR estavam dentro da faixa recomendada, indicando que as amostras estavam todas em um estado normal no momento do experimento e que os resultados dos testes eram confiáveis. Neste estudo, cinco amostras com diferentes resultados de testes (S1-S5) foram selecionadas para caracterizar a confiabilidade do protocolo experimental. S1 representa uma cepa representativa de H. pylori sem infecção, enquanto as amostras S2-S5 são aquelas infectadas por H. pylori com diferentes resultados de resistência (Figura 1). Configuramos o sistema para não realizar testes adicionais de resistência com as amostras não infectadas com H. pylori, de modo que a amostra S1 não entrou no teste de resistência depois que o teste do sistema mostrou um resultado negativo para H. pylori. Em relação às amostras positivas para infecção por H. pylori, os valores de S2 CT estavam todos dentro da faixa de detecção, indicando que a amostra era positiva para H. pylori e apresentava dupla resistência à claritromicina e à levofloxacina, e os clínicos foram recomendados a escolher outros métodos de tratamento a seu critério. Os valores de TC de S3 estavam dentro da faixa de detecção de infecção por H. pylori e do teste de resistência à levofloxacina, enquanto nenhum valor de TC foi detectado no teste de resistência à claritromicina, indicando que a amostra de S3 era de um paciente resistente à levofloxacina. Da mesma forma, o valor de TC da amostra de S4 estava dentro da faixa de detecção para infecção por H. pylori e resistência à claritromicina, enquanto nenhum valor de TC foi detectado para resistência à levofloxacina, indicando que esse paciente era resistente à claritromicina, e foi recomendado que eles tomassem levofloxacina para tratamento. Finalmente, o teste da amostra S5 mostrou valores de TC dentro da faixa de detecção apenas para a detecção da infecção por H. pylori, indicando que este paciente era sensível a ambos os antibióticos e poderia ser tratado com qualquer uma das duas drogas. Comparado ao método de cultura bacteriana, que também detecta infecção por H. pylori e resistência a drogas, esse método é seguro e eficaz na detecção de infecção e resistência a drogas por H. pylori sem causar danos ao paciente e pode ser usado para orientar o médico na formulação de um plano de tratamento adequado.

Figura 1: Detecção de H. pylori e sua resistência a antibióticos no líquido gástrico por qPCR.
(A) Amplificação quantitativa por PCR da infecção por H. pylori , (B) detecção de resistência à claritromicina e (C) detecção de resistência à levofloxacina. "S" significa amostra. "S1" é uma amostra que deu negativo para infecção por H. pylori e também foi testada para resistência a antibióticos; "S2" é uma amostra infectada por H. pylori com resistência tanto à claritromicina quanto à levofloxacina; "S3" também é uma amostra positiva para H. pylori, mas é suscetível à claritromicina e resistente à levofloxacina; "S4" também é uma amostra positiva para H. pylori, mas é resistente à claritromicina e suscetível à levofloxacina; "S5" é uma amostra positiva para H. pylori, mas é suscetível tanto à claritromicina quanto à levofloxacina. A concentração do controle de qualidade fraco é de 1,0 x 103 cópias/mL, enquanto a concentração do controle de qualidade forte é de 1,0 x 108 cópias/mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tabela mostrando os resultados da qPCR da detecção da infecção por H. pylori e resistência à claritromicina e levofloxacina. Esta tabela apresenta os resultados qualitativos para a infecção por H. pylori , a detecção de mutações no gene 23S rRNA mostrando que o isolado é resistente à claritromicina e a detecção de mutações no gene gyrA mostrando que o isolado é resistente à levofloxacina. +/−, resultado qualitativo; +, resultado positivo; − resultado negativo.

Nenhum.