Summary
הפרוטוקול מציג שיטה לא פולשנית לאבחון מהיר של זיהומי קיבה של הליקובקטר פילורי באמצעות בדיקת מיתרים וקובע את עמידותו האנטיביוטית לקלריתרומיצין ולבופלוקסצין באמצעות תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR).
Abstract
הליקובקטר פילורי הוא פתוגן אנושי עיקרי המדביק כמחצית מאוכלוסיית העולם והופך לאיום בריאותי חמור בשל עמידותו הגוברת לאנטיביוטיקה. זהו הגורם הסיבתי של דלקת גסטריטיס פעילה כרונית, מחלת כיב פפטי וסרטן קיבה והוא סווג כמסרטן מקבוצה I על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן. לכן, האבחון המהיר והמדויק של H. pylori וקביעת עמידותו לאנטיביוטיקה חשובים למיגור יעיל של פתוגן חיידקי זה. כיום, שיטות האבחון של H. pylori כוללות בעיקר את בדיקת הנשימה אוריאה (UBT), בדיקת האנטיגן, בדיקת נוגדנים בסרום, גסטרוסקופיה, בדיקת אוראז מהיר (RUT) ותרבית חיידקים. ביניהן, שלוש שיטות הגילוי הראשונות אינן פולשניות, כלומר הן בדיקות קלות לביצוע. עם זאת, לא ניתן לאחזר חיידקים באמצעות טכניקות אלה; לפיכך, לא ניתן לבצע בדיקות עמידות לתרופות. שלוש האחרונות הן בדיקות פולשניות, אך הן יקרות, דורשות מיומנויות גבוהות ויש להן פוטנציאל לגרום נזק לחולים. לכן, שיטה לא פולשנית, מהירה וסימולטנית לזיהוי H . pylori ובדיקת עמידות לתרופות חשובה מאוד למיגור יעיל של H. pylori בפרקטיקה הקלינית. פרוטוקול זה נועד להציג הליך ספציפי הכולל את בדיקת המיתרים בשילוב עם תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) לזיהוי מהיר של זיהום H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה. בניגוד לתרביות חיידקים, שיטה זו מאפשרת אבחון קל, מהיר ולא פולשני של מצב זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. באופן ספציפי, השתמשנו ב-qPCR כדי לזהות rea עבור זיהום H. pylori ומוטציות בגנים 23S rRNA ו-gyrA , אשר מקודדים עמידות נגד clarithromycin ו-levofloxacin, בהתאמה. בהשוואה לטכניקות גידול שגרתיות, פרוטוקול זה מספק טכניקה לא פולשנית, בעלות נמוכה וחוסכת זמן כדי לזהות זיהום H. pylori ולקבוע את עמידותו לאנטיביוטיקה באמצעות qPCR.
Introduction
H. pylori הוא חיידק בצורת ספירלה, תנועתי מאוד, גראם-שלילי שחי בעיקר באזור הפילורוס של הקיבה1. זהו פתוגן נפוץ שמדביק כמעט 50% מאוכלוסיית העולם2. לרוב האנשים עם זיהום H. pylori אין ביטויים קליניים, ורובם מפתחים מחלות שונות לאחר מספר שנים של זיהום, כולל דלקת קיבה כרונית, כיבים פפטיים, כיבי קיבה וסרטן קיבה3. במספר מחקרים המבוססים על אוכלוסיות שונות,הודגמה יעילות סילוק H. pylori למניעת סרטן הקיבה ונגעים טרום סרטניים 4,5. לכן, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המליצה על מיגור H. pylori כאמצעי מניעה6.
השימוש בשיטות לא פולשניות לזיהוי זיהום H. pylori הוא מרכיב מרכזי בטיפול עבור רוב האנשים עם דיספפסיה אסימפטומטית. בדיקת נשימה אוריאה (UBT), בדיקת אנטיגן צואה H. pylori (SAT) ובדיקות סרולוגיות הן טכניקות לא פולשניות פופולריות. מבין אלה, UBT הוא ההליך הכי פחות פולשני ומדויק ביותר שיש. UBT משתמש באוראז, המצוי בשפע בהליקובקטר פילורי, כדי לבצע הידרוליזה של אוריאה עם תווית איזוטופית לאמוניה ופחמן דו חמצני (13C או 14C). לעומת זאת, הבדיקה האימונוכרומטוגרפית (ICA)7 נוחה, פשוטה ולא פולשנית לדגימה. עם זאת, דיוק הבדיקה מושפע ממספר גורמים, כגון איכות דגימת הצואה, הטמפרטורה והמרווח בין איסוף הדגימה לבדיקה. בדיקה נוספת המבוססת על התגובה החיסונית היא בדיקת נוגדנים בסרום H. pylori , המזהה נוגדנים בסרום של המטופל. עם זאת, בדיקה זו אינה מתאימה לניתוח לאחר הטיפול שכן הנוגדנים נשארים זמן רב לאחר ניקוי החיידק8. חסרון משמעותי נוסף הוא ששיטות אלה מאבחנות רק זיהום בהליקובקטר פילורי ואינן מאפשרות בדיקות עמידות לתרופות כדי להנחות טיפול מבוסס רגישות.
עבור שיטות בדיקה פולשניות, רקמת ביופסיית קיבה צריכה להילקח על ידי אנדוסקופיה ולאחר מכן נתון להיסטולוגיה, הבדיקה המהירה urase, ואת התרבות חיידקית. שיטות בדיקה אלה גם מוגבלות מאוד בשל מספר גורמים. כיום, טכניקות אלה מוגבלות לחולים קשישים, חולים בסיכון גבוה למחלה טרום סרטנית או ממאירה, וחולים שנכשלו בטיפול קו ראשון למחלת ריפלוקס קיבתי-ושטי או זיהום H. pylori 9. שנית, בשל מאפייני הגידול הייחודיים של H. pylori, שיעור ההצלחה של תרבית חיידקים מגיע רק 50%10. לפיכך, שיטות זיהוי מולקולרי מציעות תקווה חדשה להתגבר על הדרישות הגבוהות של שיטות גילוי פולשניות ולהנחות טיפול מבוסס רגישות. בין שיטות הזיהוי המולקולרי, PCR כמותי התפתח מאוד בשנים האחרונות. qPCR, בניגוד ל-PCR מסורתי, אינו דורש אלקטרופורזה בג'ל ומכמת במדויק DNA/RNA בדגימות על ידי הוספת פריימרים ובדיקות בשלב החישול. ערכות qPCR לזיהוי זיהום H. pylori ועמידות לתרופות זמינות כעת באופן מסחרי. עם זאת, לכל שיטה יש מגבלות; לכן, יש לשקול את האבחנה הקלינית והטיפול של המטופל בשילוב עם הסימפטומים שלו, הסימנים, ההיסטוריה, בדיקות מעבדה אחרות והתגובה לטיפול.
כיום, השיטה העיקרית לטיפול בזיהומים מסוג H.pylori היא נטילת אנטיביוטיקה, אך לאחרונה נעשה קשה יותר ויותר לטפל בזיהומים אלה בשל העלייה בעמידות לאנטיביוטיקה. לאחר מכן, נצפתה ירידה משמעותית ביעילות הטיפול בהליקובקטר פילורי ברחבי העולם, מה שהופך את מיגור ההליקובקטר פילורי לבעיה מרכזית בבריאות הציבור11.
Clarithromycin ו- levofloxacin הן שתי האנטיביוטיקות רחבות הטווח המשמשות לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי H.pylori, אך מספר מחקרים דיווחו על עמידות נרחבת נגד שתי תרופות אלה במבודדי H.pylori. A2143G, A2142G ו-A2142C הן שלוש מתוך מוטציות נקודתיות רבות שנמצאו בגן rRNA 23S 2.9 kb שגורמות לעמידות לקלריתרומיצין על ידי מניעת קישור המקרוליד. יחד עם זאת, מוקדי המוטציה של הגן לעמידות ללבופלוקסצין ממוקמים בעיקר בששת אתרי המוטציות (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) של הגן gyrA 12. גילוי מנגנוני עמידות אלה המבוססים על מוטציות גנטיות הוביל למעבר הדרגתי בזיהוי H. pylori דרך מחקרים מבוססי תרבות לבדיקות מולקולריות.
באופן כללי, קיים צורך קליני דחוף בשיטת אבחון לא פולשנית, יעילה וסימולטנית לאיתור זיהומים בהליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. אימצנו בדיקת מחרוזת משולבת ושיטת qPCR כדי להתגבר על קשיי הדגימה ולהשיג את המטרה של זיהוי סימולטני של זיהום H. pylori ועמידות לתרופות באמצעות בדיקות פריימר שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר הנוכחי נערך בהתאם לשיקולים אתיים שנקבעו על ידי הוועדה האתית של בית החולים העממי המחוזי גואנגדונג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית, גואנגג'ואו, סין (מספר אישור: KY-Q-2022-384-02). חולים בטווח הגילאים 18-60 נכללו במחקר זה. חולים הנוטלים אנטיביוטיקה, תרופות סיניות אנטיבקטריאליות, תרופות כגון מעכבי משאבת פרוטונים (PPI), או אנטגוניסטים לקולטן H2 וכו ', בתוך שבועיים לפני הבדיקה לא נכללו במחקר זה. חולים שקיבלו טיפול נגד H.pylori בשלושת החודשים האחרונים לא נכללו גם במחקר זה. אנשים עם בעיות לב, כבד, כליות, נוירופתיה חמורה או מחלות נפש לא הורשו גם הם להשתתף במחקר זה. במחקר זה לא נכללו נשים הרות ואמהות מניקות. פירוט האספקה (ריאגנטים, כימיקלים, ציוד ותוכנות) שנעשה בהם שימוש במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.
1. בדיקת מחרוזת לדגימת מי קיבה
- בקשו מהמטופל לצום לילה לפני איסוף הדגימה.
- למחרת, פתחו את ערכת בדיקת המיתרים, קחו את הקפסולה והחזיקו את הלולאה בקצה המיתר.
- הדביקו את החוט על לחיו של המטופל, ובקשו ממנו להניח את הקפסולה על לשונו בסמוך לחלק האחורי של הגרון ולבלוע אותה בלגימת מים.
- יש לאפשר לקפסולה להתמוסס בקיבתו של המטופל, ובכך לחשוף את החוט בתוך הקפסולה לספיגת ריר קיבה.
- בקש מעוזר מיומן למשוך את החוט בזהירות שעה אחת לאחר שהמטופל בלע את הקפסולה.
- חתכו את הקצה התחתון של החוט (40 ס"מ) הספוג בנוזל הקיבה, הניחו אותו בתמיסת שימור הדגימות TSE (Tris/מלוחים/EDTA), ולאחר מכן שלחו אותו למעבדה הקלינית בטמפרטורת החדר (RT) לגילוי הבא של H. pylori ולקביעת פרופילי העמידות לאנטיביוטיקה באמצעות qPCR.
2. מיצוי DNA
- הניחו את המבחנות נושאות הדגימות על מדף מבחנה, מסומן כראוי, וערבבו אותן במשך 10 שניות.
- הפוך את צלחת 32 הבארות (מיצוי חומצת גרעין או ערכת טיהור) מספר פעמים כדי להשהות מחדש את החרוזים המגנטיים. לאחר מערבולת קצרה במשך 10 שניות, הסירו בזהירות את איטום רדיד האלומיניום מהצלחת.
- העברת 200 μL של נוזל קיבה מכל דגימה ו- H. pylori DNA כבקרה חיובית לבארות נפרדות.
- הניחו את צלחת 32 הבארות בחריץ הדגימה המתאים של מכונת מיצוי חומצות הגרעין למיצוי DNA אוטומטי.
- לאחר מיצוי ואישור DNA, התחל את בדיקת עמידות לאנטיביוטיקה עבור clarithromycin ו levofloxacin באמצעות qPCR על הדגימות החיוביות.
- הניחו את נוזל הקיבה העודף ואת דגימות הדנ"א שחולצו בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך ולשימוש עתידי.
- בצע את כל השלבים הללו בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום.
3. qPCR לאיתור H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה (clarithromycin ו levofloxacin)
- לבצע qPCR לזיהוי H. pylori ואת המוטציות החשודות עמידות לאנטיביוטיקה בגנום שלה.
- הפשיר את תערובת תגובת qPCR (ערכת זיהוי חומצות גרעין H. pylori ) על קרח, וערבב אותה על ידי תנועה וסיבוב כדי למנוע אובדן של מגיב.
- עבור כל דגימה על צלחת של 32 בארות, ערבבו 20 μL של תערובת תגובת PCR (premix של תגובת גנוטיפ [המכיל את האנזים Taq, deoxyribonucleoside triphosphate, מאגר תגובה ומגנזיום כלורי], עם פריימרים קדימה ואחורה של ureA , ובדיקת אורייא), ו-5 μL של הדנ"א שחולץ.
- הפעל את צלחת qPCR 32 באר במחשב qPCR. תכנת את המחזור התרמי: תערובת התגובה תגיב תחילה ברצף ב- 42 ° C ו- 95 ° C (שניהם למחזור אחד) למשך 2 דקות כל אחד; לאחר מכן, 40 מחזורים ב 95 ° C, denaturation במשך 10 שניות, ו חישול והרחבה ב 58 ° C במשך 45 שניות.
- הגדר את קליטת האות הפלואורסצנטי ל- FAM (H. pylori) ואת רכישת הנתונים לתקופת הארכת ההגברה. לאחר השלמת התגובה, שמור את הנתונים לניתוח תוצאות עתידיות.
- נתח את הנתונים באמצעות תוכנה ספציפית עבור qPCR, מכיוון שהמכשיר יבחר באופן אוטומטי ערכי סף בסיסיים.
- אם תוצאת הבדיקה עבור H. pylori חיובית, המכונה תתחיל באופן אוטומטי בדיקות עמידות לתרופות על הדגימה. החלף את ערכת המגיב בריאגנטים לאיתור מוטציות בגן rRNA 23S ובגן gyrA בערכת H. Pylori (qPCR).
הערה: ערכת המגיבים (ריאגנטים לגילוי מוטציות בגן 23S rRNA ובגן gyrA בהליקובקטר פילורי [qPCR]) כוללת את תערובת תגובת ה-PCR (תערובת קדם-תגובה גנוטיפית [המכילה את האנזים Taq, טריפוספט דאוקסיריבונוקלאוזיד, מאגר תגובה, מגנזיום כלורי], פריימרים ובדיקות בדיקה). כל מוצרי בקרת האיכות השלילית הם מים סטריליים ומטוהרים. מוצר בקרת האיכות החיובית בערכת זיהוי חומצות הגרעין H. pylori הוא חרוזים סטנדרטיים של H. pylori (ATCC 43504). תוצרי בקרת האיכות החיוביים החזקים של H. pylori וחיוביים חלשים בערכה (ריאגנטים לגילוי מוטציות בגן rRNA 23S ומוטציות בגן gyrA ב- H. pylori) הם ה- DNA של זן H. pylori המומת המכיל את גן המטרה ואת הגן המוטנטי. באופן דומה, בהתבסס על המצב בפועל, כל תקני האבחון, כולל נוכחות של זיהום H. pylori או עמידות לתרופות, מוגדרים ל- CT ≤ 35 ויש להם עקומה טיפוסית בצורת S. ריכוז בקרת האיכות החלשה הוא 1.0 x 103 עותקים / מ"ל, ואילו ריכוז בקרת האיכות החזקה הוא 1.0 x 108 עותקים / מ"ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי זיהום H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה בנוזל הקיבה על ידי qPCR
ביצענו qPCR לזיהוי זיהום בהליקובקטר פילורי על-ידי הגברת הגן אורייא, וקבענו את פרופיל העמידות שלו לאנטיביוטיקה על-ידי מיקוד מוטציות נקודתיות בגן rRNA 23S ובגן gyrA (טבלה 1). ערכי בקרת האיכות של CT בכל שלוש הקבוצות של ניסויי qPCR היו בטווח המומלץ, מה שמצביע על כך שכל הדגימות היו במצב תקין בזמן הניסוי ושתוצאות הבדיקה היו אמינות. במחקר זה נבחרו חמש דגימות עם תוצאות בדיקה שונות (S1-S5) כדי לאפיין את אמינות פרוטוקול הניסוי. S1 מייצג זן מייצג של H. pylori ללא זיהום, בעוד שדגימות S2-S5 הן אלה שנגועות ב-H. pylori עם תוצאות עמידות שונות (איור 1). קבענו שהמערכת לא תבצע בדיקות עמידות נוספות עם הדגימות שלא נדבקו בהליקובקטר פילורי, כך שדגימת S1 לא נכנסה לבדיקת ההתנגדות לאחר שבדיקת המערכת הראתה תוצאה שלילית להליקובקטר פילורי. מבחינת הדגימות החיוביות לזיהום H. pylori, ערכי ה- CT S2 היו כולם בטווח האיתור, מה שמצביע על כך שהדגימה הייתה חיובית ל- H. pylori והראתה עמידות כפולה לקלריתרומיצין ולבופלוקסצין, והומלץ לרופאים לבחור שיטות אחרות לטיפול לפי שיקול דעתם. ערכי ה-CT של S3 היו בטווח הזיהוי של זיהום H. pylori ובדיקת עמידות ל-levofloxacin, בעוד שבבדיקת העמידות לקלריתרומיצין לא זוהו ערכי CT, מה שמצביע על כך שדגימת S3 הגיעה מחולה עמיד ללבופלוקסצין. באופן דומה, ערך ה-CT של דגימת S4 היה בטווח הזיהוי של זיהום H. pylori ועמידות לקלריתרומיצין, בעוד שלא זוהה ערך CT עבור עמידות ללבופלוקסצין, מה שמצביע על כך שחולה זה היה עמיד לקלריתרומיצין, והומלץ להם לקחת levofloxacin לטיפול. לבסוף, בדיקת הדגימה S5 הראתה ערכי CT בטווח הגילוי רק לזיהוי זיהום H. pylori, מה שמצביע על כך שחולה זה היה רגיש לשתי האנטיביוטיקות וניתן היה לטפל בו באמצעות אחת משתי התרופות. בהשוואה לשיטת תרבית החיידקים, המזהה גם זיהום בהליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות, שיטה זו בטוחה ויעילה באיתור זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות מבלי לגרום נזק למטופל וניתן להשתמש בה כדי להנחות את הרופא בגיבוש תוכנית טיפול מתאימה.
איור 1: זיהוי של H. pylori והעמידות שלו לאנטיביוטיקה בנוזל הקיבה על-ידי qPCR.
(A) הגברה כמותית של PCR של זיהום H. pylori , (B) זיהוי עמידות לקלריתרומיצין, ו-(C) זיהוי עמידות ללבופלוקסצין. "S" מייצג מדגם. "S1" היא דגימה שחזרה שלילית לזיהום H. pylori ונבדקה גם לעמידות לאנטיביוטיקה; "S2" הוא מדגם נגוע H. pylori עם עמידות הן clarithromycin ו levofloxacin; "S3" הוא גם מדגם H . pylori-חיובי אבל הוא רגיש clarithromycin-susptable ו levofloxacin-resistant; "S4" הוא גם מדגם H . pylori-חיובי אבל הוא עמיד clarithromycin-sceptible; "S5" הוא מדגם H. pylori-חיובי אבל הוא רגיש הן clarithromycin ו levofloxacin. ריכוז בקרת האיכות החלשה הוא 1.0 x 103 עותקים / מ"ל, ואילו ריכוז בקרת האיכות החזקה הוא 1.0 x 108 עותקים / מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| לדוגמה | ה. פילורי | קלריתרומיצין | לבופלוקסצין | |||
| +/- | סי.טי | +/- | סי.טי | +/- | סי.טי | |
| S1 | - | U | - | U | - | U |
| S2 | + | 22.61 | + | 22.77 | + | 23 |
| S3 | + | 28.32 | - | U | + | 30.18 |
| S4 | + | 28.76 | + | 27.67 | - | U |
| S5 | + | 31.59 | - | U | - | U |
טבלה 1: טבלה המציגה את תוצאות qPCR של זיהוי זיהום H. pylori ועמידות Clarithromycin ו levofloxacin. טבלה זו מציגה את התוצאות האיכותיות של זיהום H. pylori , זיהוי מוטציות בגן rRNA 23S המראות כי המבודד עמיד לקלריתרומיצין, ואיתור מוטציות בגן gyrA המראות כי המבודד עמיד ללבופלוקסצין. +/−, תוצאה איכותית; +, תוצאה חיובית; −, תוצאה שלילית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי H. pylori יכול להתבצע בשיטות פולשניות ולא פולשניות13. טכניקות פולשניות נפוצות כגון היסטופתולוגיה, בדיקת אוראז מהירה, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ותרבית חיידקים דורשות אנדוסקופיה וביופסיה. בדיקות סרולוגיות, בדיקות נשימה של אוריאה ובדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISA) מומלצות בין ההליכים הלא פולשניים14. בעוד ששיטות לא פולשניות קלות לביצוע, חסכוניות ונוחות יותר לחולים, הבידוד והטיפוח של H. pylori לביצוע בדיקות נוספות, כגון זיהוי זנים ובדיקות רגישות לאנטיביוטיקה, דורשים בדיקות פולשניות. עם העלייה הנוכחית בעמידות לאנטיביוטיקה, אנטיביוטיקה בשימוש בעבר הופכת ללא יעילה, ולכן נכשלת בטיפול בזיהום הנגרם על ידי מבודד H. pylori עמיד לתרופות. במקרה זה, אחזור H. pylori כדי לבצע בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה עשוי להידרש כדי לבחור את האנטיביוטיקה כי סביר להניח בהצלחה לחסל את החיידקים עמידים.
לבדיקות רגישות מבוססות תרבית שנערכות באופן שגרתי כגון שיטת דילול אגר ובדיקת אפסילומטר (E-test) יש מספר מגבלות: הן גוזלות זמן, שכן H. pylori הוא חיידק הגדל לאט, יקר, מבוסס מיומנות, ודורש טכניקות פולשניות. לסירוגין, טכניקות שונות מבוססות מולקולרית, כגון טכניקות הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ו-qPCR, יכולות לשמש לזיהוי מספר מוטציות, כגון בגן rRNA 23S, המקודד עמידות נגד קלריתרומיצין15,16. שלושה אתרי מוטציה נקודתיים (A2142G, A2143G, A2142C) של הגן 23S rRNA עמידות של H. pylori ושישה אתרי מוטציה נקודתיים (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) של גן עמידות gyrA של אנטיביוטיקה קינולון נבחרו לתכנון פריימרים ובדיקות כדי לקבוע עמידות נגד clarithromycin ו levofloxacin, בהתאמה.
בדיקת המיתרים, שמקורה ב-ENTEO-TEST, משתמשת בקפסולה המחוברת לחוט ניילון בעל כושר ספיגה גבוה, הנבלע כדי לאסוף הפרשות קיבה17. כיום, בדיקות מיתרים שימשו לאבחון שחפת18, כדי להבדיל בין דלקת ריאות קלבסיאלה אלימה מאוד (hvKp) לבין דלקת ריאות קלבסיאלהמסורתית 19, כדי לזהות חיידקים ושמרים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, וכדי לאבחן H. pylori מנוזל קיבה20. במחקר זה, שילבנו את בדיקת המיתרים, טכניקה זעיר פולשנית, עם qPCR לזיהוי זיהומים של H. Pylori במערך קליני וביצענו בדיקות רגישות על ידי התמקדות במוטציות מקודדות עמידות שדווחו בעבר בגנום H. pylori. בחרנו בגן אוריאה A מכיוון שהוא גן ייחודי להליקובקטר פילורי ללא סיכון פוטנציאלי לתגובה צולבת עם אורגניזמים אחרים. כל המבודד של H. pylori חייב להיות בעל הגן ureA כדי לשרוד בקיבה האנושית, וניסויים נוק-אאוט הראו כי H. pylori ללא הגן ureA אין את היכולת ליישב בקיבה.
עבור qPCR, תקני בקרת איכות חשובים ביותר. בזיהוי qPCR של H. pylori, הדרישות של תקני בקרת האיכות הן כדלקמן: מוצר בקרת איכות שלילית (אין עלייה באות פלואורסצנטי במסלול זיהוי FAM, אין עקומת הגברה טיפוסית מסוג S, ערך CT > 35.00 או ללא אות ברור); מוצר בקרת איכות חיובי (עקומת צמיחת אות פלואורסצנטי של מסלול זיהוי FAM המציגה עקומה בצורת S, ערך CT ≤ 35.00), ויש לעמוד בדרישות לעיל בו זמנית; אחרת, הבדיקה תיחשב פסולה ויש לבצעה שוב. יתר על כן, עבור זיהוי qPCR של עמידות H. pylori לאנטיביוטיקה (clarithromycin ו levofloxacin), למעט ערך CT המבדיל בין תוצאות חיוביות ושליליות, אשר משתנה ל 30.00 לזיהוי עמידות, הדרישות האחרות זהות לעיל. יש לציין כי מידע הרצף על הפריימרים והבדיקות אינו זמין במאמר זה מכיוון שהוא כרוך בזכויות קניין מסחריות.
על מנת לבחור אנטיביוטיקה יעילה יותר עבור כל חולה, חיוני לסקור את השכיחות המקומית של H. pylori ואת פרופיל העמידות האנטיביוטית שלו בשל העמידות האנטי-מיקרוביאלית המוגברת בעולם, ובנוסף, בשל השונות בדפוסי העמידות בין אזורים גיאוגרפיים שונים. המגבלה העיקרית של המחקר שלנו היא שגודל המדגם היה קטן מאוד ולא כיסה אזורים גיאוגרפיים שונים בסין כדי להראות את שכיחות זיהום H. pylori ואת פרופיל העמידות המלא שלו לאנטיביוטיקה, אך טכניקת בדיקת המיתרים מפותחת היטב, ועל ידי שילובה עם qPCR, השגנו אבחנה סימולטנית של H. pylori זיהוי זיהום ועמידות לתרופות. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש בגישה זו בקנה מידה גדול יותר באזורים שונים בעולם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Sanming של רפואה בשנג'ן (מענק מס '. SZSM201510050) וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (מענק מס' 2022A1515220023). קרן המחקר לכישרונות מתקדמים של בית החולים העממי המחוזי גואנדונג (לא. KJ012021097), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81871734, 82072380, 82272423). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה לפרסם או בהכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
