Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.
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Artigo de método
Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As doenças neurodegenerativas da retina são as principais causas de cegueira. Dentre as inúmeras estratégias terapêuticas exploradas, o estímulo à auto-reparação emergiu recentemente como particularmente atraente. Uma fonte celular de interesse para o reparo da retina é a célula glial de Müller, que abriga potencial de células-tronco e extraordinária capacidade regenerativa em anamniotas. Este potencial é, no entanto, muito limitado em mamíferos. O estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração retiniana em modelos animais com capacidades regenerativas deve fornecer informações sobre como desbloquear a capacidade latente das células de Müller de mamíferos de regenerar a retina. Este é um passo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na medicina regenerativa. Para isso, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus: uma lesão retiniana mecânica, uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase, um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e um modelo citotóxico conduzido por injeções intraoculares de CoCl2 . Destacando suas vantagens e desvantagens, descrevemos aqui esta série de protocolos que geram várias condições degenerativas e permitem o estudo da regeneração retiniana em Xenopus.
Introdução
Milhões de pessoas em todo o mundo são acometidas por várias doenças degenerativas da retina que levam à cegueira, como retinose pigmentar, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Até o momento, essas condições permanecem em grande parte intratáveis. As abordagens terapêuticas atuais em avaliação incluem terapia gênica, transplantes de células ou tecidos, tratamentos neuroprotetores, optogenética e dispositivos protéticos. Outra estratégia emergente baseia-se na autorregeneração por meio da ativação de células endógenas com potencial de células-tronco. As células gliais de Müller, o principal tipo de célula glial da retina, estão entre....
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Protocolo
Os cuidados com os animais e a experimentação foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais, sob a licença institucional A91272108. Os protocolos do estudo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados com animais CEEA #59 e receberam autorização da Direção Départementale de la Protection des Populations sob o número de referência APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados nesses protocolos.
1. Lesão mecânica da retina
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Resultados
Lesão mecânica da retina
Cortes retinianos de girinos submetidos à lesão mecânica descrita no protocolo seção 1 mostram que a lesão retiniana abrange todas as camadas do tecido enquanto permanece limitada ao local da punção (Figura 2A,B).
Ablação condicional de células bastonetes utilizando o sistema NTR-MTZ
Os olhos de girinos transgênicos de Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados com MTZ, conforme .......
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Discussão
Vantagens e desvantagens de vários paradigmas de lesão retiniana em girinos Xenopus
Lesão mecânica da retina
Várias lesões cirúrgicas da retina neural foram desenvolvidas em girinos de Xenopus. A retina neural pode ser totalmente removida 15,16 ou apenas parcialmente excisada 16,17. A lesão mecânica aqui apresentada não env.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de M.P. da Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) em parceria com ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-propanodiol (propilè ne glicol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Etanol absoluto ≥ 99,8% | de produtos químicos VWR | 20821-365 | |
| anticorpo anti-caspase clivada 3 (coelho) | Sinalização celular | 9661S | Diluição 1/300 |
| Anticorpo anti-GFP (frango) | Aveslabs | GFP-1020 | Diluição 1/500 |
| Anticorpo anti-M-Opsina (coelho) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Diluição 1/500 |
| Anticorpo secundário anti-rato, Alexa Fluor 594 (cabra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Diluição 1/1.000 |
| Anticorpo anti-Otx2 (coelho) | Abcam | Ab183951 | Diluição 1/100 |
| Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 488 (cabra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Diluição 1/1.000 |
| Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 594 (cabra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Diluição 1/1.000 |
| Anticorpo anti-recuperaina (coelho) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Diluição 1/500 |
| Anticorpo anti-rodopsina (camundongo) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Diluição 1/1.000 |
| Anticorpo anti-S-Opsina (coelho) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Diluição 1/500 |
| Kit de detecção de Apoptotis (sistema TUNEL fluorimétrico sem saída) | Promega | G3250 | |
| Benzocaína | Sigma-Aldrich | E1501 | Solução de estoque 10% |
| bisBenzimida H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Solução de estoque 10 mg / mL |
| Butanol-1 ≥ 99,5% | Produtos químicos VWR | 20810,298 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1,02382 | Uso a 0,1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass modelo GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cloreto de cobalto(II) hexahidratado (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Solução de estoque 100 |
| mM Lamínula 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Diluente Dako REAL ab | Agilent | S202230-2 | |
| Dimetil sulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Micrótomo Rotativo Eletrônico | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosina 1% aquosa | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluoresceína lisina dextrana | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Olympus | SZX 200 | ||
| Gentamicina | Euromedex | EU0410-B | |
| Albumina de glicerina de acordo com Mallory | Diapath | E0012 | Uso a 3% em água |
| Hematoxilina (Hemalun de Mayer) | Diagnóstico RAL | 320550 | |
| HEPES sal | de potássioSigma-Aldrich | H0527 | |
| Hormônio gonadotrofina coriônica humana | MSD Saúde Animal | Chorulon 1500 | |
| Ácido clorídrico fumegante, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1,00314 | |
| Cloridrato de L-cisteína monohidratado | Sigma-Aldrich | C7880 | Use a 2% em 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0) |
| Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4, 7H< sub>2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazol | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use em pontas |
| de microcarregador | mM Eppendorf | 5242956003 | |
| Extrator de micropipeta (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Modelo P-97 | Programa: Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Desbloqueado p = 500 |
| Meio de montagem para preservar a fluorescência, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Meio de montagem, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Lâmina de micrótomo | Epredia | 3053835 | |
| Agulha Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Suporte de Pino Niquelado | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Tecido de filtração de nylon (tecido de peneiramento) NITEX, abertura de malha 1.000 µ m | Sefar | 06-1000/44 | |
| Histowax de parafina sem DMSO | Histolab | 00403 | |
| Solução de paraformaldeído (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use a 4% em 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Descartáveis Moldes de Incorporação | Epredia | 2219 | |
| Pilão | VWR | 431-0094 | |
| Placa de Petri 100 mm | Placa de Petri Corning Gosselin | SB93-101 | |
| 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Tampão de Fosfato Solução Salina (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| Sistema de Microinjeção PicoSpritzer | de Instrumentação Parker | PicoSpritzer III | |
| Ferramentas de Fine Science | 26002-20 | ||
| Polissacarose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use a 3% em 0.1x MBS |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Alimento para fritar em pó: sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Dissecção de tesoura | Ferramentas Fine Science | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Vidro | VS11171076FKA | |
| Aquecedor de lâminas | Kunz instruments | HP-3 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Citrato de sódio sal trissódico di-hidratado (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR produtos químicos | 27833.294 | |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Hidróxido de sódio 30% solução aquosa (NaOH) | Produtos químicos VWR | 28217-292 | |
| Estereomicroscópio | Seringas Zeiss | Stemi 2000 | |
| Seringas Omnifix-F Solo Seringas de uso único 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| crRNA transativador (tracrRNA) | Tecnologias | de DNA integradas | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Iluminador de Fluorescência | X-Cite | 200DC | |
| Xileno ≥ 98,5% | Produtos químicos da VWR | 28975-325 |
Referências
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of t....
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Reimpressões e permissões
