Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.
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Artigo de método
Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os glomérulos são unidades fundamentais no rim; portanto, o estudo dos glomérulos é fundamental para a compreensão da função renal e da patologia. As imagens biológicas fornecem informações intuitivas; Assim, é de grande importância rotular e observar os glomérulos. No entanto, os métodos de observação de glomérulos atualmente em uso requerem operações complicadas, e os resultados podem perder detalhes do rótulo ou informações tridimensionais (3D). A tecnologia de limpeza de tecido de análise computacional (CUBIC) tem sido amplamente utilizada em pesquisas renais, permitindo uma detecção mais precisa e profundidade de detecção mais profunda. Descobrimos que os glomérulos de camundongos podem ser marcados rápida e efetivamente por injeção na veia caudal de FITC-Dextran de peso molecular médio seguida pelo método de limpeza cúbica. O rim de camundongo limpo poderia ser escaneado por um microscópio de folha de luz (ou um microscópio confocal quando fatiado) para obter pilhas de imagens tridimensionais de todos os glomérulos em todo o rim. Processados com software apropriado, os sinais dos glomérulos poderiam ser facilmente digitalizados e posteriormente analisados para medir o número, volume e frequência dos glomérulos.
Introdução
O número e o volume dos glomérulos são muito importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças renais1,2,3,4,5. O padrão-ouro da estimativa do número de glomérulos é a combinação dissector físico/fracionador. Entretanto, esse método requer reagentes e equipamentos especiais, tornando-o lento e dispendioso 6,7,8,9. A biópsia fornece uma riqueza de informações, mas ob....
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Protocolo
Camundongos adultos C57BL/6 (6 semanas de idade, 25-30 g) foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas locais de bem-estar animal e ética experimental. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan.
1. Marcação de glomérulos e preparação de tecidos
- Rotulagem de glomérulos
- Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar a solução de sonda de trabalho.
NOTA: A solução de trabalho pode ser armazenada a 4 ....
- Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar a solução de sonda de trabalho.
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Resultados
Este estudo fornece um método simples e eficiente para marcar e analisar os glomérulos em rins de camundongos.
Os glomérulos (vasos sanguíneos) podem ser bem marcados por FITC-Dextran injetado intravascularmente. Após o clareamento, o rim tornou-se transparente (Figura 1A), e os glomérulos puderam ser claramente observados por meio de microscopia óptica (Figura 1B) ou microscopia confocal (Figura 1C). A m.......
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Discussão
As tecnologias de desobstrução tecidual podem ser classificadas em 3 ou 4 grupos 29,30,31. A limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos (por exemplo, DISCO e PEGASOS), a limpeza de tecidos à base de água (por exemplo, CUBIC) e a limpeza de tecidos incorporados a hidrogel (por exemplo, CLARITY) foram aplicadas na limpeza renal 25,26,28,32.
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Divulgações
Todos os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82204951) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020JDRC0102).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixação reaagen |
| 502 Cola | Deli | 7146 | Para fixar o rim ao adaptador de fixação de amostras |
| Antipirina | Aladdin | A110660 | Reagente de limpeza |
| Matriz cerebral | RWD Ciências da vida | 1mm 40-75 | Corte de tecido |
| Microscopia confocal | Nikon | A1plus | Aquisição |
| de imagem FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Reagente de marcação |
| Microscopia de fluorescência de folha de luz | Folha Zeiss | Light 7 | Aquisição de imagem |
| Camundongos | Ensiweier | Camundongos adultos C57BL/6 (6 semanas de idade, 25– 30 g) | |
| N-Butildietanolamina | Aladdin | B299095 | Reagente de limpeza |
| Nicotinamida | Aladdin | N105042 | Reagente de limpeza |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Fixador de veias da cauda | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fixe o mouse para injeção de vail |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagente de limpeza |
Referências
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Hum....
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Reimpressões e permissões
