Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Resumo

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Resumo

Um grande desafio na compreensão das causas da infertilidade feminina é elucidar os mecanismos que regem o desenvolvimento das células germinativas femininas, denominadas ovócitos. Seu desenvolvimento é marcado pelo crescimento celular e subsequentes divisões, duas fases críticas que preparam o ovócito para a fusão com os espermatozoides para iniciar a embriogênese. Durante o crescimento, os ovócitos reorganizam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, um evento preditivo do sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos e, portanto, de seu potencial embriogênico. Em ovócitos de camundongos, essa reorganização citoplasmática mostrou-se impulsionada pelo citoesqueleto, cuja atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo. Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica de organelas de processamento de RNA nuclear conhecidas como condensados biomoleculares. Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar, com alta resolução temporal, o impacto do citoesqueleto no núcleo através de escalas espaciais em ovócitos de camundongos. Detalha as etapas e ferramentas de análise de imagem e imagem necessárias para avaliar i) atividade citoesquelética no citoplasma do oócito, ii) agitação do núcleo do oócito baseada no citoesqueleto e iii) seus efeitos na dinâmica do condensado biomolecular no nucleoplasma do oócito. Além da biologia oocitária, os métodos aqui elaborados podem ser adaptados para uso em células somáticas para abordar similarmente a sintonia baseada no citoesqueleto da dinâmica nuclear em escalas.

Introdução

O posicionamento nuclear é essencial para múltiplas funções celulares e de desenvolvimento 1,2,3,4,5. As células germinativas femininas de mamíferos denominadas ovócitos remodelam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, apesar de sofrerem uma divisão assimétrica no tamanho, que depende da descentralização cromossômica⁶ (Figura 1). Essa centralização do núcleo prediz o sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos ^7,8 e, portanto, seu potencial embriogênico (Figura 1).

O remodelamento citoplasmático em ovócitos de camundongos é conduzido principalmente pelo citoesqueleto da actomiosina9⁽Figura 2). Sua atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo¹⁰ (Figura 2). Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica das organelas processadoras de RNA mensageiro nuclear denominadas speckles nucleares¹¹, uma das várias organelas sem membrana no núcleo conhecidas como condensados biomoleculares 12,13,14,15,16 (Figura 2).

A imagem ao vivo tem sido decisiva para decifrar as implicações funcionais da agitação nuclear. Filmes de migração nuclear ao longo de horas, bem como filmes de alta resolução temporal da tela de actina e do citoplasma em massa, contribuíram em grande parte para a elaboração de um modelo teórico de posicionamento nuclear, relacionando diferentes escalas de^tempo9. Além disso, filmes de alta resolução temporal do citoplasma, contorno nuclear e componentes nucleares, como cromatina e condensados nucleares, destacaram o papel da agitação do núcleo baseada no citoesqueleto no processamento de RNA e expressão gênica em ovócitos de camundongos, fazendo a ponte entre diferentes escalas espaço-temporais dentro da^célula10,11. Em conjunto, essa abordagem de cruzamento de escalas baseada em imagens ao vivo forneceu o primeiro raciocínio ligando a agitação do citoesqueleto do núcleo ao sucesso do desenvolvimento dos ovócitos.

O protocolo fornece o pipeline de análise de imagens e imagens usado para estudar a transmissão de forças citoplasmáticas (geradas principalmente por F-actina e em parte por microtúbulos) para o núcleo e seus componentes internos em ovócitos de camundongos. O resultado desses experimentos é capturar o contínuo de forças em escalas espaciais, desde o citoesqueleto no citoplasma até o interior nuclear, por meio de filmes de alta resolução temporal, como mostrado em dois estudos recentes^10,11, que estabeleceram a ligação entre movimentos ativos citoplasmáticos, flutuações do contorno nuclear, bem como flutuações de movimento e superfície de um único tipo de condensados biomoleculares nucleares: manchas nucleares. A mesma abordagem pode ser aplicada a outros sistemas modelo onde se espera que as forças citoplasmáticas mudem, como no contexto de células cancerosas^malignas17.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Comunidade Europeia e aprovados pelo Ministério da Agricultura francês (autorização nº 75-1170) e pela Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; Acordo OGM número DUO-5291). Os camundongos foram alojados no biotério em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura ambiente de 22-24 °C e umidade de 40%-50%. Os camundongos usados aqui incluem fêmeas OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de idade) e fêmeas C57BL/6 (10 a 14 semanas de idade).

1. Coleta e preparo de ovócitos

1. Coletar ovócitos de camundongos de 8 a 14 semanas de idade, conforme descrito em¹⁸ e¹⁹.
   1. Resumidamente, primeiro extrato de ovários de camundongos como em¹⁸ em meio pré-aquecido (37 °C) M2+Bovino Serum Albumina (BSA) suplementado com 1 μM de Milrinona¹⁹, que impede a retomada da meiose em ovócitos.
   2. Punção de folículos ovarianos com agulhas cirúrgicas para liberação de ovócitos em crescimento dos folículos antrais (fim do crescimento oocitário²⁰).
   3. Coletar ovócitos do tamanho necessário para experimentos (ovócitos em crescimento e/ou totalmente crescidos) com uma micropipeta especializada para coleta de ovócitos, antes de lavar e passar para pratos com meio fresco sob óleo mineral.
2. Dissociar mecanicamente os ovócitos das células foliculares antrais por pipetagem para cima e para baixo e deixar estabilizar por 1 h na incubadora a 37 °C antes de prosseguir com as etapas experimentais subsequentes.
   NOTA: Os ovócitos são mantidos a 37 °C durante todas as etapas experimentais. Para este protocolo, foram coletados os ovócitos maiores, que são os mais crescidos.

2. Microinjeção de ovócitos

NOTA: Para capturar a atividade baseada no citoesqueleto no citoplasma, imagens ao vivo de campo brilhante são usadas. Portanto, não é necessária a microinjeção de marcadores fluorescentes, e o protocolo pode ser retomado na etapa 3. Para obter a imagem do contorno nuclear, foi utilizada a sonda Rango, que exibia a etiqueta YFP em seu término N e uma tag CFP em seu término C^21,22. Quando fotografado em ovócitos a 488 nm, ele marca todo o núcleo, exceto o nucléolo²³, e exibe um contorno nuclear muito nítido. Para a visualização das manchas nucleares, foi utilizado o SRSF2-GFP (NM_011358), um marcador de manchas nucleares¹¹. O mesmo meio é usado para coleta de ovócitos, microinjeção, tradução complementar de RNA e imagens de células vivas.

1. Linearizar o plasmídeo de Rango com o plasmídeo SfiI ou SRSF2-GFP com enzimas de restrição AgeI.
2. Sintetizar RNAs complementares (cRNA) tampados com o kit de transcrição in vitro apropriado de acordo com o promotor (T3 para Rango e T7 para SRSF2-GFP) e purificá-los usando um kit de purificação em coluna, como descrito anteriormente²⁴.
   NOTA: RNA de poliadenilato SRSF2-GFP usando um kit de poliadenilação para aumentar a estabilidade do cRNA. Dois promotores diferentes são usados devido a diferenças na espinha dorsal do plasmídeo.
3. Meça as concentrações de cRNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
4. Diluir o cRNA de Rango para 1000 ng/μL e o cRNA de SRSF2-GFP para 600 ng/μL em dH₂O.
5. Centrifugar alíquota de cRNA a 4 °C durante, pelo menos, 60 minutos a 25.000 x g antes da microinjeção.
6. Injetar cRNAs que codificam para YFP-Rango ou SRSF2-GFP conforme descrito em^11,25 no citoplasma de ovócitos em meio de 37 °C M2+ BSA+Milrinona usando um microinjetor.
7. Incubar os ovócitos durante pelo menos 2 h em meio de cultura a 37 °C para tradução do cRNA.
8. Depositar ovócitos em pequenas gotículas de meio de cultura (5 μL) em uma placa de cultura de tecido de 35 mm com fundo de vidro coberto com óleo mineral. Coloque um ovócito por gota para evitar o fotobranqueamento dos ovócitos vizinhos.

3. Imagem de células vivas

NOTA: Oócitos vivos de camundongos foram examinados com microscópio confocal invertido equipado com objetiva de imersão em óleo Plan-APO 40x/1,25 NA, plataforma de varredura motorizada, câmara de incubação (37 °C), câmera CCD acoplada a uma roda de filtro e disco giratório. Imagens de alta resolução temporal são adquiridas usando Metamorph (doravante referido como o software de imagem) no modo de aquisição de fluxo.

1. Abra a janela Adquirir do software de geração de imagens.
2. Defina o tempo de exposição para 500 ms, área da câmera no Full Chip e binning em 1.
3. Na guia Adquirir , defina a iluminação para o canal necessário. Para obter imagens da atividade citoplasmática, ilumine os ovócitos com luz transmitida. Para obter imagens do núcleo marcado com YFP-Rango ou SRSF2-GFP, ilumine ovócitos com comprimento de onda de excitação de 491 nm.
4. Para experimentos de agitação citoplasmática ou YFP-Rango, concentre-se no nucléolo do ovócito, que pode ser facilmente observado com a luz transmitida (Figura 3A). Um único avião será adquirido. Para experimentos com speckle nuclear, concentre-se em gotículas SRSF2-GFP (Figura 3C).
5. Na guia Especial , defina parâmetros para otimizar a velocidade de aquisição, conforme abaixo.
   Obturador da câmera: Aberto para exposição
   Modo claro: LIMPAR PRÉ-SEQUÊNCIA
6. Abra a janela Aquisição de fluxo do software de geração de imagens. Defina os parâmetros de streaming de acordo com o experimento. Para ambos os^estudos10,11, utilizamos os parâmetros descritos a seguir.
   1. Na guia Adquirir , defina os seguintes parâmetros.
      Modo de aquisição: Stream para RAM
      Número de quadros: 480 (pode ser reduzido para 240 quadros para diminuir o tempo de imagem)
      Parâmetros da câmera: Adquira imagens na taxa de quadros
      Número (Nb) de quadros a ignorar: 0
   2. Na guia Parâmetros do controlador da câmera digital , defina os seguintes parâmetros.
      Estado da câmera: HALT
      Modo do obturador: ABRIR NUNCA
      Modo claro: LIMPAR PRÉ-SEQUÊNCIA
      Nb de quadros em média: 1
      NOTA 1: No modo de fluxo, uma vez definido o tempo de exposição, a duração do filme é determinada pelo número de quadros. Por exemplo, 500 ms de tempo de exposição e 480 quadros geram um filme de 4 min. Uma visualização pode ser exibida durante a aquisição da imagem.
7. Ajuste uma região de interesse (ROI) ao redor do objeto. Minimizar a área do ROI reduz o tempo de aquisição.
8. Clique em Adquirir na janela Aquisição de fluxo para iniciar o filme.
9. Salve o filme como um arquivo .tif no final da aquisição.
   NOTA: Para acompanhar estruturas nucleares durante filmes de alta resolução temporal, as sondas nucleares (YFP-Rango e SRSF2-GFP) devem ter uma alta relação sinal-ruído para facilitar a segmentação dos objetos durante as etapas posteriores da análise das imagens. Os perfis exógenos de expressão de SRSF2-GFP devem ser comparáveis às imunomarcações nucleares endógenas speckle (Figura 3C-D). Alterações nos perfis de expressão de SRSF2-GFP em relação à coloração endógena podem refletir altas doses de injeção de cRNA e tradução²⁶ (Figura 3C-D).

4. Análise da imagem: Agitação citoplasmática

NOTA: A agitação citoplasmática que reflete a intensidade da atividade citoesquelética baseada em actina em ovócitos é determinada por análises de correlação de imagem usando um software de uma publicação anterior do laboratório⁹ e disponível em²⁷. O software mede quanta intensidade de pixel é conservada entre imagens consecutivas. A saída é a perda de correlação entre as imagens no tempo, começando em 1 e diminuindo exponencialmente com o tempo, como em⁹.

1. Alinhe imagens brutas de lapso de tempo (Δt=0,5 s) usando o plug-in Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Para instalar o plugin StackReg²⁸, ative o site de atualização BIG-EPFL²⁹ para obter acesso ao plugin.
2. Calcule as correlações de imagem de campo claro em 3 a 4 regiões citoplasmáticas de ~300 μm² seguindo as etapas abaixo.
   1. Recorte as regiões e salve-as como arquivos de filme separados. Abra a janela Terminal.
   2. Digite oocyte, pressione a barra de espaço e, em seguida, pressione Enter. Uma janela chamada Signal and Slot é exibida. Escolha os arquivos de filme cortados que serão analisados.
      NOTA: Vários filmes podem ser selecionados ao mesmo tempo.
3. O aplicativo retorna arquivos na mesma pasta que os filmes. Três arquivos diferentes com extensões .csv, .eps e .xls são gerados. O arquivo .xls contém os dados para desenhar os gráficos de correlação para uma região. Valores médios de correlação de diferentes regiões dentro de uma célula.
4. Para fins de clareza visual, transforme os valores finais de correlação subtraindo o valor de cada ponto de tempo de 1 para obter uma curva exponencial invertida como em ¹¹.

5. Análise de imagem: Mapas vetoriais citoplasmáticos

NOTA: Mapas vetoriais citoplasmáticos de oócitos de camundongos foram gerados pelo plugin Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ previamente implementado para detectar fluxos citoplasmáticos em oócitos de camundongos³¹ em Fiji ³² e disponível em ³³. Os mapas mostram a magnitude e direção da velocidade do fluxo citoplasmático, como em⁹ e¹¹.

1. Converta imagens de lapso de tempo de campo brilhante (Δt = 0,5 s) para o formato de 32 bits.
2. Realinhe as imagens com o plugin Fiji StackReg em Plugins > StackReg e escolha Transformação de corpo rígido .
3. Com a pilha de plugins subtrair média móvel jru v2 (em ferramentas Detrend da suíte de plugins STICS), livre-se de estruturas estacionárias no filme subtraindo a imagem de tempo médio do filme. As caixas de seleção Subtrair Média Estática e Subpilha de Saída, selecione Manter Média Espacial e defina o período em 5.
4. Desenhe um ROI em torno do ovócito, excluindo o córtex para evitar efeitos de borda do plugin.
5. Inicie o plugin JRU V2 do mapa STICS (em ferramentas ICS), com tamanho de sub-região de 32 pixels, tamanho de passo de 16 pixels, deslocamento temporal STICS de 3, deslocamentos X e Y de 0, multiplicador de velocidade de 8, limite de magnitude de 0 e caixas de seleção de Normalizar Comprimento Vetorial, Vetores Centrais, Velocidades de Saída e Usar Máscara de Filme.
   NOTA: O plugin gera um mapa do ovócito em formato .tif, exibindo fluxos citoplasmáticos como vetores com cores indicando amplitudes de fluxo, como em⁹ e¹¹, e um arquivo excel com velocidades de fluxo medidas.

6. Análise de imagem: flutuações do contorno nuclear

NOTA: As flutuações do contorno nuclear que refletem a agitação da membrana nuclear podem ser determinadas a partir de filmes de núcleos marcados com YFP-Rango (Figura 4A,C). A análise de imagens para flutuações de contorno nuclear requer Fiji e a instalação dos plugins StackReg (ativar o site de atualização BIG-EPFL²⁹ para obter acesso ao plugin StackReg), PureDenoise³⁴ e Ovocyte_nucleus. O plugin StackReg realiza o registro de imagens para corrigir possíveis movimentos globais. O plugin PureDenoise remove o ruído de imagens multidimensionais corrompidas pelo ruído misto de Poisson-Gaussian e suaviza o contorno nuclear. O plugin Ovocyte_nucleus limita o sinal e preenche o orifício correspondente ao nucléolo para criar uma máscara de núcleo binário, realinhá-lo com StackRreg e calcular a distância r do centroide da máscara de núcleo até a circunferência da máscara para todos os ângulos θ (θ° de 0° a 360° por incremento de 1°), como na Figura 4. Todos os códigos para esses plugins podem ser encontrados em ³⁵.

1. Em Fiji, no menu Plugins > CIRB > Verlhac , selecione Ovocyte Nucleus Shape.
2. Na caixa de diálogo, execute a seguinte seleção.
   1. Selecione a pasta que contém os filmes a serem analisados.
   2. Selecione o ângulo θ (um valor de 1° a 360° pode ser escolhido e um valor de 1° foi usado para a resolução ideal do contorno), as margens para o recorte (recomenda-se 5 μm para manter todo o núcleo).
   3. Selecione a calibração XY e o intervalo de tempo. Clique em OK.
      Observação : os resultados são fornecidos como arquivos de .xls em uma pasta de saída na pasta que contém os filmes originais. Este arquivo exibe todos os raios r medidos para cada tempo t e cada ângulo θ. Um exemplo de arquivo de saída é fornecido na Tabela Suplementar 1. A pasta de saída também contém um filme da máscara do núcleo.
3. Usando uma planilha, calcule o raio médio R em todos os pontos de tempo t para cada ângulo θ definido. Isso permite plotar a forma média ao longo do tempo (Figura 4B). Ver exemplo na Tabela Suplementar 2.
4. Para cada t e θ subtraia o raio médio R ao longo do tempo do raio r. A variância (r-R)² é uma medida das flutuações do envelope nuclear.
5. Calcular a média das flutuações para todos os pontos de tempo t e todos os ângulos θ para cada núcleo e, eventualmente, para todos os núcleos de uma condição.
   NOTA: Quando a forma dos núcleos é significativamente alterada, como no caso de um citoesqueleto rompido, os núcleos marcados com YFP-Rango são girados em Fiji para orientar a parte lisa para cima e a invaginação para baixo, antes de prosseguir com a análise das flutuações do contorno nuclear, como em¹⁰.

7. Análise de imagem: Movimentos de speckle nuclear (dinâmica difusiva)

NOTA: A análise do movimento do speckle nuclear permite deduzir o tipo de dinâmica (dirigida, difusiva ou confinada) dessas organelas a partir de seus rastros.

1. Selecione imagens em modo fluxo de ovócitos expressando gotículas SRSF2-GFP que se movem principalmente no eixo X-Y.
2. Correção para clareamento de imagens time-lapse de ovócitos expressando SRSF2-GFP usando o método de correspondência de histograma em Fiji (Image > Adjust > Bleach Correction).
3. Realinhe as imagens com o plugin Fiji StackReg.
4. Rastreie os centros de droplets SRSF2-GFP usando o plugin Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Pressione Adicionar faixa para iniciar o rastreamento e pressione End Track quando terminar. Não ative a correção de centralização.
5. Copie as trilhas para um arquivo de planilha para prosseguir com os cálculos de Deslocamentos Quadrados Médios (MSD) temporais como em ¹¹ e calcule as DMEs temporais a partir de cada trajetória de gotículas de 20 s.
6. Ajuste de curvas (msd(t) = beta x t^α) com o método de Nelder-Mead utilizando o software R para estimar o expoente de difusão alfa (α).
7. Medir o coeficiente de difusão efetivo para poder comparar as diferentes condições, uma vez que se espera que a difusão seja anômala (α< 1).
8. Calcular o coeficiente de difusão efetivo D_eff a partir de um ajuste linear (alfa=1) nos 40 primeiros pontos (20 s) da curva temporal MSD e normalizar pelo tamanho da gota (D_eff em μm²/s x 3/2 πr em μm).

8. Análise da imagem: Flutuações da superfície do speckle nuclear

NOTA: A evolução do contorno do pontilhado nuclear no tempo, uma leitura da transmissão de força ativa nessas organelas, foi medida com um plugin personalizado Radioak³⁶ para uso em Fiji e disponível em³⁷. O plugin extrai os valores de raios de uma determinada seleção para todos os ângulos ao redor do centro de seleção. A variação da forma ao longo do tempo foi medida comparando-se o valor do raio em relação ao seu valor médio para cada ângulo. O plugin permite quantificar as flutuações de forma e oferece uma opção para visualizar essas dinâmicas. Para instalá-lo, baixe o arquivo Radioak_.jar e coloque-o na pasta plugins de Fiji. Reinicie Fiji. Este plugin é uma versão atualizada do plugin usado para analisar as flutuações do esboço nuclear acima e implementar um pipeline comparável.

1. Em filmes de fluxo de gotículas SRSF2-GFP, selecione gotículas maiores de tamanhos comparáveis (raio ~2,5 μm).
   NOTA: Se as gotículas forem muito pequenas, a resolução insuficiente levará a medições de flutuação de superfície aberrantes.
2. Corte imagens de lapso de tempo de gotículas de 15 s (Δt= 0,5 s) desenhando um retângulo ao redor da gota e selecione Imagem > Corte (Figura 5).
3. Realinhe as imagens com o plugin Fiji StackReg em Plugins > StackReg e escolha Transformação de corpo rígido .
4. Suavizar a imagem para remover o ruído ao redor da gota usando a opção Fiji Smoothen em Process.
5. Crie máscara binária de gota usando a opção Converter em Máscara em Fiji em Processo > Binário. Use o método Default e Dark para o plano de fundo (Figura 5).
6. Analise a máscara de gotícula binária gerada usando a opção Analisar partículas em Fiji em Analisar, selecione as opções Limpar resultados e Adicionar ao Gerenciador e salve a região de interesses (ROIs) no RoiManager (Mais > Salvar) em formato zip para ser lido pelo Radioak. Os ROIs devem ser salvos em uma pasta chamada contornos na mesma pasta dos filmes, em arquivos chamados imagename_UnetCortex.zip para cada filme a ser encontrado pelo Radioak.
7. No menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak , selecione Get Radii para processar apenas um filme ou Do One Folder para analisar todos os filmes da mesma pasta.
   Observação : uma janela aparece para selecionar o número de ângulo e escala. Radioak foi lançado com incrementos angulares de 1° de 0° a 360° (entrada de 360) e os valores de raios foram extraídos.
8. Selecione o filme ou a pasta que contém os filmes a serem analisados. Os resultados são fornecidos como arquivos .xls (um para cada filme) em um diretório radioakres na pasta que contém os filmes originais. Cada arquivo exibe todos os raios medidos (em μm se o parâmetro de escala foi preenchido) para cada tempo t (em corte) e cada ângulo (em radianos; Figura 5; ver exemplo de .xls saída no Quadro Suplementar 3).
9. Na planilha, calcule o raio médio R em todos os pontos de tempo t para cada ângulo definido (veja exemplo na Tabela Suplementar 4). Isso permite plotar a forma média ao longo do tempo.
10. Plotar a variância (r-R)² em μm² que corresponde à medida das flutuações da superfície das gotículas.

Resultados

Os painéis de imagem na Figura 3 mostram exemplos de um ovócito típico totalmente crescido (Figura 3A), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando YFP-Rango (Figura 3B), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando um correto (painel esquerdo; Figura 3C) ou um excessivo (painel direito; Figura 3C) dose de cRNA SRSF2-GFP e imunomarcação de manchas nucleares em um ovócito completamente crescido usando o anticorpo SC35 (Figura 3D). A dose correta de cRNA de SRSF2-GFP para microinjeção foi definida com base em comparações visuais entre perfis de expressão de SRSF2-GFP com perfis endógenos de manchas nucleares.

As forças de agitação citoplasmática em ovócitos, como mostrado por trabalhos anteriores do laboratório usando mapas vetoriais STICS e análise de correlação de imagens (ver⁹ e¹¹), podem ser diminuídas por perturbações do citoesqueleto, tanto genéticas (por exemplo, camundongos mutantes FMN2) quanto químicas (por exemplo, Citocalasina D). Mapas STICS de ovócitos controle exibem numerosos vetores, com cores indicando altas velocidades de fluxo, enquanto mapas de ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas exibem menos vetores, com cores indicando baixas velocidades de fluxo. Da mesma forma, a correlação de imagem é perdida muito rapidamente em ovócitos de controle em comparação com ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas. Isso é observável em curvas de correlação, com uma diminuição mais rápida da curva para ovócitos de controle em comparação com ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas⁹ ou um aumento mais rápido quando a curva é invertida¹¹.

As forças do citoesqueleto agitam o núcleo e suas organelas internas, em particular os condensados nucleares como manchas nucleares^10,11. Na Figura 4A, o núcleo dos ovócitos controle está sujeito a importantes flutuações periféricas, o que é visível com o uso da sonda nuclear YFP-Rango. A forma do núcleo em ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas é estável ao longo do tempo (Figura 4C). A análise das flutuações do contorno nuclear é a chave para quantificar precisamente a agitação. Determinando-se a variância da distância do centroide do núcleo à sua periferia, (r-R)² (Figura 4B), foi possível quantificar as flutuações, mostrando que a agitação nuclear é 6 vezes maior nos ovócitos de controle do que nos ovócitos com forças do citoesqueleto rompidas¹⁰. Na Figura 5A-B, manchas nucleares (gotículas SRSF2-GFP⁺) são mostradas em contextos de controle e ruptura de forças citoplasmáticas em alta resolução temporal. Nos controles, a superfície da gota flutua significativamente mais do que a superfície da gota em ovócitos com forças citoplasmáticas interrompidas, que podem ser visualizadas e quantificadas usando o plugin Radioak³². Visualmente, as cores verde e vermelho (saída Radioak vista nas imagens inferiores da Figura 5A-B) indicam ângulos onde o plugin detectou mudanças de superfície entre imagens consecutivas e o branco indica uma falta de mudanças de superfície.

Figura 1: Ilustração da oogênese tardia de camundongos e embriogênese precoce. Ilustração da centralização do núcleo que ocorre no crescimento tardio do ovócito, da descentralização do cromossomo que ocorre durante a divisão do ovócito e dos passos iniciais (estágios de 1 e 2 células) da embriogênese. Os genomas femininos (núcleo do ovócito e pró-núcleo feminino) estão em rosa, o pró-núcleo masculino está em azul. Os núcleos embrionários (após fusão dos genomas parentais) são roxos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ilustração do remodelamento citoplasmático e nuclear através de escamas em ovócitos de camundongos em crescimento. Esta figura resume os principais achados de ^9,10,11. Ilustração da remodelação baseada em actomiosina do citoplasma, agitação nuclear e remodelamento funcional do condensado biomolecular nuclear em escalas espaço-temporais. O remodelamento cruzado em escala de speckles nucleares aumenta as reações biomoleculares associadas à sua função (i.e., splicing de pré-mRNA). Vale ressaltar que este protocolo permite a avaliação da agitação nuclear apenas em escalas espaciais, mas não temporais, uma vez que todas as imagens são feitas com a mesma resolução temporal de 0,5 s entre os quadros das imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens de amostra do ovócito totalmente crescido e do nucleoplasma. (A) Imagem de campo claro de um ovócito totalmente crescido mostrando cromatina (ciano) que circunda o nucléolo. Um círculo branco pontilhado delineia o núcleo. (B) Núcleo de ovócitos vivos expressando YFP-Rango; notar a ausência de fluorescência no nucléolo. (C) Exemplo de núcleo de oócito vivo expressando SRSF2-GFP após microinjeção de doses corretas de cRNA (painel esquerdo) ou altas doses de cRNA (painel direito); Observe as fases condensada (gotícula) e dissolvida à esquerda e sua ausência na condição à direita. (D) Imunomarcação nuclear speckle em ovócito fixo; observe o perfil de expressão endógeno comparável ao de C (painel esquerdo). Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Saídas de plug-in de controle e flutuações de contorno nuclear interrompidas. (A) Time-lapse de um núcleo de ovócito de controle expressando YFP-Rango (acima) e sua máscara binária correspondente gerada pelo plugin Ovocyte_nucleus (abaixo). (B) Princípio das medições das flutuações do contorno nuclear ao longo do tempo e em uma determinada direção. As direções são definidas por um ângulo giratório θ de 1° incremento de 0° a 360°. Duas formas representativas em t=0 s (amarelo) e t=135 s (roxo) são representadas. A forma azul corresponde à forma média ao longo do tempo. (C) Flutuações do contorno nuclear de um núcleo em um ovócito com forças citoesqueléticas diminuídas devido à ruptura de F-actina (camundongo mutante FMN2) e microtúbulos (tratamento com nocodazol; como em¹⁰). Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Saídas de plug-in de controle e flutuações de superfície de gotículas interrompidas. (A) Colheita de uma gota nuclear SRSF2-GFP de controle fotografada a 500 ms por quadro e mostrada na Ice Look Up Table (LUT) (parte superior); máscara binária da mesma gota gerada por Fiji (centro); e saídas do plugin Radioak após análise das flutuações da superfície da gota (parte inferior), com verde e vermelho indicando ângulos onde o plugin detectou mudanças de superfície entre imagens consecutivas e branco indicando uma falta de mudanças de superfície. (B) Flutuações superficiais de uma gotícula nuclear em ovócitos com diminuição das forças citoesqueléticas devido à ruptura tanto da F-actina quanto dos microtúbulos (como em¹¹). Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Exemplo de saída de análise de plug-in Ovocyte_nucleus. O mesmo núcleo analisado como o mostrado na Figura 4A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Os raios estão em μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Planilha de amostra usada para calcular flutuações do contorno nuclear. O mesmo núcleo analisado como o mostrado na Figura 4A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Tab Raw e média: Os raios estão em μm. Tab r-R: As distâncias r-R estão em μm. Tabela (r-R)²: Os valores de flutuação estão em μm². As guias x e y correspondem às coordenadas cartesianas dos raios da guia Bruto e médio. Eles permitem desenhar a forma média do núcleo ao longo do tempo na guia de forma média. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Exemplo de saída de análise de plug-in Radioak. A mesma gota analisada como a mostrada na Figura 5A. Os raios medidos em momentos e ângulos distintos são mostrados. Os raios estão em μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Planilha de amostra usada para calcular flutuações na superfície de gotículas nucleares. A mesma gota analisada como a mostrada na Figura 5A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Tab Raw e média: Os raios estão em μm. Tab r-R: As distâncias r-R estão em μm. Tabela (r-R)²: Os valores de flutuação estão em μm². As abas x e y correspondem às coordenadas cartesianas dos raios da guia Raw e média. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As principais etapas desse protocolo incluem a microinjeção adequada de ovócitos sem afetar sua sobrevivência ou função normal ^9,10,11, bem como a microinjeção de quantidades pré-definidas de cRNA que permitiriam a visualização correta de estruturas relevantes, como manchas nucleares.

Estabelecer a ligação entre a dinâmica citoplasmática e a dinâmica (intra)-nuclear é essencial quando se estuda como o citoesqueleto agita o núcleo ou seu interior. Este protocolo, com pequenas modificações, permite correlacionar as intensidades de agitação citoplasmática com a dinâmica nuclear das gotículas de YFP-Rango ou SRSF2-GFP (como em¹¹). Para prosseguir, os ovócitos devem primeiro ser filmados por 120 s no modo de campo claro para capturar agitação citoplasmática, antes de serem imediatamente filmados por 120 s com um laser de 491 nm para capturar o contorno nuclear ou a dinâmica das gotículas. No caso de gotículas nucleares SRSF2-GFP, a correlação pode ser simplesmente avaliada comparando-se seus coeficientes de difusão efetivos (ver etapa 7 neste protocolo) com os valores de intensidade máxima invertida de agitação citoplasmática obtidos usando análises de correlação de imagem (ver etapa 4 neste protocolo). Outro ponto importante é o tamanho dos condensados escolhidos para análises das flutuações da superfície das gotículas. Gotículas de diâmetro semelhante devem ser selecionadas para análises comparativas para evitar viés, pois o tamanho modula a intensidade das flutuações da superfície.

Existem algumas limitações para este protocolo. As análises das flutuações do contorno nuclear dependem de colorações intranucleares completas, como YFP-Rango ou NLS-GFP. Para análises em manchas nucleares, a microinjeção de quantidades excessivas de cRNA SRSF2-GFP pode levar a alterações aparentes nas propriedades de separação de fases desse marcador de condensado (Figura 3C), como previamente revisado por outros²⁶. Verificar-se se os perfis de expressão proteica exógena são comparáveis aos endógenos é, portanto, fundamental. Além disso, gotículas relativamente pequenas (raio de <2 μm) devem ser excluídas dos pipelines de análise de flutuação superficial devido a limitações de resolução espacial com as ferramentas aqui definidas. Esse problema de resolução geralmente pode ser resolvido com o uso de microscópios mais resolutivos que, por exemplo, poderiam ser necessários para sondar flutuações superficiais de condensados menores no núcleo do ovócito ou no núcleo significativamente menor das células somáticas.

Em geral, este protocolo permite a captura da agitação baseada no citoesqueleto de actina e microtúbulos do núcleo do ovócito de camundongo através de escamas. Especificamente, permite a documentação da mobilização do citoplasma baseada no citoesqueleto, flutuações do contorno nuclear, juntamente com deslocamentos de pontilhados nucleares semelhantes a líquidos e flutuações de superfície. Embora alguns estudos em outros tipos celulares abordem algumas dessas questões 38,39,40 por meio de protocolos distintos de complexidade variável em escalas espaciais individuais, este protocolo simples fornece as ferramentas necessárias para abordar a dinâmica celular mencionada em múltiplas escalas em um único pipeline de trabalho pela primeira vez. Além disso, os dados gerados a partir dessa abordagem, quando complementados com modelagem biofísica como em^10,11, permitem uma avaliação minimamente invasiva de: i) alterações na mecânica nuclear¹⁰; ii) a transmissão de forças ativas baseadas no citoesqueleto no citoplasma para condensados no núcleo¹¹; e iii) a dissipação dessa energia ativa pelos diferentes compartimentos celulares^10,11. É importante ressaltar que esse protocolo é versátil, pois pode ser adaptado não apenas a outros condensados nucleares, como o nucléolo²³, mas também a outros tipos celulares, como as células cancerosas, onde mudanças no comportamento do citoesqueleto e do condensado nuclear foram documentadas ^17,41.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1	Yokogawa
DMI6000B microscópio	Leica
Femtojet	Eppendorf
Fiji
Roda de filtro	Sutter Instruments Software Metamorph
Fluorodish	World Precision Instruments
	Imagem Universal,		versão 7.7.9.0
Óleo mineral	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Camundongos Thermo Scientific
OF1 e C57BL/6	da Charles River Laboratories
	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3	Kit QImaging
RNAeasy	Qiagen	74104
SC35 anticorpo	Abcam	ab11826	Anticorpo de mancha nuclear; camundongo IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmídeo	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Micropipeta Stripper	XLAB Solutions		especializada para coleta de oócitos
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
	Serviço de
Windows Excel	Windows