Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.
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Artigo de método
Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta
Neste artigo
Resumo
Resumo
Peptídeos de automontagem ultracurtos (SAPs) podem formar espontaneamente nanofibras que se assemelham à matriz extracelular. Essas fibras permitem a formação de hidrogéis biocompatíveis, biodegradáveis e não imunogênicos. Provamos anteriormente que os SAPs, quando biofuncionalizados com motivos derivados de proteínas, podem imitar as características da matriz extracelular que suportam a formação de organoides colorretais. Esses hidrogéis de peptídeos biofuncionais retêm as propriedades mecânicas, a capacidade de ajuste e a capacidade de impressão do peptídeo original original, ao mesmo tempo em que incorporam pistas que permitem que as interações célula-matriz aumentem a adesão celular. Este artigo apresenta os protocolos necessários para avaliar e caracterizar os efeitos de vários hidrogéis peptídicos biofuncionais na adesão celular e na formação do lúmen usando uma linhagem de células cancerígenas de adenocarcinoma capaz de formar organoides de câncer colorretal de forma econômica. Esses protocolos ajudarão a avaliar os efeitos do hidrogel de peptídeo biofuncional na adesão celular e na formação luminal usando imunocoloração e análise de imagem de fluorescência. A linhagem celular utilizada neste estudo foi previamente utilizada para geração de organoides em matrizes derivadas de animais.
Introdução
Nos últimos anos, os peptídeos automontáveis (SAPs) surgiram como biomateriais promissores para aplicações de engenharia de tecidos. Os SAPs possuem propriedades únicas, incluindo formação espontânea de nanofibras, biocompatibilidade, biodegradabilidade e não imunogenicidade, tornando-os candidatos atraentes para o desenvolvimento de andaimes1. Os SAPs foram usados anteriormente em conjunto com vários tipos de células e, notavelmente, os SAPs ultracurtos relatados facilitaram o encapsulamento de células-tronco, mantendo sua pluripotência por períodos prolongados, abrangendo mais de 30 passagens e com incidência mínima de a....
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Protocolo
1. Tampão e preparação da solução
NOTA: Todas as concentrações declaradas são concentrações finais.
- Adicione soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 10% e 1%, respectivamente, para preparar o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM). Conservar no escuro a 4 °C até 1 mês.
- Misture MgCl2 (3 mM), sacarose (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) em tampão fosfato salino (PBS) para preparar o tampão de permeabilização. Conservar esta solução a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
- Combine albumina de soro bovino (BSA, 1%), glicina (0,3 M) e Tween-20 ....
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Resultados
Primeiro, avaliamos as células cultivadas em uma placa de 24 poços por 7 dias usando imagens de campo claro. Identificamos pequenos aglomerados de células se reunindo em organoides durante a semana, como visto na Figura 4. Um método de varredura controlada pode acompanhar a mobilidade das células e dos organoides entre diferentes dias. Em geral, observamos a evolução da morfologia das células durante toda a semana. Os organoides derivados de SW1222 devem ter uma morfologia redonda e uma apar.......
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Discussão
O vasto potencial dos SAPs na pesquisa biomédica é ressaltado por sua maleabilidade e adaptabilidade por meio da biofuncionalização. Com uma gama tão extensa de permutações, surge o desafio de testar e determinar com eficiência as configurações mais promissoras para aplicações específicas, especialmente na pesquisa de organoides. Uma solução rápida e econômica é fundamental. A linhagem celular SW1222, derivada do adenocarcinoma colorretal humano, surge como uma candidata fundamental para essa avaliação intensiva. Aqui, a.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah. Os autores reconhecem o Seed Fund Grant da KAUST e o Fundo de Inovação da KAUST concedido pela Inovação e Desenvolvimento Econômico da KAUST. Os autores gostariam de agradecer aos Laboratórios Centrais de Biociência e Imagem da KAUST por apoiar a caracterização biológica e as análises de microscopia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | 14190144 | |
| placa de 6 poços, tratada com cultura de tecidos | Corning | 07-200-83 | |
| 10x PBS, sem cálcio, sem magnésio | Gibco | 70011044 | |
| 16% de formaldeído (p/v), sem metanol | Thermo Scientific | 28906 | |
| placa de 24 poços, tratada com cultura de tecidos | Corning | 09-761-146 | |
| Placa preta de 96 poços, tratamento com cultura de tecidos | Corning | 07-200-565 | |
| alamarBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1025 | |
| Anticorpo anti-Ezrin, monoclonal de coelho | Abcam | ab40839 | Secundário usado: anti-coelho Dylight 633 |
| Anticorpo anti-pan Caderina, coelho policlonal | Abcam | ab16505 | Secundário usado: anti-coelho Alexa 488 |
| Anticorpo anti-ZO1 da junção apertada, cabra policlonal | Abcam | ab190085 | Secundário usado: anti-cabra Alexa 488 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cellpose 2,0 | NA | NA | Obtido do microscópio confocal da exploração do |
| com Airyscan | ZEISS | LSM 880 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Anticorpo secundário anti-cabra IgG (H + L) de burro, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11055 | |
| Glycine | Cytiva | GE17-1323-01 | |
| Anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (H + L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H + L) de cabra, DyLight 633 | Invitrogen | 35562 | |
| Soro Fetal Bovino Inativado por Calor (HI FBS) | Gibco | 16140071 | |
| ImageJ 1.54f | NIH | NA | |
| IMDM | Gibco | 12440079 | |
| Kit de Viabilidade/Citotoxicidade VIVO/MORTO, para células de mamíferos | Invitrogen | L3224 | |
| Cloreto de magnésio, hexahidratado (MgCl2 6 H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Matrigel para Cultura Organoide, 356255 Corning livre de vermelho de fenol | Referido no manuscrito como Matrigel ou matriz de membrana basal. | ||
| Microscópio, | |||
| , EVOS | Thermo Scientific | EVOS M7000 | |
| OriginPro 2023 (64 bits) 10.0.0.154 | OriginLab Corp | NA | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Peptídeo P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) | NA feito em laboratório | Pode ser feito sob medida por peptídeo fabricantes como Bachem. | |
| Peptídeo P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) | NA | feito em laboratório | Pode ser feito sob medida por fabricantes de peptídeos como a Bachem. |
| Peptídeo P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2) | NA | feito em laboratório | Pode ser feito sob medida por fabricantes de peptídeos, como a Bachem. |
| Rodamina Faloidina | Invitrogen | R415 | |
| Lamínula de Cobertura Redonda, 10 mm de diâmetro | VWR | 631-0170 | |
| Microscópio Eletrônico de Varredura | Thermo Fisher - FEI | TENEO VS | |
| Estéril 30 μ m filtro | Sysmex | 04-004-2326 | |
| sacarose | Sigma-Aldrich | S1888 | |
| SW1222 linha celular | ECACC | 12022910 | |
| Triton x-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% | Gibco | 25200056 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| UltraPure água | Invitrogen | 10977015 |
Referências
- Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
- Loo, Y., et al.
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Reimpressões e permissões
