Polimerização de dois fótons Impressão 3D de dispositivos de cultura de células neuronais em microescala

Summary

A impressão 3D em escala micrométrica permite a prototipagem rápida de dispositivos poliméricos para culturas de células neuronais. Como prova de princípio, as conexões estruturais entre os neurônios foram restringidas pela criação de barreiras e canais que influenciam o crescimento dos neuritos, enquanto as consequências funcionais de tal manipulação foram observadas pela eletrofisiologia extracelular.

Abstract

As culturas neuronais têm sido um modelo experimental de referência há várias décadas. No entanto, o arranjo de células 3D, restrições espaciais no crescimento de neuritos e conectividade sináptica realista estão faltando. Este último limita o estudo da estrutura e da função no contexto da compartimentalização e diminui o significado das culturas na neurociência. Aproximar ex vivo o arranjo anatômico estruturado da conectividade sináptica não é trivial, apesar de ser fundamental para o surgimento de ritmos, plasticidade sináptica e, em última análise, fisiopatologia cerebral. Aqui, a polimerização de dois fótons (2PP) é empregada como uma técnica de impressão 3D, permitindo a fabricação rápida de dispositivos de cultura de células poliméricas usando polidimetil-siloxano (PDMS) em escala micrométrica. Em comparação com as técnicas convencionais de moldagem de réplicas baseadas em microfotolitografia, a impressão em microescala de 2PP permite um retorno rápido e acessível dos protótipos. Este protocolo ilustra o projeto e fabricação de dispositivos microfluídicos baseados em PDMS destinados à cultura de redes neuronais modulares. Como prova de princípio, um dispositivo de duas câmaras é apresentado para restringir fisicamente a conectividade. Especificamente, um crescimento axonal assimétrico durante o desenvolvimento ex vivo é favorecido e permitido ser direcionado de uma câmara para a outra. A fim de investigar as consequências funcionais de interações sinápticas unidirecionais, arranjos comerciais de microeletrodos são escolhidos para monitorar a atividade bioelétrica de módulos neuronais interconectados. Aqui, métodos para 1) fabricar moldes com precisão micrométrica e 2) realizar registros extracelulares multissítio in vitro em culturas neuronais corticais de ratos são ilustrados. Ao diminuir os custos e a futura acessibilidade generalizada da impressão 3D 2PP, este método tornar-se-á cada vez mais relevante em todos os laboratórios de investigação em todo o mundo. Especialmente em neurotecnologia e registro de dados neurais de alto rendimento, a facilidade e rapidez da prototipagem de modelos in vitro simplificados melhorará o controle experimental e a compreensão teórica de sistemas neurais in vivo em larga escala.

Introduction

A investigação da atividade neuronal em organismos comportados apresenta vários desafios. Por exemplo, o acesso físico ao tecido cerebral é limitado pela necessidade de manter sua integridade, de modo que as regiões superficiais do cérebro são mais facilmente consideradas. Isolar alvos específicos dentro do tecido intacto é muitas vezes uma tarefa assustadora e, às vezes, impossível. Embora culturas neuronais homogêneas dissociadas ofereçam acesso conveniente às propriedades moleculares, bioquímicas e biofísicas de componentes (sub)celulares individuais de um circuito neural, uma conectividade realista e organização anatômica do cérebro intacto é perdida. Essas restrições fundamentais inspiraram esforços de pesquisa para alcançar um meio termo, onde a complexidade in vivo é evitada enquanto a estrutura pode ser construída in vitro, o que é sob demanda 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Em particular, culturas neuronais modulares têm sido objeto de extensa pesquisa nas últimas décadas, com o objetivo de abordar questões-chave da fisiologia cerebral, conforme descrito abaixo.

Organização: Estudos in vivo mostram que o cérebro é estruturado anatomicamente em camadas com tipos celulares precisos e arranjos de projeções. Ensaios funcionais revelaram a organização das redes neuronais em conjuntos e módulos de nós, com esquemas precisos de^{conectividade10,11}. O papel da conectividade e dos motivos de microcircuitos não pode, no entanto, ser estudado adequadamente in vivo devido ao grande número de sinapses envolvidas, bem como aos efeitos entrelaçados do desenvolvimento e da plasticidade dependente da atividade.

Transferência de sinal: Em culturas in vivo ou aleatórias in vitro , é um desafio avaliar a transferência de sinal. Examinar a condução axonal e o potencial de ação ao longo de sua extensão requer guiar o crescimento neurítico por funcionalização superficial ou padronização química, proporcionando uma alta relação sinal-ruído em leituras extracelulares da atividade elétrica¹².

Relevância translacional: Decifrar o papel exclusivo de elementos pré versus pós-sinápticos em condições patológicas requer ter acesso a esses elementos individualmente. Culturas modulares com conectividade restrita, segregando efetivamente os elementos pré e pós-sinápticos, são ferramentas indispensáveis para esse fim¹³.

Existem vários métodos para obter alguma forma de estrutura em cultura neuronal. Podem ser amplamente categorizadas como manipulação química e física de^{superfícies9}. Os primeiros métodos ^14,15 baseiam-se na propensão das células neuronais a se ligarem a determinados compostos (bio)químicos. Isso requer a deposição de moléculas adesivas ou atrativas em uma superfície com precisão em microescala e seguindo um padrão detalhado. Embora isso permita uma cobertura parcial da superfície das células, seguindo o padrão desejado, os métodos químicos são inerentemente limitados e têm uma taxa de sucesso relativamente baixa na orientação do crescimento de neuritos¹⁶. O controle total sobre a direcionalidade axonal requer o estabelecimento de um gradiente espacial de produtos químicos ad-hoc para moldar a orientação axonal¹⁷. Estes últimos métodos envolvem a manipulação física da superfície e são mais comumente usados para estruturar as redes neuronais in vitro. As células neuronais são fisicamente restringidas nos locais desejados por confinamentos geométricos, como câmaras microscópicas, paredes, canais, etc., moldando um polímero biocompatível, como o polidimetilsiloxano (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, curado e solidificado em um dispositivo microfluídico. O método de fato para a fabricação microfluídica do PDMS é a fotolitografia suave²¹, onde uma máscara bidimensional é padronizada em microescala e empregada para condicionar seletivamente um material à base de silício após exposição UV. Em poucas palavras, uma resina curável por UV (isto é, fotorresistente) é revestida sobre um wafer de silício através de spin-coating, atingindo uma altura específica determinada por sua viscosidade e velocidade de rotação. Em seguida, a máscara estampada é posicionada sobre o fotorresistente e exposta à luz UV. Áreas transparentes dentro da máscara, correspondentes a regiões de interesse, permitirão que a luz UV induza ligações cruzadas localizadas das moléculas fotorresistentes. As áreas de fotorresistência não expostas são lavadas usando um solvente, resultando na formação de um molde mestre. Isso é repetidamente usado para assar um elastômero da escolha (ou seja, PDMS), que é então gravado com as geometrias desejadas em quantas réplicas desejar. Este método de fabricação é o mais comum para a fabricação de dispositivos microfluídicos²². Talvez as principais limitações da fotolitografia suave sejam o pré-requisito de um notável investimento de capital e o desconhecimento dos laboratórios biológicos com as técnicas e conhecimentos necessários. A preparação da máscara e as etapas da fotolitografia suave necessárias para projetar geometrias complexas de alta proporção de altura múltipla não são triviais²³ e muitas vezes requerem terceirização. Embora métodos alternativos e de baixo orçamento tenham sido propostos, nem sempre satisfazem os requisitos de alta precisão da prototipagem biológica²⁴.

Aqui, um método alternativo de fabricação é apresentado, baseado na polimerização de dois fótons (2PP) e manufatura aditiva. É simples e não requer por si só conhecimentos avançados em microfabricação e microfotolitografia. O campo de pesquisa da micromanufatura de 2PP surgiu no final da década de 90²⁵ e, desde então, tem testemunhado um crescimento exponencial²⁶. Mais sobre os princípios fundamentais dessa técnica podem ser encontrados em outra publicação²⁶. Resumidamente, ao focalizar o impulso de luz de excitação no espaço tridimensional, 2PP aproveita a dependência não linear da absorção de multifótons na intensidade. Isso confere a capacidade de absorção confinada, garantindo excitação precisa e seletiva dentro de regiões muito localizadas. Em essência, um fotorresiste de tom negativo, um material com solubilidade diminuída após exposição à luz, é submetido a um feixe focalizado de pulsos de laser de femtossegundo em um ciclo de trabalho^{baixo 27}. Isso permite impulsos com altas intensidades em baixas potências médias, possibilitando a polimerização sem agredir o material. A interação de monômeros radicais fotoinduzidos dá origem a oligômeros radicais, iniciando a polimerização que se estende por todo o fotorresiste até um volume distinto, ou seja, voxel, cujo tamanho depende da intensidade e duração dos pulsos de laser²⁸.

Neste trabalho, dois componentes são apresentados: A) o projeto e a fabricação rápida de um molde impresso em 3D, reutilizável muitas vezes para produzir dispositivos descartáveis de cultura de células neuronais poliméricas (Figura 1), e B) seu acoplamento mecânico à superfície de substratos de cultura de células neuronais planas, ou mesmo de arranjos de microeletrodos integrados a substratos capazes de registros multissítio de sinais bioelétricos.

O Projeto Assistido por Computador de um modelo mecânico 3D é descrito muito brevemente aqui e acompanhado pelas etapas que levam a um molde impresso em 3D e a fabricação de dispositivos PDMS também é detalhada.

Uma variedade de aplicativos de software de design auxiliado por computador pode ser usada para gerar o modelo de objeto 3D inicial e produzir um arquivo STL para controlar o processo de impressão 2PP. Dentro da Tabela de Materiais, o primeiro e o último aplicativos listados são gratuitos ou fornecidos com uma licença gratuita. A construção de um modelo 3D sempre requer a criação de um esboço 2D, que é então extrudado nas etapas de modelagem subsequentes. Para demonstrar esse conceito, um processo genérico de projeto de software CAD 3D é destacado na seção de protocolo, levando a uma estrutura feita de cubos sobrepostos. Para obter informações mais abrangentes, vários tutoriais on-line e recursos de treinamento gratuitos estão disponíveis, conforme indicado na Tabela de Materiais.

O arquivo STL resultante é então convertido em uma série de comandos a serem executados pela impressora 3D (ou seja, procedimento de fatiamento). Para a impressora 3D 2PP específica em uso, o software DeScribe é usado para importar o arquivo STL e convertê-lo no formato proprietário General Writing Language (GWL). O sucesso do processo de impressão 2PP depende de vários parâmetros, notavelmente, a potência do laser e sua velocidade de digitalização, costura e distâncias de eclosão-fatiamento. A escolha desses parâmetros, juntamente com a seleção de objetiva e fotorresistente, depende das menores características do projeto, bem como da aplicação pretendida. Assim, a otimização de parâmetros torna-se essencial para atender aos requisitos de diferentes cenários de projeto e casos de uso. Para este trabalho, a receita recomendada IP-S 25x ITO Shell (3D MF) foi considerada como uma configuração para os parâmetros de impressão. Em última análise, uma peça impressa mecanicamente estável é impressa com a resolução necessária, minimizando seu tempo de impressão 3D.

O projeto do molde e o arquivo STL relacionado, demonstrado neste trabalho, compreende uma estrutura quadrada para segregar o espaço de uma cultura de células em dois compartimentos: uma área externa (i.e., referida como Source posteriormente) e uma área interna (i.e., referida como Target posteriormente). Esses dois compartimentos são conectados através de conjuntos de microcanais, cada um caracterizado por bordas de ângulo nítido, projetadas especificamente para impedir o crescimento de neuritos do Alvo para a Fonte, mas não vice-versa, e como tal promover uma conectividade sináptica direcional entre os neurônios que crescem nas duas áreas.

Estudos anteriores empregaram diferentes geometrias de microcanais para incentivar o crescimento direcional de neuritos. Exemplos incluem formas triangulares¹⁸, estruturas farpadas de canal¹⁹ e canais de afunilamento²⁰. Aqui, é empregado um projeto com barreiras angulares nítidas através das bordas do microcanal, caracterizado também por entradas assimétricas. Esses microcanais servem para estabelecer a continuidade entre um interior fechado, o compartimento Alvo, e a área externa, o compartimento Fonte. A forma de funil da parte inicial dos microcanais, do lado da Fonte, é projetada para promover a formação de feixes axonais e seu crescimento ao longo do caminho mais curto, ou seja, em linha reta, conectando a Fonte ao Alvo. O espaço triangular realizado por ângulos agudos tem maior volume no lado do Alvo para efetivamente retardar a descoberta do caminho dos neuritos, favorecendo o disparo rápido de feixes provenientes da Fonte e a ocupação do espaço disponível. A escolha de 540 μm para o comprimento dos microcanais filtra efetivamente o crescimento dendrítico geralmente mais curto³⁹. Além disso, sua altura de 5 μm impede que a somata celular penetre através dos microcanais. No geral, essa configuração provou promover conectividade unidirecional entre os módulos externo, Source e interno, Target, e é apresentada aqui como uma prova de princípio entre as muitas opções alternativas.

Enquanto os dispositivos PDMS, fabricados pelo molde de 2PP, podem ser fixados à superfície de substratos comuns de cultura celular, tais como lamínulas de vidro ou placas de Petri, neste trabalho foram utilizados arranjos de microeletrodos integrados a substratos comercialmente disponíveis. Nenhum esforço foi feito para otimizar o projeto 3D para o layout do arranjo de microeletrodos, e o acoplamento mecânico foi realizado sob orientação de estereomicroscopia visando apenas posicionar o dispositivo através do array, deixando alguns microeletrodos descobertos em ambos os lados, a Fonte e o Alvo. Isso permite a avaliação preliminar das consequências funcionais da conectividade restrita em culturas de células neuronais.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem o manuseamento de animais foram realizados em conformidade com a legislação europeia e italiana (Diretiva do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010 [2010/63/UE]; Decreto governamental italiano de 4 de março de 2014, nº 26), foram explicitamente aprovados pelo OpBA institucional (Comitê de Cuidados com os Animais) na Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati e foram oficialmente autorizados pelo Ministério da Saúde italiano (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Estes levaram à disponibilidade de material não-sensível do tecido cerebral explantado de ratos, para ser utilizado na validação experimental do método apresentado neste trabalho.

1. 3D fabricação de moldes por polimerização de dois fótons

1. Gerando os arquivos CAD
   NOTA: As etapas a seguir demonstram um fluxo de trabalho de projeto 3D genérico, empregando software de projeto assistido por computador (ou seja, SolidWorks). O arquivo de projeto STL de amostra descrito neste trabalho (Figura 2) está disponível como Arquivo de Codificação Suplementar 1, bem como através do Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
   1. Inicie o aplicativo de desktop do software de design assistido por computador. Na barra de menus superior, selecione Novo.
   2. Nas opções, escolha Peça: uma representação 3D de um único componente de design. Pressione a combinação de teclas Ctrl + 5 para estabelecer a exibição superior do esboço.
   3. No painel lateral, selecione Esboço e escolha Retângulo de Canto. Selecione uma borda do retângulo clicando sobre ela. Quando um painel de parâmetros for exibido, defina o comprimento como 100 unidades.
   4. Repita o passo 1.1.3 para a aresta perpendicular à anterior: ajuste seu comprimento para 50 unidades. Selecione o retângulo arrastando-o enquanto mantém pressionado o botão esquerdo do mouse.
   5. No menu Adicionar relação , selecione Corrigir para restringir as relações entre linhas.
   6. Saia do esboço e repita as etapas 1.1.3 a 1.1.5, criando um novo retângulo (menor), sobrepondo o esboço anterior.
   7. No painel lateral, selecione Recursos e escolha Boss/Base Extrudados: defina a profundidade dos retângulos grandes e pequenos para 5 e 10 unidades, respectivamente.
   8. No menu Arquivo , salve a peça no formato STL (ou seja, Linguagem de Tesselação Padrão).
2. Processando os arquivos CAD
   1. Transfira o arquivo STL para um computador pessoal, equipado com o software aplicativo DeScribe.
   2. Inicie Descrever e, no menu Arquivo, abra o arquivo STL. Uma representação 3D do modelo aparecerá.
   3. Na seção de orientação no menu do lado direito, gire o modelo para orientá-lo adequadamente no espaço e centralize-o no plano.
   4. Ajuste o dimensionamento geral selecionando a seção Dimensionamento do menu do lado direito.
   5. No menu suspenso na parte superior, selecione a receita IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Isso especifica IP-S como fotorresistente, 25x para o poder de ampliação da objetiva, substrato revestido com óxido de estanho de índio (ITO) como substrato de impressão e impressão de casca e andaime como modo de operação com recursos de tamanho médio (MF).
   6. Navegue pelo assistente, selecionando e definindo a distância de fatiamento para 1 μm e a distância de eclosão para 0,5 μm para o shell e o andaime.
   7. Na etapa de saída do assistente de importação, em divisão, defina o tamanho do bloco como X = 200 μm, Y = 200 μm e Z = 265 μm e o deslocamento do bloco como X = 133 μm, Y = 133 μm e Z = 0, garantindo que as estruturas delicadas dos microcanais não sejam afetadas pelas linhas de costura.
   8. Como modo de varredura, use o padrão: Galvo para o plano X-Y e Piezo para o eixo Z.
   9. Pressione Salvar e, no próximo menu textual, substitua a linha var $baseLaserPower = $shellLaserPower por var $baseLaserPower = 75, para reduzir para 75% a potência do laser na camada mais baixa da impressão.
   10. Transfira os arquivos GWL obtidos pelas etapas acima para a estação de trabalho dedicada à impressão 3D 2PP.
3. Impressão 3D e desenvolvimento de amostras
   1. Inicie o software aplicativo NanoWrite . Após a inicialização da impressora, clique em Exchange Holder na interface do software, para inserir o suporte do substrato e montar a objetiva.
   2. Monte a objetiva de 25x na posição apropriada sobre a peça nasal. Identifique qual lado do substrato de vidro é revestido com ITO, por um multímetro eletrônico ajustado para medir resistências: a leitura deve ser de valores baixos, como 100-300 Ω, mas apenas para o lado revestido com ITO.
   3. Posicione o substrato de vidro no suporte, orientando o lado revestido com ITO para cima. Use fita adesiva para segurá-la firmemente no lugar.
   4. Sob o exaustor de fumaça química, aplique uma gota de fotorresistência IP-S no centro do substrato de vidro.
   5. Insira o suporte na impressora 3D, com a gota de resina voltada para a objetiva (ou seja, para baixo).
   6. Através do menu Arquivo do software, carregue os arquivos GWL. Selecione Approach Sample, para mover a objetiva para perto da gota de resina.
   7. Selecione Find Interface para permitir a detecção da interface de impressão ITO-photoresist, com base na diferença do índice de refração dos dois materiais.
   8. Selecione Iniciar trabalho para iniciar a impressão. Quando a impressão terminar, pressione Exchange Holder para recuperar o suporte.
   9. Recupere o suporte e remova delicadamente o substrato com a peça impressa. Submergir o substrato de vidro em acetato de éter metílico de propilenoglicol (PGMEA) por 20 min sob a capela de fumaça, para desenvolver a peça impressa.
   10. Retire o substrato do PGMEA e submerja-o em isopropanol por 5 min. Deixe a peça impressa secar ao ar, sob o exaustor de fumaça química.
4. Tratamento pós-impressão e montagem do molde
   1. Cure a peça impressa pela exposição à luz UV (ou seja, 365-405 nm) com potência suficiente para 5-20 min (consulte Discussão para obter detalhes de energia).
   2. Sob uma capela de fluxo laminar, remova suavemente a peça impressa do substrato de vidro. Solte ~2 μL de resina no fundo de uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm.
   3. Posicione cuidadosamente a peça impressa sobre a gota e deixe a resina fluir sob a peça. Cura adicional a parte impressa pela exposição à luz UV, por 5 min.
   4. Cubra a placa de Petri com sua tampa e transfira-a para o forno para cura térmica, durante 30 min a 80 °C. Não pré-aqueça o forno para evitar deformação ou fratura da peça impressa. Após a cura, a peça impressa ficará permanentemente presa ao fundo da placa de Petri. A partir de agora, a peça impressa e montada será chamada de molde.

2. Fabricação de dispositivos PDMS a partir dos substratos de molde e cultura celular

1. Fabricação de dispositivos PDMS
   1. Preparar 20 mL da mistura 10:1 (relação peso) da base edo agente de cura do PDMS não polimerizado. Para cada dispositivo, e dependendo de sua altura necessária, 1-2 mL de mistura de PDMS é suficiente. Conservar o excesso de PDMS não polimerizado a -20 °C para utilização posterior.
   2. Sob uma capela de fluxo laminar, mexa bem a mistura por 4 min. Como a mistura retém bolhas de ar uniformemente, ela se tornará opaca.
   3. Transfira a mistura para um tubo de 50 μL e centrifuga-a a 168 x g por 5 min, para eliminar bolhas de ar da mistura e obter uma aparência clara.
   4. Trate o molde com 10 μL de agente hidrofóbico (ou seja, Repel-silano ES) e deixe-o descansar por 7 min, garantindo um desprendimento suave do PDMS polimerizado do molde mais tarde.
   5. Enxágue o molde 1x com etanol 70% e 2x com água deionizada (DI). Deixe o molde secar ao ar sob a capela de fluxo laminar.
   6. Despeje suavemente a mistura de PDMS sobre o molde, até que a altura final pretendida do dispositivo seja atingida. Para evitar a formação de bolhas de ar, despeje a mistura suavemente e a uma distância próxima da superfície do molde.
   7. Cubra o molde e transfira-o por 18 min para um forno pré-aquecido e estabilizado a 80 °C, para cura. Para alturas do dispositivo superiores a 5 mm e até 1 cm, estenda o tempo de cura de 18 para 25 min.
   8. Sob a capela de fluxo laminar, retire suavemente o bloco PDMS curado do molde e submerja-o em isopropanol por pelo menos 10 min, dentro de uma placa de Petri de vidro. O isopropanol elimina o PDMS não reticulado. Mantenha sempre o bloco PDMS coberto.
   9. Renove o isopropanol e, sob um estereomicroscópio, corte cuidadosamente a seção quadrada central do dispositivo (identificada como área alvo, neste trabalho) por uma faca oftálmica. Em seguida, prossiga para cortar ainda mais as bordas para alcançar a forma final do dispositivo.
   10. Recupere o dispositivo do isopropanol e submerja-o em etanol por 30 minutos e, em seguida, enxágue-o 3x com água DI estéril. Mantenha a esterilidade a partir deste ponto.
   11. Sob uma capela de fluxo laminar, transfira o dispositivo para uma nova placa de Petri, deixando sua tampa ligeiramente aberta. Deixe secar completamente ao ar.
2. Montagem do dispositivo e preparação de substratos para cultura celular.
   1. Esterilizar cada arranjo de microeletrodos (MEAs) submergindo em etanol 70% por 30 min e, em seguida, enxaguar 3x com água DI estéril.
   2. Usando pinças finas estéreis, sob uma capela de fluxo laminar e estereomicroscópio, monte o dispositivo PDMS na área interna de um MEA. Alinhe um lado do dispositivo PDMS ao centro da área interna do MEA, com microeletrodos integrados ao substrato, de modo que poucos microeletrodos sejam deixados descobertos das áreas Fonte e Alvo (veja a Figura 2).
      NOTA: Para este trabalho, não é necessário alinhar microeletrodos MEA ao microcanal do dispositivo PDMS. Pode ser necessário um empurrão suave no dispositivo para obter uma vedação apertada entre o dispositivo PDMS e a superfície MEA. Evite a todo custo tocar os microeletrodos pela ponta da pinça.
   3. Insira o dispositivo MEA com PDMS na câmara de limpeza de plasma, para ativar a ativação da superfície através do plasma de ar. Comece o processo com uma bomba de vácuo de 4 minutos de evacuação da câmara. Em seguida, abra levemente a válvula de ar para permitir sangramento aéreo controlado. Feche a válvula de ar e ligue os indutores de plasma, ajustando o nível de potência de RF entre 10 W e 18 W.
   4. Uma vez que uma luz brilhante aparece, deixe o processo correr por 80 s. Em seguida, desligue o indutor de plasma, feche a válvula da bomba de vácuo e abra suavemente a válvula de ar. Abra a câmara para recuperar o MEA.
      NOTA: Se o tratamento com plasma envolver a exposição de MEAs a um ambiente não estéril, coloque cada MEA sob luz UV em uma capela de fluxo laminar por 30 min, para garantir a esterilidade.
   5. Adicionar 1 ml de solução de polietilenoimina (PEI) a 0,1% em peso/vol ao MEA e incubá-lo a 37 °C durante a noite. Aspirar a solução de PEI e enxaguar com água DI estéril 5x. Adicionar 1 mL do meio de cultura celular ao MEA e incubá-lo antes da semeadura celular.

3. Cultura de células neuronais e eletrofisiologia

1. Preparar com antecedência o meio de dissecção, a solução de digestão e as soluções 1-3 (ver Tabela 1).
2. Cultura de células neuronais dissociadas.
   1. Segure suavemente um filhote de rato Wistar neonatal com idade entre 0 e 1 dia pelo focinho e realize a decapitação rápida usando uma tesoura afiada.
   2. Descasque a pele do couro cabeludo, faça uma incisão ao longo da linha média sagital do crânio usando uma tesoura fina e, em seguida, crie um corte coronal através do crânio na junção do cerebelo.
   3. Remova o crânio, retire o cérebro com uma espátula fina e transfira-o para o meio de dissecção frio (4 °C).
   4. Remova o tecido subcortical, hipocampo e meninges. Pique o tecido em pequenos pedaços (isto é, 1-2 mm³) e transfira-os em um tubo de 15 mL. Descarte a solução e enxágue o tecido usando meio de dissecação fresco, seguido de uma lavagem com meio de digestão.
   5. Eliminar o meio de digestão e, em seguida, adicionar 1 ml de Solução 1. Incubar a mistura a 37 °C durante 5 min. Eliminar a solução 1 e lavar o tecido com meio de dissecação fresco. Em seguida, adicione 1 ml da solução 2 e mantenha a mistura durante 10 minutos a 4 °C.
   6. Eliminar a solução 2 e enxaguar o tecido com meio de dissecação fresco. Em seguida, adicione 1 ml da solução 3. Dissociar mecanicamente as células pipetando lentamente para cima e para baixo a solução 20 a 30 vezes. À medida que uma mistura uniformemente turva de células dissociadas aparece, aumente seu volume para 3 mL adicionando meio de dissecção.
   7. Recolher o pellet de células centrifugando a mistura a 100 x g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de cultura pré-aquecido.
   8. Conte células (ou seja, por uma câmara de contagem de células) e ajuste a densidade da solução de semeadura de células de acordo.
   9. Semeando cada MEA com 1 mL de solução de semeadura com densidade celular nominal de 1,8 x 10⁶ (~ 6500 células/mm²). Incubar os MEAs semeados em estufa úmida a 37 °C e 5% CO₂. Troque o meio por meio de cultura fresco (ou seja, feito semanalmente) a cada 2 dias.
3. Eletrofisiologia extracelular
   NOTA: Culturas de células neuronais dissociadas atingem um fenótipo elétrico totalmente maduro após 2-3 semanas in vitro. As seções a seguir descrevem um protocolo de estimulação extracelular usando um software aplicativo comercial MEA (Experimenter) para estimular eletricamente qualquer uma das populações neuronais cultivadas em módulos, ou seja, Fonte ou Alvo, enquanto registra simultaneamente a atividade de ambas as populações, em redes maduras.
   1. Monte suavemente um MEA dentro do headstage do amplificador eletrônico multicanal, dentro de uma incubadora seca (37 °C, 5% CO₂) e deixe-o acomodar por 10 min. Uma tampa PDMS personalizada pode ser fabricada separadamente e usada como uma tampa apertada para cada MEA, para reduzir a evaporação da água e manter a esterilidade.
   2. Inicie o software Experimenter. Defina a taxa de amostragem para 25 kHz e inicie a aquisição de dados pressionando Start DAQ. No painel Exibição de dados, os traços brutos da atividade gravada extracelularmente para cada canal são exibidos.
   3. Monitore a atividade espontânea e identifique visualmente e selecione 3 pares de microeletrodos vizinhos que estão ativos durante explosões de atividade sincronizada espontânea em toda a rede, seja dos microeletrodos do lado da Fonte ou do Alvo.
   4. No painel estimulador do software, configure os parâmetros para cada um dos pares de microeletrodos estimuladores em configuração bipolar: selecione uma forma de onda de pulso bifásica e ajuste as amplitudes de pico para ± 800 mV, e a duração do pulso para 200 μs.
   5. Definir o gravador e gravar por um período de 300 ms antes para 1000 ms após a estimulação.
   6. Repita as etapas 3.3.3 a 3.3.5 para o lado Origem e o lado Destino de forma intercalada para o número necessário de repetições.

Results

A fabricação de um dispositivo de cultura de células poliméricas (neuronais) de 2 compartimentos é relatada aqui, exemplificando o uso da impressão 3D 2PP para prototipagem rápida de dispositivos PDMS. Especificamente, um dispositivo é produzido para redes neuronais modulares com conectividade sináptica unidirecional e sua caracterização funcional é apresentada em termos de eletrofisiologia extracelular multissítio. Resumidamente, um molde em escala micrométrica foi realizado por meio de escrita direta a laser, utilizando uma impressora 3D disponível comercialmente. Em particular, a impressora fornece uma potência de 50 mW através de pulsos laser com comprimento de onda central de 780 nm e uma duração de 80 a 100 fs. Durante o processo de fabricação, o feixe de laser é focalizado através da objetiva (25x, NA=0,8) da impressora no fotorresiste de tom negativo (IP-S) para escanear o volume de impressão usando o scanner galvo para os eixos x e y, e o estágio piezo para o eixo z. O volume de impressão foi adequadamente dividido em blocos de 200 mm x 200 mm x 265 mm para a realização de um molde com tamanho total de 6500 mm x 6500 mm x 545 mm e volume nominal de 12,423 mL. A Figura 2A representa um esboço 2D do molde, destacando suas dimensões e tamanho das características, enquanto a Figura 2B mostra uma foto em close-up do dispositivo acabado montado em um MEA. Os moldes preparados conforme descrito na seção anterior eram duráveis e podiam ser reutilizados mais de 50 vezes para a fabricação de dispositivos PDMS.

O molde impresso foi usado para fundir o dispositivo PDMS, que foi então montado na área interna de matrizes integradas de substrato de vidro de matrizes de microeletrodos (MEA), para ser usado para registros extracelulares multissítio da atividade elétrica neuronal e como prova de princípio. MEAs comerciais integrados a substratos foram usados para monitorar a atividade de culturas modulares em resposta a estímulos elétricos espacialmente localizados administrados extracelularmente por um subconjunto de microelecrodos localizados em cada compartimento de cultura. Cada MEA contém 120 microeletrodos de nitrato de titânio (TiN) com diâmetro de 30 μm e passo intereletrodo de 100 μm. A Figura 2C-D mostra o posicionamento do dispositivo PDMS na parte superior do MEA. As características geométricas dos microcanais individuais do dispositivo, juntamente com a pegada global da câmara mostrada na Figura 2C, levam a uma compartimentalização dos neurônios cultivados. Estes podem ser distinguidos com base no compartimento a que pertencem, na área externa (Fonte) do dispositivo, ou na área interna (Alvo) do dispositivo. A orientação axonal preferida, restrita da Origem ao Alvo, é ditada pelas bordas anguladas afiadas dos microcanais. A Figura 2D mostra a colocação do dispositivo polimérico no MEA e a área de cobertura relativa dos eletrodos de registro localizados dentro dos compartimentos Source ou Target. Observe que um alinhamento preciso do interior dos microcanais do dispositivo a uma ou mais fileiras de microeletrodos MEA não foi necessário para nosso estudo de caso nem perseguido.

Evidência representativa de crescimento assimétrico de neuritos é fornecida na Figura 3, durante o desenvolvimento ex vivo, mostrando neuritos marcados fluorescentemente em imagens vivas, 6 dias (Figura 3A) e 2 dias após o plaqueamento celular (Figura 3B-D). Enquanto os neuritos do lado Alvo do dispositivo encontravam barreiras angulares afiadas como obstáculos que impediam sua progressão pelo espaço, os neuritos originários do lado Fonte cresciam ininterruptamente e cruzavam os canais. Essa assimetria favorece uma conexão axonal unidirecional entre os neurônios nos dois compartimentos, projetando-se da Fonte para o Alvo, como explicitamente pretendido a partir do projeto. Este resultado é ainda suportado por uma avaliação eletrofisiológica (funcional) das respostas elétricas evocadas por estímulos fornecidos alternativamente em cada um dos dois compartimentos.

Após 3-4 semanas in vitro, quando as redes neuronais atingiram a maturidade completa^29,30, a conectividade funcional através dos dois compartimentos pôde ser sondada ao fornecer estímulos elétricos breves e monitorar as respostas neuronais evocadas^{por eles 31}. Impulsos elétricos bifásicos com amplitude de 800 mV foram então aplicados alternativamente apenas à Fonte ou somente às populações-alvo (N repetições = 150, N culturas modulares = 6), entregues por 3 pares justapostos de microeletrodos planares em uma configuração bipolar e de forma intercalada. Portanto, os 3 pares de eletrodos poderiam estar localizados dentro da área Fonte do MEA ou dentro da área Target do MEA. As respostas elétricas evocadas por cada estímulo puderam então ser detectadas por todos os microeletrodos de MEA após um atraso de propagação. Os registros foram realizados com uma taxa de amostragem de 25 kHz/canal, e os sinais elétricos brutos extracelulares resultantes foram digitalizados em uma resolução de conversão analógica para digital de 16 bits. Um algoritmo de detecção de pico de cruzamento de limiar³² foi usado off-line para detectar o tempo de ocorrência de potenciais de ação extracelulares, sem realizar qualquer classificação de espículas. A Figura 4A-B revela claramente uma forte assimetria de respostas evocadas, repetidas 150 vezes, dependendo do local de entrega do estímulo, sugerindo um impacto funcional significativo das restrições geométricas na direcionalidade preferencial da conectividade. De fato, ao estimular o lado da Fonte, a taxa de disparo da população neuronal da Fonte - estimada pelo cálculo do histograma pico-vezes peri-estímulo - aumentou como esperado, gerando uma explosão completa de potenciais de ação da rede 33,31,34 e foi seguida, após um atraso, por um aumento na taxa de disparo da população-alvo. No entanto, à medida que o estímulo foi realizado dentro da população-alvo, apenas a taxa de disparo da população-alvo aumentou, com a população da fonte permanecendo majoritariamente silenciosa. A Figura 4C-D repete o mesmo paradigma estímulo/resposta em uma cultura controle, sem a presença de dispositivo polimérico (ou seja, uma cultura neuronal não estruturada), os estímulos extracelulares também foram liberados em 4 repetições. Para tais condições de controle, não ocorreu assimetria nas respostas evocadas por ambos os estímulos. Enquanto o subconjunto de microeletrodos MEA usados para fornecer os estímulos correspondeu ao usado em redes modulares, a localização da entrega do estímulo levou a uma resposta evocada semelhante de toda a população. Isso confirma que o dispositivo PDMS favoreceu a conectividade sináptica unidirecional, através dos dois compartimentos. Em geral, respostas assimétricas evocadas em culturas modulares (N = 6) e respostas simétricas evocadas em culturas controle (N = 4) indicam fortemente uma conectividade anatômica restrita de um sistema in vitro compartimentado. Os dados eletrofisiológicos e os scripts utilizados para gerar a Figura 4, são disponibilizados através de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

Figura 1: Croqui da fabricação do micromolde 2PP e moldagem da réplica do PDMS. (A) Um modelo 3D é projetado em CAD e exportado em arquivo de formato STL (Standard Tessellation Language), (B) instruindo sua impressão 3D de 2 fótons através de polimerização induzida por laser dentro de uma gota de resina (IP-S). (C) A estrutura resultante é usada como molde para fabricação repetida de réplicas de PDMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de prototipagem rápida interna de um dispositivo PDMS de cultura de células poliméricas (neuronais). (A) Em menos de 24 h, a manufatura aditiva em microescala permite passar de um modelo CAD para um mestre impresso em 3D, para ser usado imediatamente, e repetidamente, como um molde de réplica com elastômeros biocompatíveis, como o PDMS. (B-C) Os dispositivos PDMS resultantes são acoplados a um substrato planar de cultura de células neuronais, aqui representado por um arranjo de microeletrodos. Para o desenho específico da amostra em (A), são definidas duas câmaras: uma referida como Fonte e indicada por S, e a outra referida como Alvo e indicada por T. (D) Os neurônios plaqueados em cada câmara só podem crescer seus neuritos através de uma série de microcanais. Quando alinhados adequadamente sob orientação de microscopia estéreo em (C), dois conjuntos de microeletrodos integrados ao substrato são deixados expostos, de modo que a atividade bioelétrica de neurônios próximos localizados em ambos os compartimentos pode ser estimulada e registrada. Note aqui que alinhar microeletrodos dentro de microcanais individuais não era a prioridade desta prova de princípio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem ao vivo de moléculas fluorescentes de células identifica neuritos alongados por neurônios, poucos dias após o plaqueamento celular. (A-D) Micrografias representativas de fluorescência confocal de culturas neuronais modulares do dispositivo fabricadas a partir da Figura 1 e Figura 2 (N = 4, 128 microcanais individuais) foram adquiridas 2 e 6 dias após o plaqueamento celular. (B-D) A ampliação de 40x e uma escala de cinza invertida das micrografias para maior visibilidade. As terminações dos microcanais dos compartimentos Fonte e Alvo são denotadas por S e T, respectivamente. (A) mostra a imagem de varredura ampla da cultura, onde Source (ou seja, a área quadrada interna) e Target (ou seja, a área externa) estão cheias de células, 6 dias após o plaqueamento. (B) e (C) mostram, no momento anterior de 2 dias após o plaqueamento, o crescimento de neuritos nos lados Fonte e Alvo dos microcanais, respectivamente. Os pequenos triângulos pretos indicam exemplos representativos de supostos feixes de axônios terminais, aparentemente originários apenas da Fonte. Os limites dos microcanais em forma de seta apontam para o alongamento dos neuritos ao longo da borda (B), onde sua passagem é ininterrupta e guiada em direção ao Alvo. Na direção oposta, e ao lado da terminação Alvo de um microcanal (C), neuritos originados do Alvo e avançando para o lado Fonte são presos nos cantos afiados. (D) revela ainda os detalhes do crescimento de neuritos dentro de um microcanal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Caracterização funcional das respostas elétricas neuronais, com e sem o dispositivo PDMS. Os MEAs foram usados como substratos de cultura celular e empregados para medir as respostas de pico em toda a rede evocadas por um pulso de estimulação elétrica bifásica muito breve (isto é, 200 μs, 0,8V), fornecido em uma configuração bipolar. Com o dispositivo PDMS da Figura 2, as respostas neuronais de spiking registradas da Fonte (vermelho) e do Alvo (azul) diferem, dependendo de onde o estímulo é entregue. Atrasos axonais, sinápticos e de integração putativos tornam-se aparentes em (A), mas não em (B), sugerindo a existência de uma conectividade sináptica preferencial (ou seja, da Fonte para o Alvo). (C-D) Em condições de controle (isto é, sem dispositivo PDMS), as respostas evocadas detectadas em dois conjuntos distintos de microeletrodos MEA não dependem do local de entrega do estímulo. O sombreamento em tons pálidos, envolvendo as linhas nos gráficos, denota o erro padrão instantâneo da média (N estímulos = 150). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da solução	Composição
polietilenoimina (PEI) 0,1%	1 mL de solução-estoque de PEI, 9 mL de água deionizada estéril (DI).
Meio de cultura (50 mL)	Meio Essencial Mínimo (MEM), suplementado com 20 μM de Glicose, 50 μg/mL de Gentamicina, 50 μM de L-glutamina e 10% de Soro de Cavalo Inativado pelo Calor.
Meio de dissecção (1000 mL)	Hanks′ Sais Balanceados 9,52 g, Bicarbonato de Sódio 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-Glicose 6 g, Ácido Kynurênico (concentração final 200 μM), D-AP5 (concentração final 25 μM), Gentamicina 250 μl, Albumina de Soro Bovino 300 mg, Sulfato de magnésio 1,44 g. Ajustar o pH para 7,3, proteger da luz e armazenar a 4°C.
Meio de digestão (100 mL)	Cloreto de sódio 800 mg, Cloreto de potássio 37 mg, Hidrogenofosfato dissódico 99 mg, HEPES 600 mg, Bicarbonato de sódio 35 mg, Ácido quinurênico, 200 μL (a partir de estoque de 100 mM), D-AP5 100 μL (a partir de estoque de 25 mM). Ajustar o pH a 7,4, proteger da luz e conservar a 4 °C.
Solução 1	Tripsina 5 mg, Desoxirribonuclease I 1,5 mg, em 2 mL de meio de digestão.
Solução 2	Inibidor de tripsina 5 mg, em 5 mL de meio de dissecção.
Solução 3	Desoxirribonuclease I 1,5 g, em 2,5 mL de meio de dissecção.

Tabela 1: Tabela de soluções. Consulte a tabela de materiais para obter descrições de produtos.

Arquivo de codificação suplementar 1: O arquivo de design STL corresponde à estrutura representada na Figura 2A. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Apesar de ser centenária, a aplicação da tecnologia 2PP na moldagem de réplicas baseadas em PDMS em escala micrométrica é um desenvolvimento recente^43,44. Nesse contexto, uma série de pontos são discutidos a seguir para auxiliar os usuários na reprodução efetiva deste trabalho.

Para o projeto do modelo 3D, certifique-se de que o modelo não tenha furos ou auto-interseções. Privilegie o formato de arquivo binário ao salvar como STL, por seu tamanho de arquivo menor do que o codificado em ASCII. Isso é especialmente benéfico para projetos com geometrias intrincadas e para objetos de mililitros. O uso de arquivos STL binários também implica baixa carga de CPU, mais tarde no processo de preparação da parte mecânica a ser impressa em 3D. As dimensões físicas dos recursos dentro do arquivo STL são representadas em unidades adimensionais. Durante o pós-processamento do arquivo STL, as unidades são interpretadas como micrômetros. Portanto, recomenda-se adotar antecipadamente a unidade de interesse, ou seja, micrômetro, ao preparar o arquivo. A precisão do modelo impresso é determinada pelo número de superfícies que se aproximam dos triângulos tesselados. Para um número insuficiente de superfícies, surgirá rugosidade superficial indesejada. No entanto, almejar uma precisão excessivamente alta por um número muito grande de superfícies tem o preço de uma alta carga computacional, fazendo com que o processamento do arquivo seja lento.

Para impressão 3D, durante a impressão, o objeto físico 3D é formado usando digitalização rápida de galvo no plano x-y e movimento piezo na direção z. Isso foca o feixe de laser de femtossegundo dentro de qualquer voxel 3D dado. No entanto, quando as estruturas de impressão são maiores do que as faixas de cobertura espacial do galvo e do piezo, o objeto deve ser programaticamente dividido em blocos. Embora isso seja um requisito para peças impressas de tamanho milimétrico, as junções entre blocos estão associadas a linhas de costura (imperfeitas). A otimização cuidadosa da contagem de blocos e a colocação de linhas de costura nas direções x, y e z são cruciais para evitar interromper as características geométricas críticas do objeto final com linhas de costura. Bolhas podem se formar na interface de impressão por várias razões (por exemplo, impurezas e inomogeneidades de substratos fotoresistentes) e afetar negativamente a qualidade e a integridade da estrutura impressa. Além disso, uma maior potência do laser pode levar a um aumento na sua ocorrência. Reduzir a potência do laser, na camada mais baixa da peça impressa, minimizará as chances de formação de bolhas. Como alternativa à impressão de toda a peça como uma estrutura sólida, o método shell-and-scaffold pode ser considerado. Envolve imprimir apenas a superfície externa da peça (concha), bem como elementos de prisma triangular dentro dela. Esses elementos são separados por camadas horizontais (andaimes), segurando a resina não polimerizada em pequenos bolsos. Este método reduz significativamente o tempo de impressão, particularmente relevante para estruturas de tamanho milimétrico. No entanto, como a resina não polimerizada permanece, a exposição UV pós-impressão é imprescindível para garantir total estabilidade mecânica, embora essa etapa deva ser realizada suavemente para evitar qualquer deformação da peça impressa. O tempo de pós-cura depende da resina escolhida, da espessura da peça e da potência UV⁴⁰. Para obter os melhores resultados, recomenda-se a realização de um ensaio inicial para estimar o tempo necessário para a cura em profundidade total, usando uma gota de fotorresiste e avaliando seu corte de seção, após a exposição aos raios UV. O período habitual de cura varia entre 5 a 20 min.

Para a moldagem de réplicas de PDMS, a fabricação limpa de um dispositivo PDMS com recursos em escala micrométrica, sem instalações de sala limpa, pode ser desafiadora: micropartículas transportadas pelo ar podem residir na superfície altamente adesiva do PDMS e dificultar a vedação entre o dispositivo e o substrato, ou bloquear a seção de microcanais individuais. Executar as etapas do protocolo sob uma capela de fluxo laminar e proteger consistentemente a superfície do PDMS com isopropanol minimiza substancialmente os riscos de contaminação. A temperatura de cura e sua duração afetam diretamente a reticulação PDMS e as propriedades físicas resultantes. Em particular, a adesividade do PDMS curado é um fator crítico. Por um lado, é necessária uma vedação apertada entre o dispositivo PDMS e a superfície usada para a cultura de células neuronais (por exemplo, uma lamínula de vidro ou um MEA), para restringir efetivamente a passagem dos neuritos. Por outro lado, o dispositivo PDMS deve se fixar à superfície de forma reversível, para que a delicada camada isolante MEAs não seja danificada após a remoção do dispositivo. Embora o encolhimento do PDMS durante a cura ocorra e possa ser corrigido pelo reescalonamento inicial do molde, para temperaturas e intervalos de cura indicados aqui, a contração será inferior a 2%⁴² e não afetará significativamente os dispositivos PDMS de camada única. No geral, siga com precisão os valores recomendados de temperatura e duração de cura, para obter os melhores resultados.

Visão geral das vantagens e limitações do método
Uma técnica baseada na escrita direta a laser de 2 fótons é proposta para a fabricação rápida de dispositivos poliméricos em microescala para o estudo experimental de redes neurais modulares. Ao contrário da fotolitografia suave, a abordagem proposta não requer um alto nível de conhecimento técnico, desde que uma configuração funcional de impressão 3D 2PP seja acessível e operacional. Notavelmente, o método permite passar de um modelo 3D projetado em CAD para um dispositivo PDMS funcional em um único dia, fornecendo assim um caminho direto e eficiente do conceito à realização tangível. Especificamente, optar pelo modo de impressão shell-and-scaffold reduz significativamente o tempo necessário para criar o molde, já que apenas uma fração de seu volume é impressa. A cura UV subsequente do componente impresso garante sua estabilidade mecânica e robustez, como verificado aqui ao longo de 50 ciclos de fundição com PDMS.

Em comparação com os métodos tradicionais, a impressão 3D 2PP possui uma vantagem clara, que é mais pronunciada quando se trata da fabricação de moldes com uma proporção significativa, requisitos de resolução exigentes e geometrias tridimensionais complexas. A produção de moldes mestres usando litografia UV padrão é limitada por uma espessura de resistência de aproximadamente 200 μm. Sequências intrincadas de ciclos de spin-coating e exposição³⁵, dispendiosos processos LIGA (Litografia, Galvanoplastia e Moldagem) ou corrosão profunda de íons reativos (DRIE)³⁶ são necessários para alcançar maiores proporções e altura. Em nítido contraste, como demonstrado no trabalho pioneiro de Kumi et al., em 2010³⁷, a técnica de 2PP oferece um escopo essencialmente ilimitado para a proporção das peças impressas, abrangendo de sub-micrômetros a milímetros. Aqui, o processo de microfabricação de um molde com diferença significativa na altura de suas porções foi exemplificado, caracterizando uma distinção de mais de 100 vezes entre a altura dos microcanais (5 μm e a altura máxima do molde (545 μm; ver Figura 2).

Além disso, a resolução submicrométrica poderia ser facilmente alcançada seguindo as especificações do protocolo descritas. Em comparação, alcançar resoluções aprimoradas de moldes por meio da fotolitografia UV exige investimento de capital. As máscaras com a melhor resolução, utilizando deposição de cromo no quartzo a uma resolução nominal de 600 nm, têm um preço várias ordens de magnitude maior do que as máscaras de transparência aérea impressas a laser, que possuem uma resolução de 250 μm³⁵, no entanto, veja o trabalho de Pirlo et ^al.41. Para ser viável para uso interno, um método escolhido deve ser econômico. Para muitos laboratórios biológicos, o gasto global associado à fotolitografia mole convencional ou à escrita direta a laser apresenta uma barreira. Embora seja viável tornar ambas as tecnologias mais acessíveis comprando e montando os componentes essenciais, essa abordagem exige conhecimentos adicionais e ainda requer um investimento notável. Nesse contexto, um ponto essencial a ser considerado é o espectro mais amplo de aplicações alcançáveis por meio da escrita direta a laser. Ao contrário da fotolitografia suave convencional, principalmente limitada à microfabricação de moldes, a impressão 3D 2PP exibe uma versatilidade notável. Suas aplicações potenciais abrangem desde microfluídica e micro-óptica até fotônica e micromecânica integradas. Isso torna o investimento nessa tecnologia atraente como uma instalação compartilhada para múltiplos e diversos campos científicos. Por exemplo, a metodologia baseada em 2PP desenvolvida neste protocolo é o resultado de uma colaboração interdisciplinar entre os departamentos de neurociências e matemática de nossa instituição. Além disso, o desenvolvimento de fotorresistentes é um campo ativo de pesquisa, e pode potencialmente expandir a gama de aplicações da impressão 3D 2PP. Um exemplo é a recente introdução da resina IP-PDMS. Ao polimerizar em estruturas com propriedades como o PDMS³⁸, essa resina libera o potencial para a microfabricação direta de componentes biocompatíveis que têm superfície contorcida ou contêm espaços ocos. Esses meandros são barreiras para alcançar resultados semelhantes por meio de procedimentos convencionais de moldagem de réplicas.

Como demonstração deste método, evidências foram fornecidas sugerindo o desenvolvimento de conectividade unidirecional entre dois módulos em uma rede neuronal modular. O molde em microescala, fabricado pela técnica de 2PP, tinha resistência suficiente para ser submetido a múltiplas fundições de PDMS, e tem a precisão de microescala necessária. Em conclusão, o escopo de aplicação do protocolo descrito neste trabalho vai além do caso ilustrado. À medida que o acesso à tecnologia de impressão 2PP se torna cada vez mais difundido, o investimento inicial necessário para sua implementação diminuirá, enquanto sua gama de aplicações potenciais se expandirá.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	650447
BB cura polimerizador compacto	PCube Srl		Comprimentos de onda 365-405 nm, Potência 120W
BioMed Amber Resin 1 L	formlabs		Resina usada para montar o molde impresso em 3D na placa de Petri
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9418
Software de aplicação CAD SolidWorks	Dassault Systè mes SolidWorks Corporation, EUA		Fusion 360 (Autodesk Inc., EUA), AutoCAD (Autodesk Inc., EUA), PTC Creo (PTC corp., EUA), SolidWorks (Dassault Systè mes SolidWorks corp., EUA) e Tinkercad (Autodesk Inc., EUA).                                                                 -------------------------------------- Tutoriais: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Treinamentos: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-AP5	Tocris	#0106
Desoxirribonuclease I	Sigma-Aldrich	D5025
DeScribe	Nanoscribe GmbH & Co.
hidrogenofosfato dissódico	Sigma-Aldrich	106585
Gentamicina	Thermo Fisher	15710049
Hanks′ Sais Balanceados	Sigma-Aldrich	H2387
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
Soro de Cavalo	Sigma-Aldrich	H1138
in vitro MEA sistema de gravação MEA2000 mini	Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Alemanha
IP-S Photoresist	Nanoscribe GmbH & Co.
Ácido quinurênico	Sigma-Aldrich	K3375
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030081
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M2643
Software aplicativo de gravação MEA (Experimenter)	Sistemas Multicanal GmBH, Reutlingen, Alemanha
Meio Essencial Mínimo	Sigma-Aldrich	51412C
NanoWrite	Nanoscribe GmbH & Co.
Faca de facada oftálmica KG 15°	HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2)	Nanoscribe GmbH & Co.  KG	SN617
Limpador de Plasma	HARRICK PLASMA
Solução de poli (etilenoimina)	Sigma-Aldrich	P3143
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P3911
Acetato de éter metílico de propilenoglicol (PGMEA)	Sigma-Aldrich	484431
Repel-silano ES	Sigma-Aldrich	GE17133201
Substratos revestidos com ITO-cal sodada para 3D MF DiLL	Nanoscribe GmbH & Co.
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6014
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888
MEAs planares integrados ao substrato (120MEA100/30iR-ITO-gr)	Sistemas multicanal GmBH, Reutlingen, Alemanha		Eletrodos de estanho, isolador de SiN, 4 eletrodos de referência interna, 120 eletrodos de gravação, espaçamento entre eletrodos 100 e micro; m, Diâmetro do eletrodo 30 µ m
Kit SYLGARD 184	Dow Corning
Tripsina	Sigma-Aldrich	T1005
Inibidor de tripsina	Sigma-Aldrich	T9003
Monofásica assíncrona 2 polos	CIMAMOTORI