O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.
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Artigo de método
Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retinopatia é uma das principais causas de cegueira no mundo. A investigação de sua patogênese é essencial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno da retinopatia. Infelizmente, barreiras éticas dificultam a coleta de evidências de seres humanos. Recentemente, numerosos estudos têm mostrado que células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) podem ser diferenciadas em organoides da retina (ROs) usando diferentes protocolos de indução, que têm enorme potencial na retinopatia para modelagem de doenças, triagem de drogas e terapias baseadas em células-tronco. Este estudo descreve um protocolo de indução otimizado para gerar retina neural (NR) que reduz significativamente a probabilidade de vesiculação e fusão, aumentando a taxa de sucesso de produção até o 60º dia. Baseado na capacidade das LSPs de se auto-reorganizarem após a dissociação, combinada com certos fatores complementares, esse novo método pode direcionar especificamente a diferenciação da NR. Além disso, a abordagem é descomplicada, custo-efetiva, exibe repetibilidade e eficiência notáveis, apresenta perspectivas encorajadoras para modelos personalizados de doenças da retina e fornece um reservatório celular abundante para aplicações como terapia celular, triagem de drogas e testes de terapia gênica.
Introdução
O olho serve como fonte primária de informação entre os órgãos sensoriais humanos, sendo a retina o principal tecido sensorial visual dos olhos demamíferos1. A retinopatia destaca-se como uma das principais causas globais de doenças oculares, levando àcegueira2. Aproximadamente 2,85 milhões de pessoas no mundo sofrem de graus variados de comprometimento da visão devido à retinopatia3. Consequentemente, a investigação de sua patogênese é crucial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno. A maioria dos estudos sobre retinopatia humana tem se concentrado principalmente em modelos animais
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Protocolo
Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Geral Chinês PLA. A linhagem WA09 (H9) ESC foi obtida do WiCell Research Institute.
1. Meios de cultura e preparação de reagentes
- Meio de cultura ESC humano e solução de passagem
- Meio de manutenção (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Meio Basal + suplemento 5x; ver Tabela de Materiais) assepticamente. Descongelar 5x suplemento à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 2-8 °C. Mexa bem antes de usar até que o suplemento esteja livre de turvação.....
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Resultados
Uma visão geral gráfica do protocolo modificado é mostrada na Figura 1. H9-ESCs foram usadas para gerar ROs quando as células foram cultivadas a uma densidade de 70%-80%. Suspensões unicelulares de H9-ESCs em 96 poços cônicos com fundo em V se agregaram no dia 1 e formaram EBs redondas bem circunscritas no dia 6. Com o aumento do tempo de cultivo, o volume de EBs aumentou gradativamente. No 30º dia, estruturas neuroepiteliais-símile estavam claramente formadas e espessadas durante a diferenc.......
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Discussão
As ERs humanas podem recapitular espacial e temporalmente o desenvolvimento da retina fetal, e as ERs precoces exibem alto grau de semelhança com a retina fetal em estágios equivalentes de desenvolvimento15. Em termos de morfologia tecidual e expressão molecular, a OR humana espelha de perto o estado de crescimento real do tecido da retina, fornecendo oportunidades tremendas e sem precedentes nos campos da modelagem de doenças, triagem de drogas e medicina regenerativa. Atualmente, vários métodos .......
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Divulgações
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Fatias de lavagem |
| 4% Paraformaldeído | Servicebio | G1101-500ML | Fix organoides retinianos |
| 5 mL Pipeta | Pasteur NEST Biotecnologia | 318516 | Pipeta organoides retinianos |
| 96 poços cônicos com fundo em V | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Lâminas de microscópio | de adesão CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | |
| Medium Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Anticorpo primário |
| antidesbotamento | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Anticorpo primário |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Anticorpo primário |
| Anti-Neuronal Classe III β-Tubulina (TUJ1) | Beyotime | AT809 | Anticorpo primário |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Anticorpo primário |
| Solução de dissociação celular (CDS) | Tecnologias STEMCELL | 7922 | Dissociação celular |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inibidor |
| Concentrado lipídico de colesterol | Gibco | 12531018 | 250 vezes; |
| Solução de recuperação de antígeno citrato | Servicebio | G1202-250ML | 20 &vezes;, pH 6,0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Congelamento |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Contracoloração nuclear |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM / F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Anticorpo Secundário Anti-Coelho |
| Donkey Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Anticorpo Secundário |
| Etileno Diamina Ácido Tetracético (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0,5 M, pH 8,0, dissociação celular |
| Matriz extracelular (ECM) | Placas | de revestimento de | 354277 Corning |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Soro |
| bovino fetal | Gibco | A5669701 | |
| Analisador quantitativo de células de tecido semelhante a fluxo | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Seções de varredura |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Médio |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inibidor KnockOut |
| Substituição de soro | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inibidor |
| Placas de 24 poços de baixa adesão Placas de 6 poços | Corning | 3473 | |
| Placas de 6 poços de baixa adesão | Corning | 3471 | |
| Meio de manutenção (MM) | Tecnologias STEMCELL | 85850 | Suplemento médio |
| de N2 | Gibco | 17502048 | |
| Soro de burro normal | Solarbio | SL050 | Tampão de bloqueio |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Incorporação de tecido |
| PBS pH 7,4 básico (1x) | Gibco | C10010500BT | sem Ca +, Mg + |
| Reconbinante proteína morfogenética óssea humana-4 (rhBMP4) | R & D | 314-BP | Fator de proteína chave |
| Ácido retinóico | Sigma | R2625 | Pó, mantenha fora da luz |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inibidor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Inibidor de tirosina quinase |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurina | Sigma | T0625-10G | |
| Tioglicerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilização |
| WA09 linha de células-tronco embrionárias | WiCell Research Institute | Linha celular | |
| xileno | SINOPHARM | 10023418 | desparafinação |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | inibidor de ROCHA |
Referências
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al.
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Reimpressões e permissões
