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Artigo de método

Hepatectomia estendida de 78% em modelo cirúrgico de camundongo

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DOI:

10.3791/66528

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24 de maio de 2024

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1Division of Vascular and Endovascular Surgery and the Center for Vascular Biology Research, Department of Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2The Transplant Institute and the Division of Nephrology, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

O modelo de camundongo de hepatectomia parcial 2/3 (66%) é bem descrito na literatura, mas hepatectomias mais extensas mimetizando a síndrome do pequeno para o tamanho após o transplante de fígado raramente foram usadas. Descrevemos um procedimento de hepatectomia estendida de 78% em um modelo de camundongo que resulta em aproximadamente 50% de letalidade pós-operatória em camundongos saudáveis.

Resumo

A hepatectomia parcial 2/3 em camundongos é usada em pesquisas para estudar a capacidade regenerativa do fígado e explorar os resultados da ressecção hepática em vários modelos de doenças. Na hepatectomia parcial clássica de 2/3 em camundongos, dois dos cinco lobos do fígado, ou seja, os lobos esquerdo e mediano, representando aproximadamente 66% da massa hepática, são ressecados em bloco com uma sobrevida pós-operatória esperada de 100%. Hepatectomias parciais mais agressivas são tecnicamente mais desafiadoras e, portanto, raramente foram usadas em camundongos. Nosso grupo desenvolveu um modelo de camundongo de uma técnica de hepatectomia estendida na qual três dos cinco lobos hepáticos, incluindo os lobos superiores esquerdo, mediano e direito, são ressecados separadamente para remover aproximadamente 78% da massa hepática total. Essa ressecção estendida, em camundongos saudáveis, deixa um fígado remanescente que nem sempre pode sustentar uma regeneração adequada e oportuna. A falha na regeneração resulta em 50% de letalidade pós-operatória em 1 semana devido à insuficiência hepática fulminante. Este procedimento de hepatectomia estendida de 78% em camundongos representa um modelo cirúrgico único para o estudo da síndrome do pequeno para o tamanho e a avaliação de estratégias terapêuticas para melhorar a regeneração hepática e os resultados no cenário de transplante de fígado ou ressecção hepática estendida para câncer.

Introdução

Modelos de ressecção hepática cirúrgica de camundongos e ratos, descritos pela primeira vez em 1931, são os modelos experimentais mais comuns utilizados para estudar a base molecular da regeneração hepática. Eles também podem ser úteis na pesquisa científica translacional para testar e desenvolver estratégias para melhorar os resultados após ressecção hepática estendida ou transplante de enxertos hepáticos abaixo do ideal 1,2,3,4. As hepatectomias parciais (HP) em camundongos envolvem a remoção de aproximadamente 2/3 (66%) da massa hepática total (TLM), que quando realizadas em animais saudáveis têm resultados excepcionais5. O procedimento é de curta duração, facilmente reprodutível devido à pouca variação na anatomia do fígado de camundongos, e a sobrevida pós-operatória geralmente se aproxima de 100%1.

A hepatectomia parcial 2/3 abrangendo a ressecção do lobo esquerdo (MMII) e do lobo mediano (ML) permite que os lobos residuais se regenerem relativamente desimpedidos por inflamação lobar ou restrição do fluxo de entrada e saída hepático. Em vez disso, o aumento do fluxo venoso portal e, subsequentemente, o estresse de cisalhamento nas células endoteliais sinusoidais do fígado após a HP resultam na regulação positiva sustentada da expressão da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e subsequente liberação de óxido nítrico (NO), que contribuem para o priming dos hepatócitos para proliferação e regeneração hepática3. Os resultados comumente estudados após 2/3 de HP em modelos de doenças, como doença hepática gordurosa não alcoólica ou em antecedentes genéticos específicos, incluem risco de insuficiência hepática aguda, medidas qualitativas e quantitativas da capacidade regenerativa do fígado e outras respostas biológicas ao estresse ou lesão traumática 1,3.

No entanto, um modelo de camundongo que imita a síndrome funcional ou anatômica do tamanho pequeno, como ocorre após ressecção hepática estendida para câncer ou transplante de enxertos hepáticos marginais (esteatose ou tempo isquêmico prolongado) ou parciais (divididos ou de fígado de doador vivo), ainda não foi bem estabelecido. Para atender a essa necessidade, modelos de ressecções hepáticas mais extensas que se estendem além da manutenção de uma massa hepática mínima (e funcional) são necessários para modelar a síndrome do fígado pequeno para o tamanho e a mortalidade aumentada associada a essa síndrome 6,7.

A anatomia do fígado de camundongo exibe variação mínima. O fígado de camundongo é composto por cinco lobos, cada um representando a seguinte porcentagem da massa hepática total: lobo esquerdo (LL; 34,4 ± 1,9%), lobo mediano (ML; 26,2 ± 1,9%), lobo superior direito (também chamado de superior direito) (RUL; 16,6 ± 1,4%), lobo inferior direito (também chamado de inferior direito) (RLL; 14,7 ± 1,4%) e lobo caudado (CL, 8,1 ± 1,0%)1, 5. Cada lobo é suprido por uma tríade portal, incluindo um ramo da artéria hepática, um ramo da veia porta e um ducto biliar5. Historicamente, várias técnicas foram descritas para realizar um 2/3 PH ressecando o LL e o ML. Estes incluem 1) a técnica clássica que consiste em uma única ligadura em bloco na base de cada um dos lobos ressecados; 2) a técnica do clipe hemostático, utilizando clipes de titânio aplicados na base dos lobos ressecados; 3) técnica de preservação do parênquima orientado para o vaso, utilizando suturas perfurantes proximais à pinça; e 4) uma técnica microcirúrgica orientada a vasos, em que os ramos da veia porta e da artéria hepática são ligados antes da ressecção do lobo1. Embora cada técnica tenha pontos fortes e fracos relativos, nenhuma produz maior letalidade 1,8,9.

Neste estudo, apresentamos um novo método para PH estendido de 78% em camundongos. Nesse modelo, três dos cinco lobos do fígado, incluindo LL, ML e RUL, são removidos separadamente usando uma técnica de ligadura (Figura 1). Esse procedimento resulta na ressecção de aproximadamente 78% (77,2 ± 5,2%) da massa hepática total. Nossa escolha de remover o LL e o ML separadamente, e não "em bloco" como na técnica clássica de HP, minimiza as complicações associadas à ressecção em bloco desses dois lobos, como estenose da veia cava supra-hepática e aumento do risco de necrose dos lobos remanescentes quando a ligadura única é aplicada muito perto da veia cava1, 10,11,12,13,14. Isso é crucial antes de passar para a etapa final deste procedimento para remover o RUL. Esta hepatectomia extensa em camundongos C57BL/6 do tipo selvagem de 8 a 12 semanas de idade causa 50% de letalidade dentro de 1 semana após a cirurgia devido à falha na regeneração do fígado, causando insuficiência hepática fulminante15,16. Este modelo de camundongo de letalidade aumentada após hepatectomia estendida de 78% recapitula adequadamente a fisiopatologia da síndrome do pequeno para o tamanho e permite o desenvolvimento e teste de novas estratégias para melhorar os resultados.

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Protocolo

Os métodos descritos neste protocolo de procedimento foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). Todos os experimentos foram concluídos de acordo e em conformidade com as diretrizes da IACUC e das instalações de pesquisa animal do BIDMC.

1. Preparação pré-operatória do camundongo

  1. Raspe o abdômen do camundongo do meio do esterno até a região suprapúbica com uma tesoura.
  2. Induza anestesia geral com isoflurano a 1-4% em oxigênio a 100%. Quando anestesiado, coloque o camundongo em decúbito dorsal no campo cirúrgico com uma almofada de aquecimento embaixo. Antes de fazer uma incisão, aperte firmemente o dedo do pé para garantir que o reflexo pedal esteja ausente (se presente, o animal responderá). Ajuste o nível anestésico conforme necessário para atingir um estado de anestesia geral.
    NOTA: Titular o isoflurano conforme necessário para manter a anestesia geral adequada.
  3. Administre 1,2 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória. Coloque o rato em decúbito dorsal com os membros anteriores e traseiros estendidos e prenda os membros com fita adesiva; Em seguida, prepare um campo estéril para a cirurgia.
    NOTA: Certifique-se de que os membros anteriores estejam relaxados quando presos para que a respiração não seja prejudicada.
  4. Prepare o abdômen com soro fisiológico estéril quente e cotonetes betadine, alternando entre cada cotonete 3 vezes. Cubra o abdômen de maneira estéril.

2. Hepatectomia

  1. Faça uma incisão vertical de laparotomia na linha média através da pele do apêndice xifóide até a região suprapúbica usando um bisturi. Em seguida, faça uma incisão através da linha alba com uma tesoura afiada para entrar na cavidade peritoneal e estenda essa incisão até o comprimento da incisão na pele.
    NOTA: É mais seguro primeiro incisar a linha alba na região subxifóide, onde o fígado está profundamente na parede abdominal, para evitar lesões no intestino subjacente.
  2. Retrair a parede abdominal lateralmente usando afastadores apropriados; Em seguida, clampeie o processo xifóide com um hemostático e retraia o esterno superiormente para expor o fígado.
  3. Retraia o fígado inferiormente para expor o ligamento falciforme e, em seguida, corte o ligamento ao longo do comprimento do fígado usando uma tesoura afiada. Retraia o fígado superiormente em direção ao tórax para expor o ligamento hepatogástrico e os ligamentos do lobo intra-hepático e faça o transecto dessas estruturas usando uma microtesoura afiada.
    NOTA: A retração deve ser realizada muito suavemente com aplicadores úmidos com ponta de algodão, pois o fígado, encapsulado pela cápsula de Glisson, é muito frágil e fácil de machucar e dilacerar.
  4. Retraia o lobo mediano superiormente, mantendo o lobo esquerdo em sua posição anatômica original. Enrole uma sutura de seda 5-0 ao redor da parte superior-medial do LL. Reflita o LL superiormente em direção ao tórax para expor a superfície inferior do lobo, junte as extremidades da sutura na base do lobo e amarre a sutura na base. Certifique-se de que a sutura não obstrua o fluxo sanguíneo na veia cava inferior (VCI) ou na veia porta antes de amarrar a sutura para ligar o MMII.
    NOTA: É melhor amarrar esta sutura enquanto o MMII é refletido superiormente em direção ao tórax para que a tríade portal fique bem exposta durante a ligadura. Isso facilita a ressecção do lóbulo próximo à base sem comprometer as estruturas adjacentes.
  5. Ressece o LL logo distal ao laço da sutura usando uma tesoura afiada e certifique-se de que um pequeno manguito de tecido (~ 2 mm) separe a sutura da borda do lobo ressecado. Confirme a hemostasia.
  6. Reflita o lobo mediano superiormente em direção ao tórax, coloque uma sutura de seda 5-0 ao redor da base do ML e retorne o ML à sua posição anatômica original. Aproxime as extremidades da sutura sobre a base do aspecto superior do ML e certifique-se de amarrá-las na base do lóbulo. Ressece o ML ligado, deixando um pequeno manguito de tecido remanescente ao redor da gravata de sutura. Confirme a hemostasia.
  7. Mobilize o fígado da direita para a esquerda para expor os lobos superior e inferior direito e reflita cuidadosamente esses lobos medial e inferiormente. Enrole uma sutura 5-0 sobre o aspecto superior-medial do MSD para garantir que a sutura circunde a base do MSD e, em seguida, reflita o MSD em direção ao tórax. Enrole a sutura sob o RUL e amarre as extremidades perto de sua base, depois resseca-a, deixando um pequeno manguito de tecido remanescente ao redor do laço da sutura.
    NOTA: Amarrar muito proximal na base do MSD pode comprometer o suprimento de sangue para o MID, o que pode resultar em isquemia do MID e morte do camundongo dentro de 24 horas após a cirurgia. Em contraste, amarrar muito distalmente da base do MSD diminui a quantidade de massa hepática ressecada, aumentando assim as taxas de sobrevida pós-operatória além do esperado.
  8. Retorne o fígado restante à sua posição anatômica de repouso e garanta a hemostasia. Se necessário, aplique pressão com gaze nas áreas de sangramento menor nas margens do fígado ressecadas.
  9. Feche a parede abdominal da linha média (fáscia e camadas musculares) usando uma sutura de poliglactina 5-0 de forma ininterrupta. Feche a incisão da pele com grampos ou suturas de monofilamento 5-0.
  10. Interrompa a anestesia e monitore o camundongo até que ele recupere a consciência e possa deambular normalmente.

3. Cuidados pós-operatórios

  1. Observe o camundongo no pós-operatório para garantir a recuperação adequada (ou seja, o camundongo está acordado, alerta e ambulatorial dentro da gaiola) e o controle da dor. Examine o mouse a cada 2 h até 6 h após o procedimento e depois diariamente.
    NOTA: Espera-se que o mouse se mova mais lentamente dentro da gaiola no pós-operatório. O rato deve recuperar numa gaiola isolada de outros ratinhos e só voltar para a companhia de outros ratinhos quando estiver totalmente recuperado.
  2. Administre injeções salinas normais aquecidas (0,1-1,0 mL, subcutâneas ou intraperitoneais) se o camundongo ficar hipovolêmico devido a fluido insensível ou perda excessiva de sangue devido à cirurgia.

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Resultados

Espera-se que uma hepatectomia estendida de 78% bem-sucedida induza 50% de mortalidade em 1 semana em camundongos adultos saudáveis com idade entre 8e 12 semanas 16. Quando realizado corretamente, espera-se perda mínima de sangue. O sangramento residual que persiste pode ser controlado por pressão manual. A morte perioperatória dentro de 24 horas após a cirurgia é frequentemente causada por erros técnicos. As falhas técnicas incluem lesão inadvertida de grandes vasos sanguíneos, causando hemorragi...

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Discussão

Para realizar com sucesso uma hepatectomia estendida de 78% causando 50% de letalidade em camundongos, é fundamental que cada lobo hepático seja ressecado com precisão. Esse nível de competência e precisão só pode ser alcançado se o procedimento for realizado repetidamente. A curva de treinamento varia entre os operadores, mas normalmente requer de 3 a 6 meses de prática. Uma ressecção hepática que remove menos de 78% do TLM resultaria em taxas de sobrevivência mais altas, enquanto uma ressecção hepática que remove mais ...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse a serem divulgados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas NIH R01 DK063275 e HL086741 para CF. PB e TA são beneficiários de uma bolsa NRSA da bolsa de treinamento NHLBI T32 HL007734.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 x 2 GazeCovidien2146Cirurgia: dissecção
5-O Nylon Monofilament SutureOasis50-118-0631Cirurgia: Fechamento da pele
5-O Silk SutureFine Science Tools18020-50Cirurgia: ligadura do lobo do fígado
5-O VicrylSutureEthicon NC9335902Cirurgia: Fechamento da parede abdominal
Addson ForcepsBraintree ScientificFC028Cirurgia: dissecção
Cotonetes de Álcool (2)BD326895Desinfetante
Buprenorfina Formulação de Liberação Prolongada ZoopharmN/AAnalgesia
Aparador Sem FioBraintree ScientificCLP-9868-14
Fórceps CurvoBraintree ScientificFC0038Cirurgia: dissecção
HemostatBraintree ScientificFC79-1Cirurgia: dissecção
Anestésico Inalante Isoflurano Anestesia GeralPatterson VeterinaryRXISO-250
(2-slot) (2)Braintree ScientificACD-001Cirurgia: para segurar pequenos afastadores
Fixador de Ímã (4-slot) Braintree ScientificACD-002Cirurgia: para segurar pequenos
afastadores MicrotesourasBraintree ScientificSC-MI 151Cirurgia: dissecção
Bandeja de operaçãoBraintree ScientificACD-0014Cirurgia: para estabelecimento de campo cirúrgico 
Cotonete de iodopovidona 10% (2)desinfetanteMDS093901ZZ Medline
(15 lâminas)Aspen Surgical Products371615Surgery: dissecção
Tesoura afiada (curva)Braintree ScientificSC-T-406Cirurgia: dissecção
Tesoura afiada (reta)Braintree ScientificSC-T-405Cirurgia: dissecção
Pequena Aplicadores de AlgodãoFisher Scientific23-400-118Cirurgia: dissecção
Fórceps de Tecido (Reto x2)Braintree ScientificFC1001Cirurgia: dissecção
Almofada de Aquecimento (18" x 26")Bomba deAquecimentoTP 700
AquecimentoStrykerTP 700
(2) Braintree ScientificACD-005Cirurgia: para facilitar a exposição da cavidade peritoneal
Xenotec Isoflurane Small Animal AnesthesiaBraintree ScientificEZ-108SAAnestesia Geral: Contém vaborizador e console de Isoflurano, câmara de indução, regulador/mangueira, máscara facial (M)
de Barbear Fixador de Bisturi Almofada de Stryker Afastador de Cabo de Fio de

Referências

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