Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos. Inclui uma série de distúrbios complexos do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits multicontextuais e persistentes na comunicação social e interação social e a presença de padrões e interesses comportamentais e de atividade restritos e repetitivos¹. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 1 em cada 100 crianças é diagnosticada com TEA em todo o mundo, com uma proporção de homens para mulheres de 4,2². A doença torna-se evidente no segundo ou terceiro ano de vida. Crianças com TEA mostram falta de interesse em reciprocidade socioemocional, comunicação não verbal e habilidades de relacionamento. Eles exibem comportamentos repetitivos, como movimento motor estereotipado, rotina inflexível e ritualizada e foco intenso em interesses restritos. Crianças com TEA apresentam um alto grau de resposta ao toque, olfato, som e paladar, enquanto a resposta à dor e à temperatura é comparativamente baixa¹. A penetrância desse distúrbio também é diferente entre diferentes pacientes que sofrem de TEA e, portanto, a variabilidade aumenta.

O diagnóstico clínico atual de TEA é baseado na avaliação comportamental dos indivíduos, pois não há teste genético comum ou baseado em biomarcadores confirmatório que cubra todas as formas de TEA³. Decifrar as bases genéticas e neurofisiológicas seria útil para direcionar estratégias de tratamento. Na última década, um grande corpo de pesquisa resultou na identificação de centenas de genes que são excluídos ou mutados ou cujos níveis de expressão são alterados em pacientes com TEA. Pesquisas em andamento enfatizam a validação da contribuição desses genes candidatos usando organismos modelo como o camundongo ou a mosca-da-fruta, nos quais esses genes são nocauteados ou derrubados, seguidos por testes para déficits comportamentais semelhantes ao TEA e elucidação das vias genéticas e moleculares subjacentes que causam as anomalias. Um modelo de camundongo recapitulando as variações do número de cópias (CNVs) nos loci cromossômicos humanos 16p11.2 mostra alguns dos defeitos comportamentais do TEA ^4,5,6. A exposição pré-natal a um medicamento teratogênico ácido valpróico (VPA) é outro modelo de camundongo que descreve características semelhantes ao TEA humano ^7,8. Além disso, existe uma variedade de modelos de camundongos que exibem autismo associado à síndrome genética, por exemplo, modelos sindrômicos de gene único causados por mutações em Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelos não sindrômicos de gene único causados por mutações em genes como Cntnap2, Shank, Neurexin ou genes Neuroligin ⁵.

A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é outro organismo modelo proeminente para estudar as bases celulares, moleculares e genéticas de uma infinidade de doenças humanas⁹, incluindo TEA. Drosophila e humanos compartilham processos biológicos altamente conservados nos níveis molecular, celular e sináptico. As moscas-das-frutas têm sido usadas com sucesso em estudos de TEA^{10 , 11 , 12} para caracterizar genes ligados a TEAs e decifrar seu papel exato na sinaptogênese, função sináptica e plasticidade, montagem do circuito neural e maturação; descobriu-se que os homólogos de moscas de genes associados ao TEA têm papéis na regulação do comportamento social e / ou repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. A mosca-da-fruta também tem funcionado como modelo para a triagem de genes de TEA e suas variantes 15,22,23. O maior desafio na pesquisa de TEA em moscas é que, ao contrário de outros modelos de doenças, não existe um único modelo de mosca com TEA. Para entender o impacto das mutações ou da derrubada de um gene específico do TEA, um pesquisador precisa validar se os fenótipos comportamentais imitam suficientemente os sintomas de pacientes com TEA e, em seguida, prosseguir para a compreensão dos fundamentos moleculares ou fisiológicos dos fenótipos.

Portanto, a detecção de fenótipos semelhantes ao TEA é vital para a pesquisa de TEA no modelo de mosca. Um punhado de técnicas comportamentais surgiu ao longo dos anos que nos permite detectar anormalidades como déficits no comportamento / interação social, comunicação, comportamentos repetitivos e capacidade de resposta a estímulos. Além disso, várias modificações e atualizações dessas técnicas comportamentais foram feitas em diferentes laboratórios para atender a requisitos específicos, como upscaling, automação de ensaios, leituras, quantificação e métodos de comparação. Neste artigo em vídeo, são demonstradas as versões mais básicas de cinco paradigmas comportamentais, que, em combinação, podem ser usados para detectar resultados comportamentais semelhantes ao TEA da maneira mais fácil.

A agressão é um comportamento inato evolutivamente conservado que afeta a sobrevivência e a reprodução²⁴. O comportamento agressivo em relação aos coespecíficos é influenciado pela 'motivação para a ^{socialização'25,26} e pela '^{comunicação'27}, ambos comprometidos em indivíduos afetados por TEA. O comportamento agressivo é bem descrito em Drosophila e sua quantificabilidade através do robusto ensaio de agressão 28,29,30 e uma base genética e neurobiológica bem compreendida ³¹ o torna um paradigma comportamental adequado³² para avaliar o fenótipo ASD em um modelo de mosca. A agressão é afetada pelo isolamento social longe de um ambiente social, o que leva a uma agressão aumentada; O mesmo foi observado quando as moscas machos são alojadas em isolamento por alguns dias^33,34. Outro ensaio comportamental que quantifica a sociabilidade em moscas é o Social Space Assay³⁵, que mede as distâncias entre os vizinhos mais próximos e as distâncias entre moscas em um pequeno grupo de moscas, tornando-o perfeitamente adequado para testar os papéis dos ortólogos do gene ASD na mosca 12,21,36,37, bem como modelos de moscas ASD induzidos pelo ambiente^{38, 39}.

O ensaio de namoro de Drosophila é outro paradigma comportamental frequentemente usado para testar a alteração nas habilidades sociais e de comunicação em circuito ou manipulação genética, incluindo genes relacionados ao autismo 18,19,21,40. Padrões repetitivos de comportamento são prevalentes em pacientes com TEA, que são recapitulados em moscas pelo comportamento de higiene - uma série de ações distintas e estereotipadas realizadas para limpeza e outros propósitos. Ele tem sido usado com sucesso para testar o impacto de mutações no gene ASD em moscas^21,41, bem como a exposição a produtos químicos ^38,39. Vários avanços e automação no ensaio foram descritos antes 16,41,42,43; Aqui, estamos demonstrando o padrão de ensaio mais básico, que é fácil de adotar e quantificar.

Sabe-se que o TEA afeta a capacidade de habituação, aprendizado e memória em alguns pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA ^51,52 e também causa déficits em diferentes comportamentos olfativos⁵⁰. A habituação de salto light-off de Drosophila foi usada anteriormente para rastrear genes ASD²³. A habituação pode ser testada por um método simples de ensaio de habituação olfativa 53,54,55. Descrevemos o método para induzir a habituação olfativa e analisamos o resultado usando um ensaio clássico de escolha de odor binário baseado em labirinto^{em Y 56} que pode ser usado para detectar defeitos na habituação no gene ASD mutante ou na condição de knockdown do gene. Para avaliar se o impacto de uma mutação (ou knock-down de genes) ou de um tratamento farmacológico no comportamento de uma mosca equivale a um fenótipo semelhante ao TEA, pode-se usar uma combinação desses 5 ensaios descritos aqui.

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

1. Ensaio de agressão

1. Preparando a arena de ensaio de agressão
   1. Pegue uma placa padrão de 24 poços (Figura 1A) e use cada poço da placa como uma única 'arena' (Figura 1B) para a agressão da mosca. Encha metade de cada poço com comida normal para moscas e deixe secar durante a noite.
      NOTA: Opcionalmente, um ponto focal para agressão pode ser incluído na arena, como um ponto de pasta de fermento ou uma mulher decapitada para garantir a agressão masculina.
   2. Pegue qualquer folha de plástico / acrílico transparente, o suficiente para cobrir a superfície de cerca de três a quatro poços. Perfure a folha para fazer uma pequena abertura de ~ 2,5 mm de diâmetro para inserir moscas individuais nos poços através dela.
2. Preparando o aspirador de moscas
   1. Pegue um tubo de borracha/silicone de 30-50 cm de comprimento (Figura 1C1).
   2. Pegue uma ponta de pipeta de 200 μL (ou 1.000 μL) e corte ~ 1 cm da ponta estreita. Insira a extremidade cortada em uma extremidade do tubo de borracha; Esta ponta será a 'extremidade da boca', usada para aspiração baseada na boca.
   3. Pegue outra ponta de pipeta e corte a extremidade estreita desta ponta para fazer uma abertura suficiente para uma mosca entrar por ela. Insira a base desta ponta de pipeta na extremidade traseira do tubo; esta será a 'extremidade da mosca' do aspirador, de onde a mosca será aspirada (Figura 1C2).
   4. Insira um pedaço de pano de malha ou uma fina camada de algodão na 'extremidade da mosca' do tubo - na junção entre o tubo e a ponta. Certifique-se de que uma mosca aspirada na ponta da pipeta permaneça presa na ponta, na frente da malha.
   5. Sele as junções entre o tubo e as pontas da pipeta usando parafilme.
3. Preparação de tubos de invólucro único e frascos de invólucro de grupo
   1. Preparação de tubos de carcaça única
      1. Adicione quase 500 μL de alimento para moscas preparado na hora a um tubo de microcentrífuga de 2 mL (Figura 1D). Use uma mini centrífuga para puxar os alimentos para a parte inferior do tubo.
      2. Defina os alimentos para solidificar em temperatura ambiente, mantendo a tampa aberta durante a noite. Cubra os tubos com um pano fino para evitar que moscas perdidas entrem nos tubos.
      3. Perfure as tampas dos tubos de microcentrífugas com agulhas para circulação de ar e feche as tampas depois que os alimentos estiverem solidificados.
   2. Preparação de frascos para injetáveis de alojamento de grupo
      1. Pegue frascos regulares para moscas e encha um mínimo dos frascos com alimentos preparados na hora (Figura 1D).
4. Preparando as moscas antes do experimento
   1. Manter linhagens de moscas dos genótipos desejados em garrafas normais de vidro/plástico contendo alimentos padrão para moscas numa incubadora a 25 °C num ciclo claro/escuro de 12 h.
   2. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as sob anestesia com dióxido de carbono usando um estereomicroscópio.
   3. Insira metade das moscas machos individualmente em 'tubos de caixa única'. Mantenha a outra metade das moscas machos em um grupo de 10 com as moscas fêmeas em 'frascos de alojamento em grupo' regulares, criando uma condição social. Conservar todos os tubos e frascos para injetáveis a 25 °C durante 5 dias.
      NOTA: Mantenha uma temperatura de 24-25 °C e ~50% de umidade na sala de comportamento. As linhagens de moscas utilizadas foram: w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. As moscas Fmr1 , que foram mantidas em isolamento por 5 dias, apresentam ataques de agressão significativamente diminuídos em relação a outro macho (Figura 1E).
5. Realizando o experimento de comportamento de agressão
   1. Realize o experimento de agressão durante a janela de tempo ZT0-ZT3, pois as moscas mostram pico de atividade durante esta hora do dia.
      NOTA: ZT=Tempo Zeitgeber em um ciclo padrão de 12 h claro/escuro; ZT0= acende, ou seja, o início da fase de luz, ZT3= 3 h após o início da fase de luz, e assim por diante. ZT12= apaga-se.
   2. Transfira duas moscas machos das câmaras de alojamento único ou em grupo pelo método de aspiração bucal para a arena de agressão através do orifício na tampa; Afaste o buraco imediatamente para garantir que as moscas não escapem.
   3. Deixe as moscas se aclimatarem dentro da arena por 1-2 min. Inicie um cronômetro por 20 min. Grave as moscas durante os 20 minutos inteiros, colocando uma câmera ou um telefone celular exatamente verticalmente acima da arena usando um suporte. Certifique-se de que os tipos de ataques agressivos estejam visíveis no vídeo.
      NOTA: Garanta uma iluminação clara da arena e evite que qualquer brilho/reflexo da tampa caia diretamente na lente da câmera.
   4. Repita o experimento para 15-20 pares de moscas para cada genótipo e cada tipo de condição de alojamento.
      NOTA: O viés inconsciente pode ser negado pelo duplo cegamento das moscas de controle e teste, bem como dos arquivos de vídeo pertencentes a vários genótipos.
6. Analisando os dados do ensaio de agressão
   1. Transfira os arquivos de vídeo para um computador com uma tela suficientemente grande para que as lutas agressivas sejam visíveis.
   2. Reproduza o vídeo e conte o número total de lutas agressivas em um intervalo de tempo de 20 min^58,59.
   3. Compile e organize os dados de cada genótipo e de cada padrão de alojamento em uma planilha e realize a análise de dados usando qualquer software estatístico. Execute um teste t bicaudal e plote os dados como caixa e bigodes.

2. Ensaio de espaço social

NOTA: O protocolo de ensaio, a arena e a análise descritos aqui foram descritos anteriormente^60,61.

1. Preparando a arena de ensaio do espaço social (SSA)
   1. Coloque os espaçadores triangulares de acrílico (altura = 8,9 cm, base = 6,7 cm e espessura = 0,3 cm) planos no topo de um painel de vidro retangular (13,5 cm x 10,4 cm, espessura de 0,3 cm) de forma que os ângulos retos dos espaçadores de acrílico fiquem alinhados com os cantos do painel de vidro (Figura 2A).
   2. Coloque dois espaçadores retangulares de acrílico (6,7 cm x 1,5 cm, espessura = 0,3 cm) planos no painel de vidro, alinhados com as bases dos dois espaçadores triangulares. Após este arranjo, confirme se os quatro espaçadores de acrílico circundam uma arena triangular (~ 2,16 cm²⁶¹) no painel de vidro retangular que não é coberto por espaçadores (Figura 2A, B). Coloque um adesivo de uma régua (Figura 2C) em um dos espaçadores triangulares e certifique-se de que esteja visível de cima.
   3. Agora coloque um segundo painel de vidro retangular (13,5 cm x 10,4 cm, espessura de 0,3 cm) em cima dos espaçadores de acrílico de forma que se alinhe com o painel de vidro na parte inferior; Os espaçadores de acrílico acabariam imprensados entre o espaço de vidro, deixando um espaço triangular no meio entre dois painéis de vidro. Use quatro pequenos clipes de fichário para segurar os painéis e espaçadores.
2. Preparação das moscas para SSA
   1. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as por sexo sob anestesia fria usando um estereomicroscópio.
      NOTA: Resfrie o aparelho de anestesia fria (uma placa de Petri pode ser usada) em uma incubadora a -20 ° C. Coloque as moscas em frascos vazios, mergulhe esses frascos no gelo (em um balde de gelo) até que fiquem imóveis, coloque-os na placa de Petri fria e comece a separar.
   2. Conservar as moscas machos e fêmeas separadamente durante 24 h em frascos para injetáveis de alimentos numa incubadora a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h.
      NOTA: Para os experimentos demonstrados aqui, as linhagens de moscas utilizadas foram w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Executando o experimento SSA
   1. Manter as mesmas condições experimentais do ensaio de agressão (temperatura: 24-25°C, umidade ~ 50%) e realizar o experimento durante a janela de tempo ZT0-ZT3.
   2. Remova o clipe de fichário inferior direito e desloque levemente o espaçador retangular para fora para que uma lacuna (~ 0,5 cm) seja criada entre os dois espaçadores retangulares.
   3. Transfira as moscas (coletadas no dia anterior) do frasco para alimentos para um frasco vazio. Transfira-os para a arena do espaço social (a área triangular) por aspiração suave através do espaço criado entre os espaçadores retangulares. Feche imediatamente o espaço deslizando o espaçador retangular e o clipe de fichário de volta em suas posições e certifique-se de que não haja espaço para as moscas escaparem.
   4. Segurando a câmara na posição vertical, bata suavemente a câmara 3x em uma almofada macia para garantir que todas as moscas estejam na base da câmara no início do experimento.
   5. Clamp a câmara SSA na posição vertical e inicie o temporizador. Tire uma foto nítida da arena após 20 minutos, quando as moscas se acomodarem em suas posições na arena e mostrarem o mínimo de movimento. Evite brilho e iluminação irregular.
   6. Repita o experimento 3x para a mesma população de moscas, batendo nas moscas e repetindo as etapas das etapas 2.3.5 a 2.3.7 (réplicas internas). Repita 3x com uma população diferente de moscas do mesmo genótipo/condição (repetições independentes).
      NOTA: Congele a câmara de ensaio para descartar as moscas da câmara. Limpe as superfícies de vidro e plástico com etanol para remover todos os odores após uma rodada de experimentos com um grupo de moscas.
4. Analisando os dados do ensaio do espaço social
   1. Analise as imagens no software ImageJ⁶² e liste as distâncias entre os voos mais próximos conforme descrito anteriormente⁶¹.
   2. Realize análises estatísticas e gráficos gráficos usando software estatístico.
      NOTA: As cepas de moscas usadas para o ensaio SSA descrito aqui foram w¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas Fmr1 (Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M) ⁵⁷ . As moscas Fmr1 mostram uma distância significativamente maior dos vizinhos mais próximos (Figura 2D).

3. Ensaio de namoro

1. A câmara de namoro
   1. Monte todas as quatro peças da câmara de corte (Figura 3A) juntas na ordem mostrada na Figura 3B. Cada perfuração do disco central, imprensada entre a tampa e as peças de base, funcionará como a 'câmara de cortejo' (Figura 3C).
2. Obtenção de fêmeas pré-acasaladas
   1. Inicie e mantenha várias garrafas de cultura de moscas CS (Canton S, tipo selvagem) com ~ 60-100 moscas machos e fêmeas em cada garrafa de alimento.
   2. Quando os adultos emergirem, descarte todas as moscas adultas e transfira as moscas que saem dessas garrafas a cada 2-3 h para novos frascos de alimentos suplementados com uma pequena quantidade de pasta de fermento.
      NOTA: Evite a superlotação dos frascos. Tenha cuidado para não transferir moscas velhas, larvas ou pupas para o frasco de acasalamento.
   3. Incube esses "frascos de acasalamento" por 4 dias para garantir que todas as fêmeas tenham acasalado.
3. Preparação de tubos de caixa única para machos
   1. Adicione quase 500 μL de alimento para moscas a cada tubo de microcentrífuga de 2 mL. Use uma minicentrífuga para puxar os alimentos para a parte inferior do tubo.
   2. Deixe a solidificação dos alimentos durante a noite, corte a tampa do tubo de microcentrífugas, cubra-o com parafilme e perfure o parafilme com uma agulha para circulação de ar.
4. Coleta e isolamento de machos virgens
   1. Configure cruzamentos com 10-15 machos e 20-30 fêmeas virgens dos genótipos desejados em frascos de comida separados.
   2. Colete machos virgens dos genótipos desejados da progênie e mantenha-os individualmente em 'tubos de caixa única' usando o aspirador. Continue coletando machos recém-fechados a cada 5-6 h (até 40-50 machos para cada genótipo) e isole-os em tubos individuais de caixa única.
   3. Feche novamente a tampa do tubo com o parafilme.
5. Realizando o experimento de ensaio de namoro
   1. Após 5 dias de isolamento dos machos de teste, realize o ensaio de namoro durante a janela de tempo ZT0-ZT3.
   2. Configure os dispositivos de gravação de vídeo com bastante antecedência, concentrando-se no espaço de trabalho do ensaio.
   3. Com a ajuda de um aspirador, colete uma fêmea pré-acasalada (6-10 dias de idade) dos frascos de acasalamento e insira em uma câmara de cortejo.
   4. Usando o aspirador, transfira suavemente uma mosca macho (controle/teste) do tubo de carcaça única para a câmara de corte contendo a única fêmea pré-acasalada, através do orifício de transferência. Gire a tampa rapidamente para fechar a câmara.
   5. Gravação de vídeo do comportamento das moscas por 15 min.
6. Análise de dados e estatísticas de vídeo
   1. Transfira os arquivos de vídeo para um computador; Observe a duração do tempo gasto pelo macho no namoro durante 15 minutos, passando manualmente pelo vídeo.
   2. Calcule o índice de namoro (IC) para cada mosca macho, que é a fração (ou porcentagem) do tempo gasto pelo macho cortejando a fêmea durante 15 min.
   3. Conte o número total de tentativas de cópula em 15 min.
   4. Observe a duração do intervalo de tempo mostrado pelo macho antes de sua primeira tentativa de cortejar como a latência do namoro (CL).
      NOTA: Recomenda-se analisar 40-60 machos por condição/genótipo para obter poder estatístico e determinar a consistência dos resultados do IC.

4. Ensaio de comportamento de aliciamento

1. Arena de ensaio de comportamento de aliciamento
   1. Use uma pequena câmara circular com um volume de ~0,4 cm³ como uma arena para registrar o comportamento de limpeza.
      NOTA: A mesma arena de namoro descrita na seção 3 pode ser usada para ensaio de comportamento de higiene.
   2. Como o comportamento de limpeza envolve a gravação do movimento de órgãos mais finos, como pernas, use gravação de vídeo de alta resolução ou alto contraste. Para seguir este protocolo, use um painel de LED coberto de vidro difuso como uma superfície uniformemente iluminada de dimensões 20 cm x 20 cm. Coloque a câmara de namoro em cima do painel para garantir que a luz passe de baixo para cima através da câmara.
2. Preparando as moscas antes do experimento
   1. Manter moscas de genótipo experimentais em garrafas de alimentos a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h.
   2. Colete moscas recém-fechadas (0 a 24 h) do genótipo desejado e separe-as sob anestesia fria usando um estereomicroscópio, conforme descrito no ensaio do espaço social.
   3. Isole as moscas machos em tubos de caixa única (como usados no ensaio de agressão) por 24 h.
      NOTA: Para o experimento aqui demonstrado, as linhagens de moscas utilizadas foram: W¹¹¹⁸ e moscas mutantes trans-heterozigóticas FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Realizando o ensaio de comportamento de limpeza
   1. Manter uma temperatura de 24-25 °C e umidade ~ 50%; realizar o experimento durante a janela de tempo ZT0-ZT3¹⁶.
   2. Transfira uma mosca macho de alojamento único de um tubo de alojamento único para a arena de limpeza usando um aspirador. Deslize imediatamente o orifício na tampa para garantir que as moscas não escapem.
   3. Coloque a arena de preparação em um painel de LED difuso e deixe a mosca se aclimatar dentro da arena por 1 min. Gravação de vídeo da mosca por 10 minutos, colocando a câmera exatamente verticalmente acima da arena montada em um suporte. Certifique-se de que os tipos de sessões de preparação sejam visíveis e quantificáveis no vídeo.
      NOTA: O comportamento de limpeza inclui esfregar a cabeça, olhos, antenas, probóscide do tórax, abdômen, genitália e asas com pernas (primeiro par: T1, segundo par: T2 ou terceiro par de pernas: T3). Os parâmetros comportamentais de aliciamento que foram levados em consideração neste estudo são descritos em Andrew et al. ⁴¹ e demonstrados na Figura 4.
   4. Repetir a experiência para cada genótipo.
   5. Analisando os dados comportamentais de higiene
      1. Analise os vídeos e calcule os quatro parâmetros a seguir: Índice de aliciamento (porcentagem do tempo gasto no aliciamento); latência de aliciamento (tempo até a primeira sessão de aliciamento); número de aliciamento; e duração média da sessão de preparação (duração total da luta/número de luta).
      2. Marque uma única sessão de preparação como concluída quando uma mosca parar de mostrar qualquer um dos parâmetros e permanecer imóvel por 2 s ou parar a luta e caminhar pelo menos 4 passos.

5. Ensaio para habituação olfativa

NOTA: Conforme mostrado na Figura 5, a montagem final precisa ser feita no dia do ensaio do labirinto em Y^54,56.

1. Preparando moscas para habituação
   1. Criar moscas dos genótipos desejados para todos os experimentos em uma incubadora com temperatura ambiente de 25 ^oC e 70% de umidade sob luz padrão de 12 h: ciclo escuro de 12h h (LD).
   2. Colete moscas de 0 a 12 h de idade e recém-fechadas e transfira ~ 30-40 moscas em uma garrafa média fresca com uma rolha de algodão apertada.
   3. Atribua códigos a cada frasco para manter o experimentador cego sobre os genótipos em experimentação.
2. Indução de habituação olfativa
   1. Coloque 1 mL do odorante preferido diluído com parafina líquida (light) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para o controle, basta usar 1 mL de parafina líquida light em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vortex o conteúdo do tubo por 10 min para garantir uma mistura uniforme e, em seguida, cubra-o com filme plástico uniformemente perfurado.
      NOTA: No vídeo, será utilizado butirato de etila a 20%.
   2. Use arame para suspender os tubos contendo o odorante diluído ou apenas o líquido diluente em frascos de mídia separados contendo moscas.
   3. Cubra bem as garrafas com algodão e embrulhe com papel kraft para evitar a difusão do vapor odorífero. Rotule os frascos de controle e contendo odor como ingênuos e expostos a odores (habituados), respectivamente. Mantenha esses frascos de indução por 3 dias em uma incubadora com as condições acima mencionadas.
3. Preparação de moscas e o aparelho do labirinto em Y
   1. Transfira as moscas dos frascos de indução para frascos contendo apenas papel de filtro embebido em água.
   2. Deixe-os morrer de fome por aproximadamente 16-18 h em temperatura ambiente antes do experimento para aumentar a motivação.
   3. Certifique-se de que os componentes do aparelho Y-maze estejam limpos e sem odores; Monte as quatro partes na vertical. Conecte as câmaras de escalada ao labirinto em Y, que é então conectado à parte superior do adaptador. Prenda firmemente a parte inferior do labirinto em Y ao frasco de entrada que serve como haste central na parte inferior, conforme mostrado na Figura 5.
   4. Conecte a extremidade cônica de cada câmara trepadeira com os frascos de reagente contendo odor (diluição ^10-3 com água destilada) usando tubos de silicone sem odor.
   5. Bombeie o odor a uma taxa de fluxo igual (~ 120 mL / min) das garrafas de gás para os dois braços do Y com a ajuda de uma bomba de vácuo e deixe-o saturar por 15 min para consistência.
4. Realizando o ensaio clássico do labirinto em Y
   1. Introduza suavemente as moscas famintas de cada frasco no frasco de entrada da configuração do labirinto em Y.
   2. Permita que eles se aclimatem por um breve período; conecte o frasco de entrada com o adaptador Y-maze para iniciar o teste; e deixe as moscas subirem pelos braços do labirinto em Y e ficarem presas nas duas câmaras de coleta. Defina a duração de cada teste para 1 min.
   3. Após a conclusão, bata as moscas de volta no fundo do frasco de entrada e mude a posição dos braços do labirinto em Y para evitar viés lateral. Faça quatro leituras para o mesmo conjunto de moscas.
   4. Registre o número de moscas escalando cada um dos dois braços do labirinto em Y dentro do período de tempo.
   5. Repita o ensaio por pelo menos 8 lotes para obter um conjunto de dados representativo.
5. Análise e interpretação dos dados coletados
   1. Quantifique os resultados calculando o Índice de Desempenho (PI), que pode ser representado como a diferença entre o número de moscas que escolhem o braço de ar (A) e o número de moscas que escolhem o braço de odor (O) como uma fração do número total de moscas participantes.
   2. Use testes estatísticos (teste t de Student não pareado) para verificar se o IP de moscas ingênuas versus expostas ao odor é significativo.

Ensaio de agressão
Como modelo de ASD de mosca, moscas mutantes Fmr1 foram usadas63,64. w1118 machos foram usados como controle e Fmr1 trans-heterozigoto Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 moscas machos como moscas experimentais; Os machos adultos foram alojados em tubos de isolamento por 5 dias. Machos homotípicos (mesmo genótipo, mesmas condições de alojamento) foram introduzidos na arena de agressão e seu comportamento foi registrado por 20 min. O número total de lutas agressivas em 20 min foi contado para cada genótipo. O número de ataques agressivos durante 20 minutos foi significativamente reduzido no caso de machos mutantes do que nos machos de controle (Figura 1E). Essa agressividade reduzida em moscas Fmr1 pode ser devido ao interesse reduzido na interação social com outra mosca. Em contraste, as moscas machos mutantes Fmr1 em grupo/socialmente alojadas mostram contagens de ataques de agressão comparáveis às das moscas w1118 socialmente alojadas (dados não mostrados), provavelmente indicando um papel positivo do ambiente social na indução do comportamento social.

Ensaio de Espaço Social
O ensaio do espaço social foi realizado em w1118 e moscas modelo ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). A distância até o vizinho mais próximo foi calculada para cada mosca e 10 repetições biológicas foram realizadas para cada genótipo. As moscas mutantes mostram distâncias de vizinhos mais próximos significativamente maiores do que as contrapartes de controle (Figura 2D), indicando uma preferência por maior distanciamento de outras moscas.

Ensaio de namoro
O ensaio de namoro de moscas machos alojadas em um único foi realizado para quantificar o comportamento inato de corte de duas moscas modelo de TEA separadas. Primeiro, o comportamento de corte das moscas trans-heterozigóticas Fmr1 foi comparado com o de w1118; As moscas Fmr1 mostraram um índice de namoro significativamente menor, bem como um número reduzido de tentativas de cópula (Figura 3E1). Em um segundo experimento, row, um ortólogo de Drosophila do gene POGZ humano (um gene de risco de TEA20 altamente prevalente, foi derrubado pela expressão de um microRNA de grampo curto contra a linha em neurônios do corpo de cogumelo usando a linha de driver MB247-GAL4. Essas moscas modelo ASD knockdown foram testadas para qualquer defeito no padrão de namoro inato; O índice de namoro e o número de tentativas de cópula foram calculados a partir de vídeos de 15 minutos. As moscas knockdown mostraram um índice de namoro significativamente reduzido, bem como contagens de tentativa de cópula (Figura 3E2), indicando sua comunicação defeituosa com as fêmeas.

Comportamento de higiene
O comportamento de aliciamento é usado como uma leitura para comportamento repetitivo em Drosophila 16,42,43. O comportamento de limpeza foi quantificado em moscas trans-heterozigóticas Fmr1 e comparado com o de w1118. A latência para a primeira limpeza é significativamente reduzida em moscas Fmr1, enquanto a duração média da sessão de limpeza e o índice de limpeza são significativamente aumentados em moscas Fmr1 (Figura 4C), indicando comportamento aprimorado de limpeza (ou repetitivo) em moscas modelo ASD. Em contraste, o número total de episódios de limpeza nas moscas mutantes não foi alterado significativamente em comparação com o das moscas de controle.

Ensaio de habituação olfativa
A habituação é considerada defeituosa em um grande número de indivíduos autistas e pode ser usada como um ensaio para o mesmo em Drosophila23. Aqui, a habituação olfativa foi testada no modelo ASD, derrubando a linha em interneurônios locais olfativos acionados por LN1-GAL4. Um odor aversivo, 20% de butirato de etila, tem sido usado nesses experimentos para induzir a habituação nessas moscas. Os resultados mostram que as moscas knockdown não se habituaram após uma exposição ao odor de 3 dias (as duas últimas barras no gráfico na Figura 5E não mostram uma diferença significativa entre moscas ingênuas e habituadas) em comparação com as moscas selvagens, que mostram habituação típica após a exposição ao butirato de etila por 3 dias (moscas expostas mostram queda significativa no índice de desempenho em comparação com moscas ingênuas). Isso indica que as moscas knockdown não se habituam após a exposição ao butirato de etila por 3 dias e são repelidas pelo odor repulsivo, provando que essas moscas ASD são deficientes em habituação.

Figura 1: Arena de agressão e padrões comportamentais representativos. (A) A configuração da arena de agressão em uma placa de 24 poços com tampa perfurada para entrada de moscas. Inserção: Dimensões de uma única arena com comida de mosca. (B) Fotografia de um tubo de caixa única contendo uma única mosca macho isolada e um frasco de alojamento em grupo contendo moscas machos e fêmeas, recapitulando um ambiente social. (C) Um aspirador para transferência de moscas baseada em aspiração bucal. Itens necessários para a montagem de um aspirador de moscas indicando os lados do tubo para entrada de mosca (extremidade de mosca) e o lado que seria inserido na boca (extremidade da boca) (C1) e um aspirador de mosca montado (C2). (D) Padrões comportamentais agressivos representativos de macho-macho: abordagem, ameaça de asa, esgrima, segurar, investir, boxear e lutar. (E) As moscas machos mutantes Fmr1 mostram comportamento agressivo reduzido em relação a outros machos em comparação com os controles. Gráfico de caixa mostrando o número de ataques agressivos para machos socialmente isolados de w1118 (controle) versus moscas trans-heterozigóticas Fmr1 (Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração da arena de ensaio do espaço social. (A) Diagrama mostrando as dimensões e disposição dos painéis de vidro e espaçadores de acrílico. (B) O arranjo final dos componentes da arena onde os espaçadores de acrílico são imprensados entre as peças de vidro, deixando uma pequena lacuna para a entrada da mosca na parte inferior. O espaço triangular criado entre peças de vidro e espaçadores é a arena SSA para as moscas, aqui as moscas só podem se mover em duas dimensões. (C) Fotografia da configuração final da arena SSA com moscas dentro da câmara. Abreviação: SSA = matriz de espaço social. (D) As moscas modelo ASD (Fmr1 transheterozigoto) mostram maior distanciamento umas das outras no ensaio de espaço social em comparação com w1118. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Arena de namoro e padrões comportamentais representativos. Diagramas mostrando (A) desenho e (B) disposição dos discos em uma arena de ensaio de cortejo. (C) Foto da arena de namoro após o arranjo final. (D) Imagens representativas mostrando padrões comportamentais de namoro de um macho ingênuo em relação a uma fêmea acasalada: perseguição, orientação, oscilação das asas, lambidas, tentativa de cópula e cópula. (E) Gráficos mostrando o índice de namoro e o número de tentativas de cópula em dois modelos de TEA: (E1) Moscas mutantes Fmr1 mostrando redução significativa no índice de namoro e tentativa de cópula em comparação com o controle w1118 . (E2) moscas knockdown de linha foram usadas como outro modelo de TEA onde row-shRNA foi expresso emneurônios do corpo de cogumelo (MB247-GAL4); Uma redução significativa no comportamento de corte foi observada após o knockdown da linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Configuração da arena e padrões comportamentais representativos do comportamento de higiene. (A) A arena em forma de disco ou roda (mesma arena de namoro mostrada na Figura 3) é montada em um painel de LED com um difusor para iluminação uniforme na parte inferior e o vídeo foi capturado na parte superior. Isso garante um maior contraste necessário para identificar o movimento fino dos apêndices durante a escovação. (B) Fotografias de padrões de comportamento de higiene observados em moscas machos adultas. T1 =1º par de pernas, T2 =2º par de pernas, T3 = terceiro par de pernas. A nomenclatura abreviada intuitiva é usada para padrões de preparação em B: T1-cabeça = cabeça esfregada com as primeiras pernas; T1-T1 = primeiro par de pernas esfregadas e assim por diante. Abreviatura: LED = diodo emissor de luz. (C) Gráficos mostrando os resultados do ensaio de aliciamento realizado em moscas trans-heterozigóticas Fmr1 e comparados com w1118. As moscas mutantes Fmr1 mostraram latência significativamente reduzida para a primeira sessão de preparação, indicando o início precoce da limpeza em comparação com o controle. Além disso, a duração média da sessão de limpeza e o índice de limpeza foram significativamente aumentados em mutantes Fmr1 , indicativo de comportamento repetitivo aprimorado em moscas modelo de TEA. Em contraste, o número total de episódios de limpeza não foi alterado significativamente nas moscas mutantes em comparação com o controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Configuração de indução e ensaio para habituação olfativa e resultado representativo após o ensaio. (A) Componentes da configuração do ensaio de escolha de odor binário: (A1) o labirinto em Y, (A2) o adaptador, (A3) o arranjo desses dois, (A4) um par de tubos de coleta para fixação na parte superior dos braços do labirinto em Y, (A5) a garrafa de vidro e os tubos de vidro para manter a solução odorífera ou a água através da qual o ar borbulha antes de passar para o labirinto em Y. (B) Configuração de garrafa de comida para mosca para indução de habituação olfativa; diagrama de desenho animado (B1) mostra como o tubo de microcentrífuga contendo odor é pendurado em um fio de cobre no meio do caminho dentro da garrafa; (B2) finalmente, a abertura da garrafa é coberta por algodão e selada por envelopes de papel pardo. (C) Foto do arranjo total da configuração do labirinto em Y. (D) Fotografias mostrando a distribuição de moscas em câmaras de coleta após o término de um experimento. (D1) Moscas ingênuas (expostas apenas à parafina inodora, controle) mostram repulsa pelo odor aversivo (butirato de etila a 20% usado para indução de habituação neste estudo) e escolhem no braço do labirinto em Y cheio de ar regular, enquanto as moscas expostas (habituadas) (D2) se distribuem uniformemente em ambos os braços. Abreviatura: ID = diâmetro interno. (E) Os resultados do ensaio de habituação olfativa de moscas knockdown mostraram defeito de habituação. As moscas do tipo selvagem (Cantão S), após 3 dias de exposição ao butirato de etila, apresentaram uma redução significativa no índice de desempenho em comparação com as moscas virgens, indicativas de habituação. Quando progênies de moscas LN1-GAL4 x row-shRNA foram expostas por 3 dias, o índice de desempenho não foi significativamente diferente do de moscas virgens; isso demonstra que essas moscas knockdown não se habituaram após a exposição de 3 dias ao odorante, recapitulando um sintoma semelhante ao TEA humano. Abreviaturas: TEA = transtorno do espectro autista; shRNA = RNA em grampo curto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.