Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Summary

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Abstract

O baço é um órgão imunológico que desempenha um papel fundamental nas respostas imunes transmitidas pelo sangue. A perda anatômica ou funcional desse tecido aumenta a suscetibilidade a infecções sanguíneas graves e sepse. O autotransplante de cortes de baço tem sido usado clinicamente para repor o tecido perdido e restaurar a função imunológica. No entanto, o mecanismo que conduz a regeneração robusta e imunologicamente funcional do tecido baço ainda não foi totalmente elucidado. Aqui, pretendemos desenvolver um método para agregar e encapsular células do baço dentro de uma matriz semissólida, a fim de investigar as necessidades celulares para a formação de tecido esplênico. Construções celulares encapsuladas em matriz de membrana basal são passíveis tanto de cultura in vitro de organoides tridimensionais quanto de transplante sob a cápsula renal para avaliar diretamente a formação de tecidos in vivo . Através da manipulação das células de entrada para agregação e encapsulamento, demonstramos que as células estromais neonatais PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- derivadas do enxerto são necessárias para a regeneração do tecido esplênico em modelos de transplante animal.

Introduction

A ruptura traumática do baço e o aparecimento de múltiplos nódulos esplênicos no corpo foi um dos primeiros indícios de que o tecido esplênico abrigava capacidade regenerativa ^1,2. Os autotransplantes de baço foram posteriormente introduzidos na clínica para preservar o tecido esplênico em pacientes que necessitaram de esplenectomia de emergência³. No entanto, apesar de fazer parte da prática clínica há décadas, muito pouco se sabe sobre como o baço se regenera. Modelos de transplante animal têm fornecido informações sobre múltiplos parâmetros da regeneração do baço e da função imune ^4,5. Em particular, modificações experimentais no método de preparo do enxerto têm permitido que a regeneração tecidual seja estudada com mais detalhes em nível celular e molecular.

Os transplantes com cortes inteiros do baço passam por uma fase de necrose de massa antes da reconstrução de uma nova estrutura esplênica⁶. A fase inicial da necrose do enxerto sugere que a maior parte do tecido transplantado consiste em grande parte de glóbulos vermelhos e brancos e é desnecessária para a regeneração do baço. Isso foi investigado experimentalmente pela exclusão de células hematopoéticas de enxertos de baço antes do transplante sob a cápsula renal de camundongo. Aqui, a fração não leucocitária/não eritrocitária do baço, que inclui células estromais e endoteliais, mostrou-se suficiente para induzir a formação de novo ^tecido7. O tecido estromal do baço poderia ser processado em uma suspensão de célula única, permitindo o uso de tecnologias de classificação celular para manipular a composição do enxerto celular. Ao remover seletivamente os tipos celulares candidatos, foram identificadas duas populações de células estromais ^{CD45-TER-119-} indispensáveis para o desenvolvimento do enxerto: uma população de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ do tipo endotelial e uma população de células mesenquimais PDGFRβ⁺ mais amplamente^definida8.

A construção de enxertos a partir de células do baço varia em termos de materiais de suporte e processos de carregamento celular. Baços manipulados por tecidos foram previamente preparados carregando unidades esplênicas em um arcabouço poliglicólico de polímero de ácido poliglicólico/poli-L^de ácido lático ^5,9. Curiosamente, as células estromais do baço absorvidas em uma esponja de colágeno falharam em enxertar, enquanto as células estromais agregadas e carregadas sobre uma folha de colágeno facilitaram a regeneração do baço⁸. A ressuspensão de células estromais do baço dentro de uma matriz de Matrigel também demonstrou induzir agregação celular em condições de cultura tridimensional¹⁰. Entretanto, esse método ainda não foi testado para uso em modelos de transplante. O objetivo geral do protocolo atual é agregar e encapsular à força células estromais do baço diretamente na matriz da membrana basal, que posteriormente podem ser transferidas para um sistema tridimensional de cultura de tecidos in vitro ou usadas como veículo para transplantes em modelo animal (Figura 1 Suplementar).

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQBR/079/19).

1. Coleta de tecidos e preparo de células estromais

1. Eutanásia de camundongos doadores neonatais BALB/c machos e/ou fêmeas de 0,5-1,5 dias de idade por indução de hipotermia, envolvendo os animais dentro do papel higiênico e colocando-os sob gelo triturado por >10 min.
   NOTA: Este protocolo pode ser adaptado a diferentes linhagens de camundongos, idades e número de animais.
2. Preparar instrumentos cirúrgicos estéreis.
3. Coloque o mouse na posição lateral direita. Esfregue a pele com etanol 80% e faça uma incisão de 1 cm com tesoura cirúrgica Iris para expor a parede peritoneal.
4. Faça uma segunda incisão de 0,5 cm acima do baço e use um par de pinças finas para levantar suavemente o tecido. Use uma tesoura cirúrgica para cortar os vasos sanguíneos e excisar o tecido. Transfira o tecido para uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. Remova qualquer tecido conjuntivo restante ligado ao baço.
   NOTA: Um estereomicroscópio pode auxiliar os movimentos motores finos necessários para manipular instrumentos cirúrgicos.
5. Para dissociar tecidos inteiros, transfira baços neonatais (pools de 10 ou menos) para a borda interna de uma tampa de tubo cônico invertida de 14 mL. Interrompa mecanicamente os tecidos com um movimento de pressão usando a extremidade traseira de plástico de um êmbolo de seringa de 1 mL.
6. Coloque e prenda bem a tampa sobre um tubo cônico de 14 mL contendo 10 mL de PBS frio. Inverta o tubo 5x para lavar todo o tecido rompido da tampa para o tubo.
7. Repetir o passo 1.6 para qualquer tecido restante.
8. Deixe o tubo no gelo por 1 min para deixar o tecido assentar no fundo do tubo.
9. Descarte cuidadosamente o sobrenadante (contendo células hematopoiéticas) passando a solução através de um filtro celular reversível de 70 μm.
10. Recuperar a fração estromal não solúvel invertendo o filtro e lavando o tecido estromal de volta para o tubo cônico de 14 mL usando 2 mL recém-preparados de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) suplementado contendo 1 mg/mL de colagenase IV, 40 μg/mL de DNase I e 2% de soro fetal bovino (FBS).
    ATENÇÃO: A colagenase IV e a colagenase D são substâncias perigosas e devem ser manuseadas dentro de um armário de biossegurança com equipamentos de proteção individual adequados.
11. Para preparar uma suspensão de célula única, digerir enzimaticamente o tecido acumulado (até 20) por 10 min a 37 °C com rotação constante.
12. Adicionar 4 mL de sDMEM recém-preparado contendo 1 mg/mL de colagenase D, 40 μg/mL de DNase I e 2% de SFB diretamente ao tubo contendo tecido estromal. Incubar durante mais 10 minutos a 37 °C com rotação constante.
13. Interrompa a digestão adicionando 8 mL de PBS gelado. Recolher células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
14. Eliminar o sobrenadante e lavar as células duas vezes, ressuspendendo em 1 ml de PBS frio e centrifugando a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Mantenha as células no gelo.
    NOTA: As células podem ser contadas e ajustadas para uma concentração desejada. Isso pode exigir otimização para diferentes populações celulares. Usando este protocolo, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ células estromais/baço são tipicamente recuperadas, dependendo da idade dos camundongos doadores. As células podem, opcionalmente, ser coradas e classificadas FACS nesta fase para definir a composição celular.

2. Encapsulamento matricial de agregados celulares

1. Ponteiras de pipeta P200 estéreis pré-refrigeradas dentro de um congelador de -20 °C.
2. Corte o filme de laboratório flexível (por exemplo, Parafilm) em pedaços de 1 cm x 2 cm e esterilize submergindo em etanol 80% por 10 min, seguido de PBS por 10 min. O filme de laboratório pode ser preparado com antecedência e armazenado estéril.
3. Preparar 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ células centrifugando a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 20 μL do volume restante de PBS. Mantenha a pastilha de célula no gelo.
   NOTA: O PBS restante pode ser aspirado suavemente sem perturbar o pellet de célula para confirmar o volume.
4. Aspirar 2 μL de matriz de membrana basal gelada em uma ponteira de pipeta P200 pré-resfriada, usando um pipetador P20.
   NOTA: Uma matriz de membrana basal altamente concentrada (por exemplo, Corning Matrigel Matrix High Concentration) auxilia na formação de um forte plugue solidificado.
5. Torça suavemente para ejetar a ponta da pipeta. Estique uma tira pré-esterilizada do filme de laboratório e coloque-a sobre a extremidade da ponta da pipeta, tomando cuidado para não perfurar o filme. Continue a envolver a ponta no filme para selar a ponta da pipeta. Coloque cuidadosamente a ponta selada diretamente sobre o gelo, tomando cuidado para não romper a película.
6. Ressuspenda o pellet de células no PBS restante e coloque a solução suavemente sobre a matriz da membrana basal. Mantenha a construção no gelo.
7. Prepare um tubo de centrifugação colocando um tubo de cluster de 1,2 ml dentro de um tubo cónico de 14 ml.
8. Coloque a ponta da pipeta dentro da configuração do tubo aninhado e centrífuga a 400 x g e 4 °C durante 5 min.
9. Posicionar o tubo cônico de 14 mL em uma orientação vertical e incubar a 37 °C por 15 min para permitir que a matriz da membrana basal se solidifique dentro da ponta da pipeta.
   NOTA: O tubo cônico de 14 mL pode ser colocado no gelo até que seja necessário para a aplicação a jusante.

3. Cultura de organoides tridimensionais

1. Remova cuidadosamente o filme de laboratório da ponta da pipeta.
2. Insira um êmbolo fino de fio de aço inoxidável através da abertura maior da ponta da pipeta.
3. Expelir o plugue da matriz até que seja liberado através da ponta em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços não tratada contendo 2 mL de sDMEM suplementado com 10% de SFB, 1x Glutamax, 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 10 μM de Inibidor de Rocha, 10 U/mL de Penicilina/Estreptomicina e 50 μM de β-mercaptoetanol.
   NOTA: O vaso de cultura de tecidos e o volume de mídia correspondente podem ser ajustados conforme necessário.
   CUIDADO: NEAA, Penicilina/Estreptomicina e β-mercaptoetanol são substâncias perigosas e devem ser manuseadas dentro de um armário de biossegurança com equipamentos de proteção individual apropriados.
4. Organoides de cultura a 37 °C, 5% CO₂ e 95% de umidade por 4-12 semanas.
5. Substitua metade do meio a cada 5 dias.
   NOTA: Se os organoides começarem a se fixar à placa de cultura de tecidos, transfira para um poço fresco.

4. Transplante de cápsula renal

1. Preparar instrumentos cirúrgicos estéreis.
2. Realizar um transplante renal subcapsular do plugue de matriz da membrana basal:
   1. Anestesiar camundongos receptores BALB/c com 8 semanas de idade com isoflurano seguindo as Diretrizes Institucionais de Ética Animal.
      CUIDADO: O isoflurano é uma substância perigosa. Os gases residuais devem ser eliminados para evitar a entrada no ambiente de trabalho.
   2. Coloque o mouse na posição lateral direita.
   3. Raspar os cabelos do local da cirurgia e desinfetar a pele seguindo as Diretrizes Institucionais.
      OBS: Recomenda-se que o sítio cirúrgico seja desinfetado três vezes em movimento circular com esfoliação alternadamente à base de iodo ou clorexidina e à base de álcool.
   4. Faça uma incisão de 2 cm na pele perpendicular à coluna para expor a parede peritoneal.
      NOTA: Uma tesoura cirúrgica fina ou uma lâmina de bisturi podem ser usadas para incisão da pele. Os usuários devem seguir as Diretrizes Institucionais de Ética Animal ou Procedimentos Operacionais Padrão.
   5. Faça uma incisão menor de 0,5 cm na parede peritoneal acima do rim.
      NOTA: A incisão deve aproximar a largura do rim para garantir que o rim permaneça exteriorizado durante o transplante.
   6. Exteriorize o rim através da abertura peritoneal aplicando pressão para baixo usando o polegar e o indicador. Um par de pinças de anel pode ser usado para auxiliar a exteriorização. Certifique-se de que o rim está úmido durante todo o procedimento, aplicando regularmente PBS estéril usando um cotonete.
   7. Sob um estereomicroscópio, pinça a gordura perirrenal da cápsula renal com um par de pinças ultrafinas dobradas em um polo do rim. Use um segundo par de pinças ultrafinas dobradas para rasgar suavemente a membrana da cápsula renal para cima em uma direção oposta, criando uma pequena abertura.
   8. Insira cuidadosamente o pino de uma pinça sob a membrana da cápsula. Use um movimento de varredura lento para separar a membrana da cápsula do parênquima renal.
   9. Prepare o plugue da matriz da membrana basal para transplante removendo o filme de laboratório da ponta da pipeta.
   10. Levante a cápsula renal usando um pino da pinça e insira a ponta da pipeta através da abertura, empurrando-a em direção ao polo oposto do rim.
   11. Insira um êmbolo de arame na ponta da pipeta e expulse o plugue matricial, retirando simultaneamente a ponta da pipeta do rim.
   12. Umedeça o rim com PBS e volte a internalizar.
   13. Fechar a parede peritoneal com um fio de Vicryl 5-0 e fechar a pele com dois autoclipes.
   14. Administrar analgésico (Buprenorfina a 0,05-0,1 mg/kg por via subcutânea ou seguindo as Diretrizes Institucionais de Ética Animal).
       CUIDADO: A buprenorfina é uma substância perigosa e deve ser manuseada com equipamentos de proteção individual adequados.
3. Desligue o fluxo de isoflurano, mas mantenha o fluxo de oxigênio ligado para permitir que o rato respire oxigênio puro até começar a ganhar consciência.
4. Devolva o mouse à gaiola. Mantenha o animal aquecido durante a recuperação, colocando parcialmente a gaiola em cima de uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor, e monitore até que o rato se recupere totalmente da anestesia.
5. Monitorar a recuperação pós-cirúrgica nas primeiras duas semanas ou conforme exigido pelas Diretrizes Institucionais.

Results

A agregação celular é importante para promover o contato e a sinalização célula-a-célula. Os agregados celulares que envolvem o interior da matriz da membrana basal suportaram ambas as culturas tridimensionais para a formação de organoides teciduais in vitro e facilitaram a entrega mecânica das células na cápsula renal para o transplante do enxerto. Para estabelecer esses construtos, a matriz da membrana basal foi primeiramente mantida em estado fluídico sob condições geladas. A agregação celular foi subsequentemente obtida por camadas de uma suspensão celular concentrada acima e usando força centrífuga para empurrar as células através da matriz de alta densidade. A otimização da velocidade de centrifugação (200-2000 x g) foi necessária para obter um posicionamento da célula da camada média (Figura 1A), que também era dependente do número de células. Forças centrífugas mais altas (>500 x g) impulsionaram as células até a ponta da pipeta (Figura 1B), e é necessário cuidado para números menores de células (isto é, <5 x 10⁵) que podem ser perdidos durante a remoção da cobertura flexível do filme de laboratório. Por outro lado, as células podem não viajar adequadamente através da matriz da membrana basal se as forças G forem muito baixas (≤200 x g) (Figura 1C). A velocidade de centrifugação para números de células <1 x 10⁵ ou >2,5 x 10⁶ pode precisar de otimização adicional. Após a centrifugação, as células foram colocadas dentro da matriz da membrana basal aquecendo a construção a 37 °C por 15 min. Esse processo de solidificação permitiu que o "plug" da matriz fosse ejetado inteiramente (Figura 1D) usando um êmbolo de fio fino.

Formação de organoides esplênicos in vitro
Plugs de matriz de membrana basal ejetados em um vaso apropriado de cultura de tecidos formaram estruturas 3-dimensionais semelhantes a organoides de forma reprodutível que poderiam ser mantidas seguindo técnicas e condições padrão de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO₂, 95% de umidade)¹¹. Em cultura, o substrato da matriz da membrana basal de suporte dissipou-se gradualmente entre os dias 0 e 14 (Figura 2A, i-iii) e não pôde mais ser observado até o 21º dia, deixando intacta a massa celular esférica organóide-símile (Figura 2A, vi) medindo aproximadamente 545 μm (d.p. = 120 μm, n = 6)¹¹ de diâmetro. Essas estruturas organoides foram suportadas em cultura após 30 dias, mas não aumentaram de tamanho ao longo do tempo (Figura 2B). Os organoides do baço eram compostos por células linfoides CD45-TER-119^-, CD45-TER-119⁺ e CD45⁺TER-119^- (Figura 2C), no entanto, a frequência de cada população foi variável entre os organoides individuais (n = 4; Tabela 1). Para avaliar a estrutura geral dos organoides do baço, criossecções teciduais de 50 μm de espessura foram preparadas e visualizadas. Os organoides eram constituídos por uma estrutura não oca, com células presentes em todo o diâmetro do tecido (Figura 2D). A avaliação dos cortes organoides com 7 μm de espessura de camada única de célula revelou que as células estavam dispostas em estruturas semelhantes a cordões sem uma orientação espacial clara (Figura 2D), com áreas vazias de núcleos entre as cadeias de células. A coloração pelo anticorpo CD45 verificou a presença de células hematopoéticas nucleadas que circundavam densamente regiões periféricas do organoide (Figura 2E). Além disso, células CD45⁺ de morfologia fusiforme distinta foram observadas em regiões organoides mais centrais. A ausência geral de coloração de anticorpos CD90.2 (células T) e CD19 (células B), mas a coloração positiva para CD11b, demonstrou a presença específica de células mieloides (Figura 2F). Células endoteliais CD105⁺ e CD31⁺ não hematopoéticas também foram detectadas em múltiplos organoides11.

Transplante de enxerto de baço in vivo
O encapsulamento de células estromais agregadas do baço dentro de uma matriz semissólida facilita os estudos de transplante animal. Esta técnica foi usada para incorporar preparações de células estromais neonatais do baço não fracionadas ou CD45-TER-119-FACS dentro de um tampão de matriz de membrana basal, servindo como veículo para transplante sob a cápsula renal de camundongo. De acordo com protocolos semelhantes de agregação^celular8, construções celulares encapsuladas em matriz de membrana basal (MECCs) regeneraram com sucesso o tecido esplênico em 4/5 transplantes independentes de animais, confirmando assim a viabilidade desta técnica de construção do enxerto. Para testar a utilidade dos MECCs na definição dos tipos celulares necessários para a regeneração do baço, os enxertos de MECC foram construídos a partir de células neonatais do baço que foram especificamente depletadas de PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ ou PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- estromal (CD45^-)¹¹. Enxertos sem células PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ mantiveram a capacidade de regeneração tecidual macroscópica (4/4 enxertos; Figura 3A) ¹¹. Três dos quatro tecidos regenerados exibiram composição e estrutura normal das células do baço, exibindo arteríolas centrais, folículos polpos brancos, compartimentos de células T e B segregados, células dendríticas foliculares, células reticulares da zona marginal, macrófagos metalofílicos marginais, sinusóides da polpa vermelha, células mieloides e macrófagos (Figura 3B)¹¹. Em contraste, enxertos que não possuíam células PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- falharam em grande parte em regenerar o tecido esplênico (1/4 dos enxertos)¹¹. Esses dados suportam a importância das células PDGFRβ⁺ derivadas do enxerto na regeneração do tecido esplênico8 e apontam um requisito específico para as células estromais PDGFRβ⁺MAdCAM-1^-.

Gráfico 1. Encapsulamento da matriz da membrana basal de células estromais agregadas do baço. Uma ponta de pipeta de 200 μL é usada para facilitar a agregação celular dentro de uma matriz de membrana basal. Uma camada de matriz fluídica é estabelecida pela aspiração de 2 μL de matriz basal gelada em uma ponta de pipeta pré-resfriada. Uma suspensão celular é depositada acima da camada da matriz, e a força centrífuga é aplicada para mobilizar e agregar as células dentro da matriz da membrana basal. (A) As configurações de velocidade de centrífuga são otimizadas para posicionar os agregados celulares no meio do caminho ao longo da camada matricial. (B) A velocidade centrífuga excessiva resulta em células que se agregam no final da pipeta. (C) A velocidade insuficiente impede o movimento das células através da matriz. (D) Um tampão de matriz semissólida é ejetado da ponta da pipeta após incubação a 37 °C durante 15 minutos. As pontas de seta indicam a colocação dos agregados celulares dentro da matriz. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 2. Cultivo in vitro de agregados baços encapsulados em matriz de membrana basal e formação de estruturas organoides tridimensionais. (A) Desenvolvimento organoide do baço ao longo de um curso de 35 dias. Os painéis (i-vi) correspondem aos Dias 0, 7, 14, 21, 28 e 35 na cultura. As imagens foram capturadas em microscópio Nikon TS2 Inverted Phase Contrast. Barra de escala, 500 μm. (B) Diâmetro organoide do baço durante longos períodos de cultura. Cada linha representa um organoide individual. (C) Caracterização por citometria de fluxo das populações de células estromais (CD45-TER-119^-), linfoides (CD45⁺TER-119^-) e eritróides (CD45-TER-119⁺) após 53 dias em cultura. Painel superior: Tecido controle preparado a partir do estroma neonatal do baço. Painel inferior: Organoide do baço, Dia 52. (D) Morfologia macroscópica do tecido organoide com espessuras de corte de 50 μm (painéis superiores) e 7 μm (painéis inferiores) após 22 dias de cultura. (E) Localização e morfologia das células hematopoéticas CD45⁺ após 34 dias de cultivo. A região ampliada é mostrada nos painéis da direita. Os cortes são de 7 μm. (F) Avaliação de células mieloides (CD11b), T (CD90.2) e B (CD19) após 34 dias em cultura. A região ampliada é mostrada na inserção. As seções são de 7 μm. As imagens foram capturadas usando um microscópio Nikon Eclipse Ti2-E de células vivas. Barras de escala (D, E, F), 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 3. Análise tecidual de enxerto de matriz de membrana basal. Os enxertos foram construídos a partir do estroma neonatal do baço depletado de células PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ (n = 4). Dados adicionais disponíveis online¹¹. (A) Aspecto macroscópico de enxerto de baço regenerado 4 semanas após o transplante sob a cápsula renal. A área amarela encaixotada indica tecido do baço regenerado. A imagem foi capturada usando um estereomicroscópio Leica M60 equipado com um adaptador de zoom Snap e um Apple iPhone 6S. Barra de escala, 1000 μm. (B) Imagens compostas de imunofluorescência multicolorida de tecidos de enxerto de 30 μm de espessura criossecados no plano coronal. A coloração de anticorpos foi realizada com marcadores indicados para visualização da microarquitetura do tecido esplênico. As imagens foram capturadas usando um microscópio Nikon Eclipse Ti2-E de células vivas. As áreas in a box mostram regiões de maior ampliação. Barra de escala, 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Organoide nº.	Células estromais	Eritrócitos	Linfócitos
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabela 1. Porcentagem de populações de células estromais, eritroides e linfoides entre organoides individuais do baço.

Figura complementar 1. Visão geral esquemática do protocolo destacando as principais etapas na geração de construções celulares embutidas em matriz para estudos in vitro e in vivo . Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A agregação de células neonatais do baço dentro de um meio semissólido representa um método viável para a geração de construtos esplênicos. Protocolos semelhantes baseados em matriz de membrana basal têm sido utilizados para iniciar culturas tridimensionais do baço¹⁰. Aqui, demonstramos que construtos esplênicos são igualmente passíveis de sistemas de cultura de organoides in vitro , bem como de modelos de transplante in vivo . É importante ressaltar que o transplante de organoides do baço cultivados in vitro ainda não foi testado, mas seria de interesse determinar a capacidade de regeneração total ou parcial do tecido esplênico. Esse protocolo também herda técnicas de agregação celular descritas em estudos anteriores de transplante de^baço8. Esses estudos envolveram o carregamento de agregados celulares sobre uma folha de colágeno seguido de transplante sob a cápsula renal. O envelopamento de agregados celulares dentro da matriz da membrana basal oferece uma vantagem distinta em termos de orientação do enxerto, onde a variação associada ao transplante de colágeno de lado para baixo versus agregado celular de lado para baixo é eliminada.

A metodologia para a preparação de construtos matriciais de membrana basal é relativamente simples. O uso de matriz de membrana basal de alta concentração garante que as células sejam inicialmente suportadas em um estado agregado, antes que a matriz se dissipe ao longo de vários dias. Em nossa experiência, há mínima mistura e diluição da matriz da membrana basal após cuidadosa camada (Passo 2.6) e centrifugação (Passo 2.8) de uma solução de célula suspensa em PBS. A maioria das otimizações centra-se no posicionamento do pellet da célula dentro do plugue da matriz (Figura 1). Isso pode ser resolvido testando várias variáveis, como velocidade de centrifugação, tempo, composição do volume da matriz da membrana basal, volume da solução da célula suspensa em PBS e tamanho da ponta da pipeta. O número e as características celulares (tamanho, densidade) também podem influenciar os cenários, e cada preparação celular deve ser otimizada individualmente.

Várias limitações são importantes destacar. A matriz de membrana basal pode ser um produto sensível à temperatura, e deve-se tomar cuidado para trabalhar rápido para manter os reagentes frios. Isso evita a solidificação prematura da matriz e garante o encapsulamento adequado das células. Enquanto todos os materiais relevantes são armazenados, preparados ou mantidos em um ambiente frio, as etapas de manuseio manual (por exemplo, ejetar a ponta da pipeta, selar com filme de laboratório flexível [Passo 2.5]) podem introduzir calor externo do usuário, alterando a viscosidade da matriz e influenciando as características de migração celular durante a centrifugação. A reprodutibilidade dentro e entre experimentos pode, portanto, ser difícil de ser alcançada de forma consistente.

A segunda limitação é a exigência de experiência e proficiência do usuário. Certas técnicas manuais podem exigir treinamento prolongado para serem executadas de forma eficiente e bem-sucedida. Por exemplo, selar a ponta da pipeta com filme de laboratório (Passo 2.5) pode inicialmente resultar em baixas taxas de sucesso, mas isso inevitavelmente melhorará com a prática. A competência com técnicas microcirúrgicas animais também é obtida através da repetição. Para transplantes, deve-se tomar cuidado, especialmente ao inserir a ponta da pipeta abaixo da cápsula renal (Passo 4.2.10), inserir o êmbolo de arame para ejetar o plugue (Passo 4.2.11) e retirar a ponta do rim. É importante que o plugue seja ejetado suave e firmemente enquanto a ponta da pipeta é retirada simultaneamente. O excesso de movimento pode resultar na perfuração da cápsula renal ou na lesão do parênquima, levando a sangramento excessivo.

Em resumo, um processo de encapsulamento de células dentro de uma matriz semissólida foi descrito aqui com foco no entendimento da formação de tecido esplênico. Este sistema poderia igualmente ser aplicado a uma ampla gama de tipos celulares com potencial para múltiplas aplicações in vitro ou in vivo a jusante.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Tubos de Cluster de Polipropileno de 1,2 mL	Corning	CLS4401	Para colocar dentro de um tubo cônico de 14 ml
B-mercaptoetanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use a 50 uM
Colagenase D	Roche	11088858001
Colagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	De Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I de pâncreas bovino, Tipo II-S, pó liofilizado, Proteína ≥ 80 %, ≥ 2.000 unidades/mg de proteína
Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg / L Glicose, L-Glutamina e Bicarbonato de Sódio, sem Piruvato de Sódio, Líquido. Estéril filtrado.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, filtrado estéril
Eclipse 200 μ l Pontas de Pipeta	Labcon	1030-260-000	Ponto de
Bisel Fetal Soro Bovino (FBS)	Gibco	26140-079	Lote# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Estoque 100X, use em 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel Matriz de base de membrana Alta Concentração, Lote# 7330186
MEM Aminoácidos Não essenciais	Gibco	11140076	Estoque 100X, use em 1X
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122	Estoque 10.000 unidades/ml Penicilina, 10.000 ug/ml
Filtro de Células Reversíveis	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Pinças de anel	NAPOX	A-26	Tamanho do anel: 3 mm
Inibidor de rocha (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		As velocidades de aceleração e desaceleração foram ajustadas para 8
pinças ultrafinas	EMS	78340-51S	Estilo 51S. As pinças de aço austenítico de baixo carbono SA antimagnéticas / antiácidas são resistentes à corrosão. Acabamento acetinado antirreflexo.
Vicryl 5/0 Sutura Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Êmbolo de Fio Longo	Drummond	5-000-2002-L	Êmbolo de Aço Inoxidável, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, Longo
Aplicador de Clipe de Ferida	MikRon	427630
Clips de Ferida	MikRon	427631	9 mm