Explorando soluções alternativas de perfusão usando transportadores de oxigênio à base de hemoglobina polimerizada de última geração em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato

Summary

Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo em que essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato.

Abstract

O transplante de pulmão é dificultado pela falta de doadores adequados. Anteriormente, os doadores considerados marginais ou inadequados eram descartados. No entanto, tecnologias novas e empolgantes, como a perfusão pulmonar ex vivo (EVLP), oferecem aos provedores de transplante de pulmão uma avaliação estendida para aloenxertos de doadores marginais. Essa plataforma de avaliação dinâmica levou a um aumento no transplante de pulmão e permitiu que os provedores usassem doadores que antes eram descartados, expandindo assim o pool de doadores. As técnicas de perfusão atuais usam perfusatos celulares ou acelulares, e ambas têm vantagens e desvantagens distintas. A composição da perfusão é fundamental para manter um ambiente homeostático, fornecendo suporte metabólico adequado, diminuindo a inflamação e a morte celular e, finalmente, melhorando a função do órgão. As soluções de perfusão devem conter concentração proteica suficiente para manter a pressão oncótica adequada. No entanto, as soluções de perfusão atuais geralmente levam ao extravasamento de fluido através do endotélio pulmonar, resultando em edema pulmonar inadvertido e danos. Assim, é necessário desenvolver novas soluções de perfusão que evitem danos excessivos, mantendo a homeostase celular adequada. Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo no qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. O objetivo deste estudo é fornecer à comunidade de transplante de pulmão informações importantes para projetar e desenvolver novas soluções de perfusão, bem como os protocolos adequados para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.

Introduction

Como qualquer campo do transplante de órgãos sólidos, o transplante de pulmão sofre com a escassez de órgãos de doadores. A fim de aumentar o pool de doadores, pesquisas significativas têm se dedicado a investigar o potencial de aloenxertos que antes eram considerados inadequados para transplante, ou seja, doadores de critérios estendidos (ECD). Esses aloenxertos podem ser considerados DCE por vários motivos, incluindo qualidade questionável, má função, infecção, trauma, tempos isquêmicos prolongados de calor ou frio e idade avançada ^1,2. Em certos casos, onde esses pulmões são adequados para transplante imediato³, muitas vezes é vantajoso para provedores e receptores avaliar esses pulmões por mais tempo para determinar sua adequação para transplante. A perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) é uma tecnologia que permite a avaliação estendida de potenciais aloenxertos pulmonares em um circuito fechado fora do doador 2,4,5,6,7, proporcionando ao provedor de transplante a capacidade de determinar a adequação do transplante. A PPEV tem demonstrado capacidade de avaliar adequadamente os órgãos de doadores 8,9,10,11, diminuir os efeitos da lesão de reperfusão isquêmica (IRI) ^12,13 e aumentar o pool de doadores^14,15, tornando o transplante pulmonar um tratamento mais acessível para todos.

Em geral, um sistema de PPEV é um sistema fechado com um circuito ventilatório (obtido pela conexão de um ventilador à traqueia para introduzir ar no sistema) e um circuito vascular (obtido pela conexão do átrio esquerdo (AE) à artéria pulmonar (AP) com tubulação)⁷. O circuito vascular tem perfusato perfusando passando pelo tubo para fornecer nutrientes vitais e oxigênio ao pulmão, limitando o tempo isquêmico frio (CIT)5,8,16,17. Essa solução é baseada no sangue (ou seja, por meio da adição de concentrado de hemácias (PRBCs)^)16,17 ou acelular (ou seja, sem PRBCs)^4,5. No entanto, existem várias desvantagens notáveis no uso de PRBCs. Se forem usados CHP de doadores que morreram de trauma ou doadores com morte encefálica (TDC), esses fluidos geralmente contêm grandes quantidades de citocinas inflamatórias, que podem aumentar o dano celular durante a PPEV, bem como aumentar os níveis de hemoglobina livre de células (Hb), heme, ferro e fragmentos celulares que causam danos adicionais às células^18,19. Além disso, como esses doadores geralmente são de múltiplos órgãos, a coleta de CH antes da aquisição pode levar à diminuição do volume sanguíneo no doador e, subsequentemente, ao aumento da isquemia para todos os órgãos. Se usarem CHP de outra fonte, os provedores podem enfrentar escassez de sangue, pois este é um material escasso por si só^20,21. Finalmente, os CHPs são propensos à lise mecânica no circuito EVLP, independentemente de sua fonte, liberando Hb e outros componentes que contribuem para o dano celular.

Assim, por muitas razões, pode ser vantajoso usar um substituto artificial dos glóbulos vermelhos, ou seja, transportadores de oxigênio à base de hemoglobina (HBOCs), como suplemento de perfusato. Um HBOC particularmente promissor é a hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). A polihHb é sintetizada a partir de Hb purificada de CH vencidas que foram consideradas inadequadas para transfusão imediata²². Eles têm se mostrado substitutos viáveis do sangue no choque hemorrágico²³ e no transplante²⁴ e podem ser produzidos em grandes quantidades²². No entanto, a adoção em larga escala da PolihHb não teve sucesso devido a complicações imprevistas, como vasoconstrição, aumento da pressão arterial e parada cardíaca^23,25. As razões por trás desses achados foram provavelmente devido à presença de polímeros de Hb livre ou de baixo peso molecular (< 500 kDa) na solução de PolyhHb, pois eles têm uma propensão a extravasar para o espaço tecidual, o que resultou em diminuição da disponibilidade de óxido nítrico, subsequente vasoconstrição, hipertensão sistêmica e, finalmente, lesão oxidativa do tecido^26,27. Para melhorar essas questões, o Laboratório Palmer trabalhou para desenvolver um PolyhHb de próxima geração que contenha espécies mínimas de baixo MW e Hb livre de células, que demonstrou características biofísicas aprimoradas e respostas in vivo 22,28,29,30. Vários estudos transfusionais em animais mostraram que, se polímeros de Hb de baixo peso molecular forem eliminados do HBOC, a vasoconstrição, a hipertensão sistêmica e o dano oxidativo podem ser mitigados 28,29,31,32,33,34,35. Portanto, tornando este PolyhHb de próxima geração um candidato promissor a perfusato.

Aqui, descrevemos a aplicação de um PolyhHb de última geração para ser usado em um perfusato e o protocolo pelo qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. O objetivo deste estudo é fornecer à comunidade de transplante de pulmão informações importantes na concepção e desenvolvimento de novas soluções de perfusão, bem como fornecer protocolos para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.

Protocol

Ratos Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) foram obtidos comercialmente e alojados em condições livres de patógenos no Centro Médico Wexner da Universidade Estadual de Ohio. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).

1. Síntese e purificação de PolyhHb

NOTA: A produção e síntese do material PolyhHb que foi usado para os seguintes experimentos de EVLP foram inicialmente publicados por Cuddington et al. em 2020²². Consulte este trabalho para esquemas detalhados e análise da síntese de PolyhHb. A seguir, um resumo da síntese e purificação de PolyhHb em escala piloto e sua subsequente preparação como perfusato.

1. Lavagem de hemácias, lise e purificação de Hb
   1. Adquira 18 unidades de CH humanos vencidos e despeje-os em um recipiente de filtração de 20 L, diluído com 0,9% em peso de solução salina até um hematócrito final de 22% (Figura 1B, C).
   2. Realize seis trocas de volume do sistema (diaciclos) em um módulo de filtração de fluxo tangencial (TFF) de polietileno sulfona modificado (mPES) de 0,65 μm com 0,9% em peso de solução salina na solução de hemácias. NOTA: O objetivo desta etapa de lavagem é remover hemácias danificadas, fragmentos de membrana e outros materiais extracelulares antes da hemólise ( Figura 1B, C ).
   3. Lisar a solução de hemácias com 10 l de tampão fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) durante 1 h a 4 °C com agitação constante.
   4. Remover os fragmentos de membrana lisada e outros agregados filtrando a solução sobre um módulo TFF de 500 kDa e recolhendo o permeado no recipiente do reator de 30 L (Figura 1A-C).
   5. Quando 480 g de Hb estiverem no reator, adicione uma carga de sal para converter PB em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   6. Recircule o Hb através de um contator de gás alimentado com nitrogênio, bem como mantenha um espaço de cabeça de nitrogênio no reator, para desoxigenar a proteína durante a noite. Refrigerar a 14 °C para limitar a formação de metemoglobina (metHb).
2. Polimerização de Hb
   1. Aquecer a solução de Hb à temperatura fisiológica (37 °C) enquanto recircula a solução num circuito de contactor de gás.
      NOTA: O objetivo é desoxigenar a proteína a um pO₂ entre 0-10 mmHg para garantir que a maior parte da Hb esteja no estado quaternário tenso (Figura 1A).
   2. Adicione 1 g de carga de ditionito de sódio, conforme necessário, para garantir uma desoxigenação eficaz.
   3. Enquanto mantém o circuito de recirculação e desgaseifica a solução de Hb, adicione uma proporção molar de 30:1 de glutaraldeído (GA) para Hb diluído em 3 L de PBS desoxigenado (pH 7,4).
   4. Adicionar a solução ao vaso do reator durante 3 h com uma hora adicional de tempo de reação.
   5. Extinguir a reação de reticulação com uma proporção molar de 7:1 de cianoborohidreto de sódio para GA, diluído em 3 L de PBS (pH 7,4). Adicione ao reator por mais de 10 min.
   6. Refrigerar o reactor a 14 °C durante a noite.
3. Purificação de PolyhHb
   1. Bombeie o conteúdo do reator para um recipiente de filtragem de 10 L e inicie a circulação através de um módulo TFF de polietileno sulfona (PES) de 0,2 μm (Estágio 1). Esta etapa removerá grandes agregados e contaminantes indesejados.
   2. Alimente o permeado em um recipiente de filtragem secundário de 10 L que circulará sobre um módulo TFF de polissulfona (PS) de 500 kDa (Stage 2) uma vez cheio. Continue até que o reator seja esvaziado (Figura 1B,D).
   3. Assim que o reator for esvaziado no circuito de purificação, inicie a troca de excipientes no Stage 1 com uma solução de Ringer com lactato modificada (pH 7,4). Após cada troca de volume total, medir a concentração de proteínas no permeado da fase 1 utilizando espectroscopia UV-visível.
   4. Quando o permeado do Estágio 1 tiver uma concentração inferior a 1 mg Hb / mL, transfira a solução de Ringer modificada para o Estágio 2. Qualquer retenção no Stage 1 é um desperdício e deve ser descartado adequadamente. No total, certifique-se de que 12 trocas de volume total da solução de Ringer modificada sejam realizadas em ambos os estágios.
   5. Após a conclusão dos diaciclos, concentrar o conteúdo da fase 2 em, pelo menos, 10 g/dL sobre o módulo TFF de 500 kDa.
   6. Embalar a solução concentrada em tubos cónicos de 50 ml e conservar a -80 °C até à utilização.

2. Formulação de perfusato

1. Prepare o perfusato para um volume final de 165 mL. Diluir o PolyhHb até uma concentração final de 3,7 g/dL com o meio E de William.
2. Adicione albumina sérica humana (HSA) a uma concentração final de 3% de HSA em peso. Adicione 1 mL de heparina à solução final.

3. Configuração do circuito de perfusão pulmonar ex vivo

1. Coloque o perfusato de PolyhHb no reservatório do circuito EVLP e ligue o banho-maria quente a 37 °C. Certifique-se de que o perfusato esteja circulando dentro do circuito ligando as bombas de rolos.
2. Conecte o gás de desoxigenação (ou seja, 6% O₂, 8% CO₂, 84% N₂) ao oxigenador de fibra oca para desoxigenar o perfusato. Isso é feito para avaliar a capacidade do pulmão de oxigenar o perfusato.
3. Abra o software de aquisição de dados em um computador próximo. Certifique-se de que a pressão da artéria pulmonar, a pressão diferencial traqueal, a pressão diferencial do fluxo respiratório, o peso pulmonar e os transdutores de velocidade da bomba estejam conectados ao circuito e à caixa do conversor de dados.
4. Certifique-se de que não haja vazamentos em todo o sistema, examinando cuidadosamente todas as conexões do tubo e que a água quente esteja circulando (Figura 2). Pressione Executar no software de aquisição de dados para garantir que todos os transdutores de pressão estejam funcionando. Quando o sistema estiver funcionando corretamente, desligue as bombas de rolos.

4. Obtenção de bloqueio pulmonar de rato doador

1. Montar a mesa cirúrgica e dispor os instrumentos (Figura 3). Autoclave todos os instrumentos a 121 °C por 30 min.
2. Prepare 1200 U/kg de heparina, uma mistura de cetamina/xilazina para anestésico (60 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg), bem como suturas de seda de 5-10 cm de comprimento (3-0 ou 4-0).
3. Injete a solução de cetamina/xilazina por via intraperitoneal no rato. Aguarde de 5 a 10 minutos para que o plano anestésico se desenvolva. Para garantir um nível adequado de anestesia, belisque o rato com o dedo do pé para provocar uma reação. Se não houver reação, o nível adequado de anestesia foi atingido.
4. Raspe o abdômen do rato e coloque-o em decúbito dorsal na prancha cirúrgica. Limpe o abdômen com iodopovidona e etanol 70%. Coloque pomada oftálmica sob os olhos do rato para evitar o ressecamento.
5. Mova o rato para a placa cirúrgica e prenda o rato no lugar (Figura 4A). Ligue o software de aquisição de dados e comece a gravar. Ligue o ventilador a 4 mL/kg e certifique-se de que a pressão expiratória final positiva (PEEP) esteja em torno de 2 cm/H₂O.
   NOTA: Essas configurações iniciais são específicas do experimento. Cabe a todos os pesquisadores determinar as melhores estratégias ventilatórias para experimentos individuais.
6. Uma vez atingida a profundidade anestésica adequada, realize uma laparotomia da linha média do processo xifóide até a sínfise púbica usando uma tesoura. Em seguida, realizar uma rotação visceral médio-lateral e visualizar a veia cava inferior infra-hepática usando um instrumento rombudo (VCI)36,37,38 (Figura 4B). Injete heparina na VCI com uma agulha 20G (Figura 4C).
7. Volte a atenção para o pescoço e corte a pele da incisura esternal até logo abaixo do ângulo da mandíbula com uma tesoura. Em seguida, comece a dissecar em direção à traqueia (Figura 5A).
8. No pescoço, disseque sem rodeios os músculos necessários da cinta para expor a traqueia (Figura 5B). Faça uma incisão transversal com uma tesoura na traqueia anterior entre os anéis cartilaginosos grande o suficiente para o tubo endotraqueal (ET) (vários milímetros), mas não corte a porção posterior da traqueia. Coloque uma sutura de seda 5-0 ao redor da traqueia (Figura 5C).
9. Insira o tubo endotraqueal e fixe-o no lugar com a sutura de seda 5-0 mencionada acima (Figura 5D). Conecte o tubo ET ao ventilador e garanta a elevação adequada do tórax.
10. Realize uma esternotomia mediana e entre novamente na cavidade torácica usando uma tesoura. Coloque afastadores da parede torácica para expor o coração e os pulmões (Figura 6A). Evite qualquer manipulação inadvertida dos pulmões, pois eles são incrivelmente friáveis.
11. Remova o timo do mediastino anterior por uma combinação de dissecção afiada (tesoura) e romba. Tenha cuidado para não danificar grandes vasos ou pulmões.
12. Identificar a artéria pulmonar (AP; Figura 6B) e coloque uma sutura de seda 5-0 ao redor para preparar a canulação (Figura 6C). Devido à anatomia microscópica dos grandes vasos do rato, muitas vezes é mais fácil colocar a sutura ao redor do PA e da aorta ao mesmo tempo.
13. Faça uma incisão de 2-3 mm na via de saída do ventrículo direito (VSVD) usando uma tesoura (Figura 6D-E) para colocar a cânula arterial dentro do AP e fixá-la no lugar com a sutura 5-0 descrita um passo antes (Figura 6F).
14. Faça uma incisão de 5 mm no ventrículo esquerdo (VE), bem como na VCI infra-hepática, usando uma tesoura para eutanasiar o rato. Conecte rapidamente o fluido de preservação pulmonar à cânula arterial para lavar os pulmões por gravidade com cerca de 20 mL (Figura 7A-B). Certifique-se de que o fluido de preservação pulmonar seja desarejado antes de conectá-lo à cânula arterial, pois os êmbolos aéreos são muito prejudiciais aos pulmões.
15. Conecte a cânula arterial ao circuito EVLP. Ligue a bomba de rolos e deixe uma pequena quantidade de perfusato fluir através do pulmão e sair do ventrículo esquerdo para a cavidade torácica. Assim que o perfusato começar a fluir para fora do átrio esquerdo, desligue a bomba de rolos (Figura 7C). Ao permitir que o perfusato flua, certifique-se de que a pressão do PA não aumente - o que indicaria bloqueio ou posicionamento incorreto.
16. Coloque uma pequena pinça no VE e estique suavemente o anel da valva mitral, o que permitirá a introdução da cânula do átrio esquerdo (AE) (Figura 8A). Coloque uma gravata de seda 5-0 ao redor do coração e amarre frouxamente (Figura 8B).
17. Insira a cânula AL no VE e avance a cânula AL até que possa ser vista dentro do átrio. Termine de prender o AE com a sutura 5-0 pré-amarrada (Figura 8C).
18. Identifique o esôfago e prenda-o com um hemostático o mais próximo possível do diafragma. Corte o esôfago abaixo do hemostático para garantir que não haja derramamento na cavidade torácica (Figura 9A).
19. Usando a coluna como guia, corte todas as inserções ligamentares que conectam o bloco coração-pulmão às estruturas circundantes usando uma tesoura (Figura 9B). Uma vez que o bloqueio coração-pulmão esteja livremente móvel, disseque a traqueia do pescoço e, finalmente, corte a traqueia acima do tubo ET usando uma tesoura para liberar o bloqueio coração-pulmão (Figura 9C).
20. Mova o bloqueio coração-pulmão para a jaqueta torácica dentro do circuito EVLP e conecte a cânula AL ao circuito EVLP (Figura 9D). Ligue a bomba de rolos e conecte o monitor do ventilador.
21. Verifique a armadilha de bolhas para garantir que nenhum êmbolo de ar esteja sendo introduzido no sistema.
22. Altere lentamente as configurações de ventilação e perfusão para os níveis experimentais desejados durante os 15 minutos iniciais 36,37,38. Além disso, durante esta fase inicial de aceleração, aumente a taxa de fluxo de perfusão para a taxa e/ou pressão desejada.
23. Em pontos de tempo designados pelo experimento, verifique os níveis de gás perfusato, bem como os testes de função pulmonar.

Results

A validação de nosso perfusato baseado em PolyhHb e, além disso, a estabilidade desse perfusato ao longo de várias horas, é demonstrada na Figura 10. Durante a primeira 1 h, todos os perfusato testados (PolyhHb, Controle (Williams Media + 5% HSA), baseado em hemácias) mostraram uma ligeira diminuição no LA pO₂ (Post pO₂). No entanto, o perfusato baseado em hemácias mostrou uma diminuição significativa em 1 h em comparação com PolyhHb (p < 0,05). Quando testados nas horas seguintes, os perfusados PolyhHb e Controle apresentaram pO 2 estável no AE_, enquanto o PolyhHb teve uma tendência não significativa (p > 0,05) de maior pO₂ (Figura 10A). Delta pO₂, ou seja, a mudança no LA pO₂ de PA pO₂, novamente diminuiu significativamente em 1 h no grupo perfusato de hemácias (p < 0,05), enquanto permaneceu estável nos perfusato de PolyhHb e Controle com uma tendência não significativa (p > 0,05) de maior pO₂ no grupo PolyhHb (Figura 10B). O PCO₂ do AL foi significativamente menor no perfusato de hemácias e no perfusato de controle quando comparado ao perfusato de PolyhHb após a primeira hora (p < 0,05), e isso se manteve verdadeiro nas horas seguintes ao comparar o perfusato de PolyhHb e o perfusato de controle (Figura 10C). Finalmente, o delta pCO₂ (ou seja, a mudança no PA pCO2 do PA pCO2) aumentou significativamente no perfusato de hemácias após 1 h (p < 0,05) e, após várias horas, permaneceu estável no perfusato de polihHb e controle (Figura 10D).

Os dados fisiológicos pulmonares em tempo real coletados por meio do software de aquisição fornecem informações complementares aos níveis de gás perfusato (Figura 11). A resistência vascular pulmonar (RVP) mostrou novamente que o perfusato de hemácias aumentou significativamente na primeira hora (p < 0,05). Ao longo das várias horas restantes, tanto o perfusato de PolyhHb quanto o de controle apresentaram RVP estável e baixa (Figura 11A). A mudança no peso pulmonar também aumentou significativamente no perfusato de hemácias na primeira hora (p < 0,05) e aumentou tanto no perfusato de PolyhHb quanto no controle nas horas restantes, com um peso ligeiramente maior no perfusato de PolyhHb (Figura 11B). Finalmente, a complacência diminuiu significativamente no grupo perfusato de hemácias na primeira hora (p < 0,05), enquanto houve uma diminuição não significativa no perfusato de polihHb e controle (p > 0,05), com PolyhHb tendo a maior complacência após 4 h (Figura 11C).

Em termos de sucesso e/ou fracasso técnico (Figura 12), é importante chamar a atenção para várias coisas. Na Figura 12A, podemos ver a falha do aloenxerto devido à necrose do lobo superior direito devido a um possível coágulo dentro da vasculatura pulmonar. Na Figura 12B, notamos edema tecidual grave também no lobo direito, levando ao fracasso experimental. A Figura 12C-E mostra a preservação e aparência adequadas do tecido dentro das respectivas condições experimentais. Finalmente, na Figura 12F, podemos ver a preservação ideal do tecido após a lavagem com uma solução de preservação pulmonar.

Figura 1: Síntese e purificação de PolyhHb em escala piloto. (A) Biorreator para polimerização. (B) Os processos de filtração de fluxo tangencial (TFF) são instalados em um refrigerador de 4 °C. (C) Close-up da configuração paralela de TFF para a lavagem dos glóbulos vermelhos (RBC) e purificação da hemoglobina (Hb). (D) Close-up do sistema TFF em série de dois estágios para purificação de PolyhHb. Os recipientes para os estágios um e dois estão localizados à esquerda e à direita dos filtros, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral do circuito de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP). (A) Desenho esquemático do circuito EVLP. (B) Colocação in vivo de cânula de artéria pulmonar e cânula de átrio esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Instrumentos cirúrgicos utilizados para perfusão pulmonar ex vivo . (A) Sutura de seda. (B) Pinça de ponta fina (comprimento médio). (C) Pinça de ponta fina (comprimento longo). (D) Pinça curva de ponta fina. (E) Tesoura Mayo. (F) Cânula traqueal. (G) Cânula da artéria pulmonar (AP). (H) Cânula de átrio esquerdo (AE). (I) Retractores de caixa torácica. (J) Tesoura de mola. (K) Pinça DeBakey. (L) Hemostático. (M) Tesoura pequena. (N) Pequena pinça curva de ponta fina. (O) Pick-ups Adson. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Posicionamento cirúrgico e exposição da veia cava inferior (VCI). (A) Posicionamento do rato para aquisição pulmonar. (B) Exposição da VCI infra-hepática. (C) Canulação da VCI e injeção de heparina com agulha 27G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Canulação da traqueia com o tubo endotraqueal (ET). (A) Comece cortando a pele da área do pescoço. (B) Dissecar os músculos da cinta e o tecido conjuntivo para expor a traqueia. (C) Fazer uma incisão transversal na traqueia anterior entre os anéis cartilaginosos grande o suficiente para o tubo ET. (D) Insira o tubo ET na traqueia e prenda no lugar com sutura de seda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Colocação da cânula da artéria pulmonar. (A) Exposição da cavidade torácica para visualização do coração e pulmões. (B) Identificar o PA e isolá-lo. (C) Colocação de sutura ao redor do PA. (D) Cortar um pequeno orifício na via de saída do ventrículo direito (VSVD) para a cânula PA. (E) Colocação adequada da cânula PA dentro do PA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Lavando os pulmões com solução de preservação. (A) Conectando a cânula de descarga à cânula da artéria pulmonar (PA). (B) Líquido claro deve sair do átrio esquerdo (AE). (C) Conectar a cânula PA ao circuito de perfusão pulmonar ex vivo para garantir o fluxo e a colocação adequados da cânula PA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Colocação da cânula do átrio esquerdo (AE). (A). Dilatar suavemente o anel da válvula mitral com um par de pinças. (B) Colocação frouxa de uma sutura de seda ao redor do ventrículo esquerdo (VE). Colocação da cânula do AE no átrio esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Extração do bloqueio coração-pulmão. (A) Ligação do esôfago abaixo do hemostático. (B) A dissecação libera o bloqueio coração-pulmão da coluna vertebral. (C) Dissecar a traqueia. (D) Conexões adequadas e colocação de cânula de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. Perfusato os níveis de gás ao longo do tempo. (A) Pós-pO₂, ou seja, pO₂ do átrio esquerdo (AE), durante uma perfusão de 4 h. (B) Delta pO₂, ou seja, a alteração no LA pO₂ da artéria pulmonar (PA) pO₂ ao longo de uma perfusão de 4 h. (C) Pós-pCO₂, ou seja, LA pO₂, durante uma perfusão de 4 h. (D) Delta pCO₂, ou seja, a mudança no LA pO₂ de PA pO₂ ao longo de uma perfusão de 4 h. Azul representa perfusato de PolyhHb, preto representa perfusato de controle (meio padrão de William) e vermelho representa perfusato baseado em hemácias. N=6 por grupo. As barras de erro indicam o desvio padrão. A significância foi testada por meio do teste t de Student e é denotada por um *, p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. Dados fisiológicos pulmonares em tempo real. (A) Resistência vascular pulmonar (RVP) em 4 h de reperfusão. (B) Mudança (denotada por Δ) no peso pulmonar ao longo do tempo. (C) Adesão ao longo de 4 h de reperfusão. Azul representa perfusato de PolyhHb, preto representa perfusato de controle (meio padrão de William) e vermelho representa perfusato baseado em hemácias. N=6 por grupo. As barras de erro indicam o desvio padrão. A significância foi testada por meio do teste t de Student e é denotada por um *, p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Resultados técnicos representativos. (A) Falha do enxerto por infarto do lobo superior direito. (B) Falha do enxerto devido a edema grave do lobo direito. (C) Canulação e perfusão bem-sucedidas do aloenxerto pulmonar com perfusato de hemácias. (D) Canulação e perfusão bem-sucedidas do aloenxerto pulmonar com perfusato de PolyhHb. (E) Canulação e perfusão bem-sucedidas do aloenxerto pulmonar com perfusato padrão. (F) Preservação ideal do tecido após lavagem com solução de preservação pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O desenvolvimento e teste de soluções de perfusão é um novo empreendimento no qual muitos em todo o mundo estão embarcando. Tradicionalmente, os perfusato padrão oferecem a capacidade de suspender o tempo isquêmico e mitigar as lesões associadas à isquemia, bem como à reperfusão¹⁸. No entanto, a próxima evolução da EVLP é melhorar a tecnologia atual de perfusato, bem como incorporar terapias de reparo e recondicionamento 39,40,41,42,43.

A PoliHb descrita neste trabalho está entre 500 kDa e 0,2 μm para evitar que o material extravase do circuito para o pulmão, o que evitará a vasoconstrição e o aumento da pressão do PA³⁰. É fundamental que, ao longo das etapas de polimerização desta síntese, a pressão parcial de oxigênio (pO₂) seja mantida no valor apropriado para o produto PolyhHb de afinidade de oxigênio desejado. Isso inclui todas as soluções adicionadas ao longo da reação (ou seja, reticulador, solução de têmpera, etc.) com um pO2 compatível com o biorreator (ou seja, desgaseificado com nitrogênio, oxigenado, etc.). Uma grande vantagem desse procedimento de síntese é que o produto final possui equilíbrios de oxigênio modificáveis para permitir diferentes aplicações com diferentes demandas de oxigênio (ou seja, baixa afinidade de oxigênio PolyhHb para medicina transfusional, afinidade moderada de oxigênio para perfusão pulmonar ou alta afinidade de oxigênio para fornecimento de oxigênio direcionado). Também é importante garantir que haja um mecanismo de aquecimento no biorreator que não resulte em aquecimento excessivo dos pontos de contato, resultando na formação de proteínas danificadas. Descobrimos que uma bobina de cobre em todo o vaso fornecia aquecimento/resfriamento mais uniforme e menos prejudicial do que uma camisa de aquecimento isolada na parte externa do vaso (Figura 1A).

Embora o desenvolvimento de um modelo de EVLP em ratos não seja novo ^37,38, observamos várias áreas que podem levar a melhores resultados. Em primeiro lugar, é necessário fazer pequenas incisões na VCI após o sacrifício para garantir que não haja ar adicional que possa entrar nos pulmões através da circulação. Ao lavar o aloenxerto pulmonar com a solução de preservação pulmonar, uma cor branca pálida uniforme dos pulmões permite que o microcirurgião saiba que há sucesso técnico para o processo de aquisição. Se ainda houver um pulmão de cor rosa dentro do parênquima, às vezes é aconselhável ajustar a cânula PA para que todo o pulmão seja perfundido uniformemente. Embora a cânula PA seja frequentemente a parte mais fácil do procedimento de ser concluída, a introdução da cânula LA é um pouco mais difícil. É sempre necessário dilatar o anel da valva mitral para que a cânula do AE alcance o AE. No entanto, isso deve ser feito com extrema cautela, pois é fácil perfurar o ventrículo ou os átrios. Uma vez que a ponta da cânula está dentro dos átrios, muitas vezes ela pode se deslocar ao prender a sutura ao redor do ventrículo. Muitas vezes é necessário ajustar o ângulo da mesa (mais horizontal) ou colocar um pedaço de gaze na parte inferior da cânula para que ela permaneça no lugar.

Limitações
Existem algumas limitações para este modelo. Embora seja útil avaliar a eficácia dos perfusato e sua capacidade de melhorar os aloenxertos potenciais, este não é um modelo de transplante que seria capaz de nos dizer resultados in vivo de diferentes perfusato e tecnologias. Além disso, embora o PolyhHb seja uma nova e empolgante tecnologia de perfusato, seu uso, eficácia e limitações potenciais terão que ser comprovados em experimentos adicionais de perfusão pré-clínica e clínica antes que a adoção generalizada dessa tecnologia possa ser considerada.

Conclusões
Aqui, demonstramos a aplicação de um perfusato de PolyhHb de última geração e o protocolo pelo qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. À medida que a tecnologia de perfusato avança, será vantajoso explorar as possibilidades de usar o PolyhHb como um substituto potencial para os perfusato tradicionais³⁰. As gerações anteriores de PolyhHb levaram a efeitos colaterais prejudiciais com base em sua composição; no entanto, melhorias na síntese criaram um polímero com menor probabilidade de extravasar, levar a edema e, portanto, causar lesão celular³⁰. Com o PolyhHb, é possível realizar a PPEV sem a necessidade de hemácias, atendendo à demanda metabólica dos aloenxertos pulmonares. Isso, sem dúvida, permitirá uma melhor função do aloenxerto ex vivo. No entanto, é necessária uma validação adicional da PolihHb nos ambientes pré-clínico e clínico. Esperamos que este protocolo forneça à comunidade de transplante de pulmão informações importantes na concepção e desenvolvimento de novas soluções de perfusão, bem como os protocolos adequados para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de insulina de 10 cc 29 G x 1/2" agulha	BD	309301
30 L Biorreator de lote de vidro	Ace Glass
30g Agulha	Agulhas Med	BD-305106
Baytril (enrofloxacina) Comprimidos antibacterianos	Elanco	NA
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2,2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	CFBA de lactato de Ringer modificado
tipo 672	de conexão 731747		aparelhos Harvard
D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Fórceps	Fine Science Tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Fórceps - Angular 45°	Ferramentas Fine Science	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Aquecedor	de Água Lauda	LCK 1879
Unidades leucoreduzidas humanas vencidas e embaladas	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Fórceps Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Ferramentas	Fine Science	11027-12
Glutaraldeído (C5H8O2 70% em peso)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparina 30.000 unidades por 30 ml	APP Pharmaceuticals
Albumina sérica humana (HSA)	OctaPharma Plasma		Conjunto de tubos IL2 aditivos de perfusato
para aparelho de perfusato	Harvard	733842
Sistema Básico de Perfusão Pulmonar IPL-2	Aparelho de Harvard Cetamina
500 mg por 5 ml	Cânula de átrio esquerdo da JHP Pharmaceuticals
	Aparelho de Harvard	730712
Liqui-Cel EXF Série G420 Contator de membrana	3M	G420	contator de gás
solução de glicose de dextrano com baixo teor de potássio (perfadex)	Solução XVIVO		lavando o pulmão
Tubo revestido de platina Masterflex (Tamanho: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetil-L-cisteína (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	de lactato de Ringer modificado
( 10L, 20L)	Vasos de filtração	Nalgene
Bomba peristáltica	Ismatec	ISM 827B
PES, 0,65 µ m Módulo TFF	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polietersulfona (PES), 0,2 µ m Módulo TFF	Repligen	N02-S20U-05-N
Polissulfona (PS), 500 kDa Módulo TFF	Repligen	N02-P500-05-N
Cloreto de Potássio (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	Para PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Cânula de Artéria Pulmonar	Aparelho Harvard	730710
Tubo de Cabeça de Bomba (Tamanho: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube  Pomada oftálmica	Dechra	NA
Tesoura	Fine Science ferramentas	14090-11
SCP Servo controlador para perfusão tipo 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator modelo 683	Harvard Apparatus	55-000
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	Para PBS e solução salina
Cianoborohidreto de sódio (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Ditionito de sódio (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	Para lactato
de Ringer modificadoLactato de sódio (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	Para lactato de Ringer modificado
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	Para PBS
Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4< / sub>)	Fisher Scientific	7558-80-7	Para PBS
SomnoSuite Sistema de Anestesia para Pequenos Animais	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Ratos Sprague-Dawley	Envigo
TAM-A módulo amplificador de transdutor tipo 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D amplificador de transdutor tipo 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
Módulo de controle de tempo TCM tipo 686	Aparelho Harvard	731750
Cânula traqueal	Aparelho Harvard	733557
Conjunto de tubos para câmara úmida	Aparelho Harvard	de Tubulação 73V83157
	Cole-Parmer	IS 0649
Pinça #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	Pinça INS500085-A
#5 aço inoxidável, curvada	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pinça #7 Titanium	Kent Scientific Corporation
Tygon E-3603 Tubulação 2,4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	linha de perfusato entrando no pulmão
Tygon E-3603 Tubulação 3,2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	linha de perfusato saindo do pulmão
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM módulo de controle do ventilador tipo 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Aditivo perfusato
xilazina 100 mg por 1 ml	Akorn