Avaliação da recuperação funcional da atividade do diafragma eupneico após hemissecção unilateral da medula espinhal cervical em ratos

Resumo

As complicações respiratórias são a principal causa de morte em indivíduos com lesão medular cervical (cSCI). Modelos animais de cSCI são essenciais para avaliações mecanicistas e estudos pré-clínicos. Aqui, apresentamos um método reprodutível para avaliar a recuperação funcional da atividade do músculo diafragma (DIAm) após hemissecção espinhal C₂ unilateral (C₂SH) em ratos.

Resumo

Após a cSCI, a ativação do DIAm pode ser afetada dependendo da extensão da lesão. O presente manuscrito descreve um modelo de hemissecção C₂ unilateral (C₂SH) de cSCI que interrompe a atividade eletromiográfica (EMG) do diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante a respiração em ratos. Para avaliar a recuperação do controle motor do diâmetro diamétrico, a extensão do déficit devido ao C₂SH deve primeiro ser claramente estabelecida. Ao verificar uma perda inicial completa de iDIAm EMG durante a respiração, a recuperação subsequente pode ser classificada como ausente ou presente, e a extensão da recuperação pode ser estimada usando a amplitude EMG. Além disso, medindo a ausência contínua de atividade EMG iDIAm durante a respiração após o período de choque espinhal agudo após C₂SH, o sucesso do C₂SH inicial pode ser validado. A medição da atividade EMG do diafragma contralateral (cDIAm) pode fornecer informações sobre os efeitos compensatórios do C₂SH, que também reflete a neuroplasticidade. Além disso, os registros de EMG DIAm de animais acordados podem fornecer informações fisiológicas vitais sobre o controle motor do DIAm após C₂SH. Este artigo descreve um método para um modelo C₂SH rigoroso, reprodutível e confiável de cSCI em ratos, que é uma excelente plataforma para estudar neuroplasticidade respiratória, atividade compensatória de cDIAm e estratégias terapêuticas e fármacos.

Introdução

Existem mais de 300.000 indivíduos com lesão medular (LM) nos Estados Unidos, aproximadamente metade dos quais tem lesões cervicais¹. Essas lesões resultam em perda significativa de bem-estar e colocam uma pressão financeira sobre os indivíduos, suas famílias e o sistema de saúde. Felizmente, a maioria dos LMEs está incompleta - fornecendo o potencial para o fortalecimento das vias poupadas¹. Essa neuroplasticidade pode permitir a recuperação de pelo menos algumas funções, incluindo a atividade do DIAm, que é importante para comportamentos ventilatórios e não ventilatórios. Assim, promover a neuroplasticidade é um caminho promissor de pesquisa para ajudar indivíduos com LM².

Modelos de LM em roedores têm o potencial de contribuir substancialmente para a descoberta de tratamentos para melhorar a saúde humana. Um dos modelos clássicos de LM utilizados para estudar a neuroplasticidade é a transecção unilateral (hemissecção) da medula espinhal em C₂ (C₂SH), que deixa o lado contralateral intacto 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. O efeito do C₂SH na produção frênica e a importância das vias contralaterais poupadas foram revelados pela primeira vez há mais de cem anos por Porter¹², cujo artigo seminal lançou as bases para estudos modernos de neuroplasticidade respiratória. O modelo C₂SH interrompe as entradas descendentes do grupo respiratório ventral rostral (rVRG) na medula, que contém neurônios pré-motores responsáveis por transmitir a saída da geração do ritmo respiratório¹⁴. Esses neurônios pré-motores rVRG também transmitem impulso neural excitatório para neurônios motores frênicos (Figura 1). Vários pesquisadores adotaram abordagens diferentes para o modelo C₂SH 10,11,15,16, o que pode explicar parcialmente parte da variabilidade na recuperação entre os estudos. Resumidamente, as abordagens variam em termos de poupar os funículos dorsais, realizar uma hemissecção completa ou realizar uma transecção parcial lateral que não interrompa completamente as entradas descendentes do rVRG ipsilateral. Geralmente, os modelos C₂SH são particularmente úteis para estudar a neuroplasticidade respiratória devido às taxas de recuperação espontânea da atividade eletromiográfica (EMG) eupneica iDIAm ao longo do tempo, que pode ser melhorada por vários fatores, incluindo sinalização neurotrófica 17,18,19,20,21. No entanto, uma perda inicial de função - definida como o silenciamento da atividade eupneica de EMG iDIAm - deve ser estabelecida antes que a recuperação possa ser claramente classificada. Essa validação da inatividade no momento da HAS C₂não é feita em vários estudos 3,4,6,7,11,22,23.

As avaliações histológicas da medula espinhal excisada fornecem apenas evidências de danos à localização apropriada das vias bulboespinhais excitatórias ipsilaterais que inervam os neurônios motores frênicos na medula espinhal, mas a histologia não substitui evidências fisiológicas (por exemplo, EMG DIAm). Além disso, as avaliações histológicas são realizadas ex vivo em pontos de tempo terminais (geralmente várias semanas a meses após a lesão) e não fornecem informações em "tempo real". Alguns pesquisadores observaram que a magnitude da lesão está relacionada à quantidade de déficit funcional ou à falta dele 5,24,25,26. É importante notar que a validade de tais alegações é provavelmente altamente dependente de como a "função" é classificada (ou seja, quais são as tarefas funcionais e como elas são quantificadas), e a variabilidade entre os estudos destaca a dificuldade de produzir lesões funcionalmente idênticas entre os animais. De fato, os pesquisadores enfatizaram que a relação entre a extensão da lesão e a função locomotora muscular dos membros (quantificada pelo escore de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)²⁴) não é^linear27,28. Em estudos anteriores, não encontramos relação entre a extensão da HAS C₂e a extensão da recuperação da atividade EMG eupneica iDIAm pós-lesão 10,29,30,31, embora outros pesquisadores tenham relatado uma relação entre a função ventilatória e a extensão da substância branca poupadora ⁵. Assim, no caso do modelo C₂SH, uma abordagem para validação funcional da inatividade do iDIAm no momento da cirurgia e, de preferência, no início do curso do tempo dos experimentos de lesão medular crônica é benéfica e necessária.

O presente artigo ressalta o uso do DIAm EMG para confirmação em tempo real da perda inicial do DIAm EMG durante a respiração após o C₂SH, bem como avaliações confirmatórias subsequentes aos 3 dias (Dia 3) após a lesão 18,21,31,32,33. Em trabalhos anteriores com o modelo C₂SH, laparotomias repetidas foram realizadas para registrar EMG DIAm 10,13,30,34. No entanto, trabalhos mais recentes utilizaram eletrodos EMG crônicos, que permitem o registro de EMG em ratos anestesiados e acordados. Além disso, os eletrodos crônicos reduzem o risco de pneumotórax e não requerem laparotomias repetidas, o que pode causar inibição do DIAm^35,36. Embora versões do modelo C₂SH tenham sido utilizadas por muitos pesquisadores, a confirmação do silenciamento da atividade do iDIAm não foi feita no momento da cirurgia 3,4,6,7,11,22,23. Sem essa confirmação de inatividade, é difícil saber qual parte da recuperação subsequente atribuir à neuroplasticidade das vias ipsilaterais versus contralaterais, que podem ter impactos diferenciais. Esta é uma consideração importante porque o impulso neural inspiratório do rVRG para os motoneurônios frênicos é principalmente ipsilateral, com uma perda de cerca de 50% das entradas glutamatérgicas excitatórias para os neurônios motores frênicos após C₂SH³³. No entanto, existem entradas excitatórias inspiratórias remanescentes do rVRG contralateral que decussam abaixo do local da lesão para inervar os neurônios motores frênicos ipsilaterais e podem ser fortalecidos por meio da neuroplasticidade para promover a recuperação funcional. Ao remover a entrada excitatória ipsilateral predominante para os neurônios motores frênicos, a atividade eupneica da EMG iDIAm é perdida (pelo menos sob anestesia), enquanto a atividade do cDIAm continua e é até aumentada. A perda da atividade EMG iDIAm durante a respiração é, portanto, uma medida de um sucesso de C₂SH (Figura 2).

Algum nível de atividade EMG iDIAm está presente em 1-4 dias após C₂SH em animais acordados^23,37. Além disso, em animais descerebrados, a atividade do iDIAm está presente dentro de minutos a horas após a hemissecção cervical superior e é suprimida pela anestesia³⁸. Além disso, o sucesso do C₂SH é validado pela confirmação da ausência de atividade EMG iDIAm durante a respiração (eupneia) em ratos anestesiados no dia 3 pós-lesão. Estudos de imagem confocal confirmaram a perda de entradas sinápticas glutamatérgicas nos neurônios motores frênicos durante esse estágio inicial da lesão³⁷. No dia 3 pós-lesão, se houver alguma atividade eupneica residual do iDIAm EMG, isso é interpretado como evidência de remoção incompleta do impulso inspiratório descendente ipsilateral do rVRG. O presente artigo está dividido em três seções: (1) registros crônicos de EMG DIAm, (2) C₂SH e (3) aquisição de dados EMG em animais acordados e anestesiados. Este protocolo descreve um_{modelo C2}SH rigoroso, reprodutível e confiável de cSCI em ratos, que é uma excelente plataforma para estudar a neuroplasticidade respiratória, a atividade compensatória do cDIAm e as estratégias terapêuticas e farmacêuticas.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic (Número do Protocolo: A00003105-17-R23). Os animais do presente estudo eram uma mistura de ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas com aproximadamente 3 meses de idade e pesando entre 200 g e 350 g. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de eletrodo

1. Preparando os eletrodos
   1. Certifique-se de que o equipamento mencionado esteja disponível: (1) Fio multifilamento de aço inoxidável, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura, 4) microscópio de dissecação, (5) régua, (6) pinça, (7) agulhas de 25 g, (8) 2 alicates (pelo menos um com zona de crimpagem).
   2. Os detalhes do processo de fabricação de eletrodos são mostrados na Figura 3. Repita este processo pelo menos duas vezes para eletrodos de registro diferencial emparelhados.
   3. Primeiro, meça e corte 18 cm do fio de aço inoxidável.
   4. Dê um nó básico a 4 cm de uma extremidade do fio, conforme mostrado na Figura 3; isso servirá como âncora quando o lado curto do fio for implantado e suturado no diâmetro.
   5. Usando um bisturi e um escopo de dissecção cirúrgica, retire cuidadosamente 2 mm de isolamento imediatamente adjacente ao nó no lado mais curto do fio. Tenha muito cuidado para não cortar fios do fio multifilamento.
      NOTA: Esta parte não isolada serve como superfície condutora do eletrodo. Geralmente, a qualidade do sinal começa a se degradar se três ou mais fios forem cortados inadvertidamente e, em caso afirmativo, o eletrodo é substituído.
   6. Em seguida, descasque ~5 mm da extremidade do lado curto do fio, que é então inserido no lúmen de uma agulha de 25 G para fazer uma ferramenta semelhante a um fio de sutura que será usada para implantar o eletrodo no DIAm.
      NOTA: Agulhas de calibre mais alto (por exemplo, até 28 G) também podem ser usadas dependendo da preferência pessoal. Devido ao diâmetro mais fino das agulhas de calibre mais alto, o risco de pneumotórax pode ser potencialmente reduzido. No entanto, também pode ser mais difícil inserir os fios multifilamentados no lúmen menor da agulha.
   7. Para conseguir isso, remova uma agulha de 25 G de sua embalagem e, usando os dois alicates, dobre cuidadosamente a agulha a ~ 1 cm da extremidade chanfrada afiada de um lado para o outro até que ela se quebre.
      NOTA: Este processo não deve ser apressado; caso contrário, as forças de cisalhamento podem fazer com que o lúmen da agulha se feche, exigindo que o processo seja repetido.
   8. Insira a extremidade descascada do fio no lúmen da agulha quebrada de 1 cm, certificando-se de que a agulha fique imediatamente adjacente à parte isolada restante do fio.
   9. Certificando-se de que não haja nenhuma parte não isolada entre a agulha e o lado mais curto restante do fio, prenda a agulha para prendê-la ao fio.
   10. Em seguida, use os dois alicates para dobrar cuidadosamente a agulha anexada para dar a ela uma curvatura semelhante à de uma agulha de sutura cirúrgica padrão.
   11. Por fim, retire ~5 mm da extremidade do lado comprido do fio (Figura 3). Depois que os eletrodos forem suturados no DIAm, o lado longo do fio será tunelado para acesso externo para permitir gravações de EMG DIAm.
   12. Repita o processo para fazer um segundo eletrodo para registros diferenciais.
2. Colocação do eletrodo EMG do diafragma
   1. Antes da cirurgia, esterilize ou autoclave todos os equipamentos cirúrgicos, incluindo (1) máquina de cortar pêlos de pequenos animais, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura cirúrgica, (4) pinça e (5) porta-microagulha.
   2. Adquira uma gaiola limpa e forneça comida, água, roupa de cama e enriquecimento ambiental. Reserve em uma almofada de aquecimento. Esta gaiola será usada para abrigar o animal após a cirurgia.
   3. Esterilize o campo cirúrgico com desinfetante apropriado e coloque equipamentos de proteção individual (jalecos, toucas, máscara e luvas cirúrgicas). Coloque os eletrodos previamente preparados em uma piscina de álcool isopropílico 70%.
   4. Coloque uma almofada de aquecimento na área cirúrgica para manter a temperatura corporal do rato durante a anestesia e a cirurgia. Cubra a almofada de aquecimento com uma toalha cirúrgica esterilizada.
   5. Pese o rato e calcule a dosagem anestésica apropriada com base nas diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
   6. Anestesiar o rato com uma injeção intramuscular de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou outro anestésico apropriado (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Injete buprenorfina de liberação prolongada (1 mg/kg) e carprofeno (5 mg/kg) no pré-operatório. Prossiga assim que o animal não responder mais ao beliscão do dedo do pé.
   7. Use uma tesoura para raspar o rato do processo xifóide até aproximadamente a metade dos membros posteriores. Além disso, raspe as costas do rato, onde os eletrodos serão externalizados além do alcance do animal (geralmente ao redor das omoplatas). Limpe o excesso de cabelo com um pedaço de gaze.
   8. Prepare a pele para a incisão limpando-a com gaze estéril embebida em gluconato de clorohexidina (4% em peso em volume).
   9. Coloque o animal em decúbito dorsal na almofada de aquecimento esterilizada. A partir do processo xifóide, use o bisturi e uma lâmina #11 limpa para fazer uma incisão rostrocaudal de 4-5 cm. Isso deve expor as camadas musculares abdominais subjacentes.
   10. Faça outra incisão (3-4 cm) ao longo da linha média nas camadas musculares para expor o conteúdo abdominal. Tome cuidado para não cortar os órgãos abdominais.
   11. Certifique-se de que a superfície abdominal (ou seja, inferior) do DIAm esteja visível, embora o lado direito do animal seja obscurecido pelo fígado.
   12. Usando um cabo de bisturi ou outro instrumento contundente, empurre para baixo o fígado e outros órgãos para expor o lado abdominal do DIAm.
   13. Prepare o eletrodo para uso removendo-o da poça de álcool isopropílico e lavando-o com solução salina estéril. Em seguida, usando um porta-microagulha, oriente um dos eletrodos previamente preparados perpendicularmente às fibras musculares na região médio-costal do DIAm. As fibras musculares se espalham radialmente pelo DIAm.
       NOTA: O diâmetro é fino (~2 mm) e não deve ser perfurado. Em vez disso, o objetivo é incorporar a parte não isolada do fio do eletrodo (Figura 3) dentro do diâmetro eletrônico.
   14. Use o microscópio cirúrgico para inserir cuidadosamente o fio de sutura do eletrodo (extremidade da agulha) no diâmetro eletrônico. Permita que a curvatura da agulha guie o eletrodo para dentro e depois para fora da superfície abdominal do diâmetro eletrônico, garantindo que toda a parte não isolada do fio seja totalmente incorporada ao músculo.
   15. Puxe cuidadosamente a agulha até que o nó no fio se ancoragem no diâmetro eletrônico. Certifique-se de que a parte não isolada (2 mm) do fio do eletrodo esteja completamente dentro do diâmetro eletrônico, com um nó no ponto onde a agulha entrou pela primeira vez no diâmetro eletrônico.
   16. Em seguida, corte a agulha do fio do eletrodo e descarte-a em um recipiente para objetos cortantes.
   17. Com duas pinças, dê um nó no ponto em que a agulha de sutura (3-0) saiu do diâmetro diamico. Para fazer isso, amarre um laço no lado curto do fio, deslize o laço para baixo até a superfície abdominal do diâmetro e aperte cuidadosamente o laço em um nó. O eletrodo (parte não isolada) deve agora ser ancorado em seu ponto de entrada e saída.
   18. Corte o excesso do lado mais curto do fio.
   19. Siga as etapas 1.2.14-1.2.18 para suturar outro eletrodo no mesmo lado do diâmetro diamétrico, ~ 3 mm de distância do primeiro.
   20. Execute o implante do par de eletrodos no hemidiafragma oposto da mesma maneira.
   21. Em seguida, certifique-se de que o lado mais longo dos fios do eletrodo esteja todo fora da cavidade abdominal e comece a suturar (3-0) as camadas musculares para fechar o abdômen. Para cada par de eletrodos, faça um laço e ancore-o.
       NOTA: Certifique-se de que 2-3 cm de fio sejam deixados dentro da cavidade abdominal para permitir que o rato se estique sem causar tensão no diâmetro.
   22. Limpe o excesso de sangue com solução salina e depois suture (3-0) a camada muscular em um padrão contínuo para fechar o peritônio.
   23. Encapsule um cateter de 16 G da pele dorsal medial do rato até a pele abdominal aberta e puxe um par de fios de eletrodo até a parte de trás do rato.
   24. Repita o processo com um segundo cateter do outro lado e puxe o segundo par de fios do eletrodo.
   25. Suturar a pele abdominal com uma sutura 3-0 em um padrão de sutura interrompido.
   26. Em seguida, para cada par, amarre os fios do eletrodo em um nó e suture-os no lugar.
   27. Forneça ao animal uma injeção subcutânea de solução salina (~ 1 ml por 50 g de massa animal). Coloque o animal em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento para se recuperar.
       NOTA: A laparotomia pode causar inibição da atividade do DIAm^35,36. Aguarde pelo menos 72 h antes da análise quantitativa de qualquer medição EMG.

2. Hemissecção da coluna cervical

1. Prepare a área cirúrgica estéril como antes.
2. Antes da cirurgia, autoclave ou esterilize todo o equipamento cirúrgico. Equipamento necessário: (1) máquina de cortar pêlos de pequenos animais, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura cirúrgica, (4) pinça, (5) rongeurs, (6) afastadores, (7) faca de dissecação angular.
3. Aproximadamente 72 h após o implante do eletrodo EMG DIAm, pesar o rato e calcular a dose anestésica apropriada com base nas diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
4. Antes de anestesiar o rato, coloque-o em uma gaiola estilo Bowman e registre o EMG DIAm bilateral conforme descrito na etapa 3.2.
5. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou outro anestésico apropriado de acordo com o protocolo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais local. No pré-operatório, injete buprenorfina de liberação prolongada (1 mg / kg) por via subcutânea e carprofeno (5 mg / kg) por via intraperitoneal.
6. Prossiga assim que o animal não responder mais ao beliscão do dedo do pé. Verifique a profundidade da anestesia com uma pinça aproximadamente a cada 15 minutos.
7. Antes de iniciar a cirurgia, coloque o rato em decúbito ventral e registre a EMG no rato anestesiado, conforme descrito na etapa 3.3.
   NOTA: Certifique-se de que todas as gravações sejam realizadas com o rato na mesma posição.
8. Raspe o cabelo do pescoço até o nível da orelha e até as escápulas e remova-o com gaze úmida.
9. Limpe a pele com gluconato de clorohexidina (4% em peso em volume) e cubra o animal com capas cirúrgicas estéreis (exceto no dorso superior).
10. Usando um bisturi, faça uma incisão rostro-caudal de 4 cm. Retraia a pele e corte o músculo acromiotrapézio. Em seguida, disseque o músculo romboide para expor os músculos espinhais.
    NOTA: O acromiotrapézio é o músculo trapézio médio e suas fibras musculares correm aproximadamente paralelas à coluna vertebral. O músculo romboide é exposto no plano abaixo do acromiotrapézio e suas fibras musculares correm diagonalmente.
11. Retraia os músculos espinhais de C₁ para C₃.
    NOTA: Os músculos espinhais correm imediatamente adjacentes à coluna.
12. Execute cuidadosamente uma laminectomia em C₂ usando um rongeur enquanto olha através de um microscópio cirúrgico para garantir que nenhuma artéria ou nervo importante seja danificado.
13. Corte e retraia a dura-máter em C_2.
14. Conecte os fios do eletrodo expostos das costas do rato ao amplificador durante a realização da hemissecção espinhal. Consulte a etapa 3 para obter mais detalhes.
15. Enquanto monitora o EMG DIAm, insira a faca de dissecação angular logo abaixo do ponto onde a raiz dorsal entra na medula espinhal e corte até o ponto médio da superfície ventral da maneira mostrada na Figura 2A.
    NOTA: Se estiver usando uma almofada térmica eletrônica, pode ser necessário desligá-la durante o monitoramento do EMG para evitar ruído.
16. Dentro de segundos após este seccionamento, certifique-se de que a atividade EMG DIAm eupneica ipsilateral à lesão cesse e um aumento compensatório na atividade EMG cDIAm seja evidente (Figura 2C).
17. Se a atividade eupneica de EMG iDIAm persistir, faça outro corte com a faca de dissecação, conforme destacado na Figura 2C. No entanto, não corte a linha média; O corte para o lado contralateral provavelmente levará à morte do animal.
18. Suturar os músculos e depois a pele com suturas estéreis (3-0).
19. Para manter a hidratação, injete por via subcutânea 1 mL de soro fisiológico por 50 g de massa animal e coloque o animal em uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento para recuperação. Monitore o animal enquanto ele se recupera da cirurgia.
20. Aproximadamente 72 h depois (Dia 3 Pós-C₂SH), registre a atividade EMG em ratos acordados de acordo com a etapa 3.2 do protocolo. Tenha cuidado para não danificar os pontos no dorso do rato.
21. Em seguida, anestesiar o rato mais uma vez (seguindo protocolos aprovados institucionalmente), usando uma dose mais leve de anestésico do que seria necessária para um plano cirúrgico (entre 1/3 a 1/2 de uma dose normal). Doses adicionais podem ser administradas, desde que os ratos apresentem um reflexo da córnea intacto e respondam ao beliscão do dedo do pé.
22. Monitore a atividade EMG DIAm seguindo a etapa 3 do protocolo.
    NOTA: Coloque o rato na mesma posição usada para a avaliação inicial da atividade do iDIAm EMG.
23. Se a atividade eupneica de EMG iDIAm (ou seja, atividade em fase com atividade inspiratória de cDIAm EMG) estiver ausente no Dia 3, conclua que o C₂SH inicial foi bem-sucedido e inclua o mesmo animal para análises adicionais.

3. Aquisição e análise de dados

1. Configurações gerais e extração de dados
   1. Defina os filtros passa-banda do préamplifier para 100 Hz (passa-alta) e 1000 Hz (passa-baixa).
      NOTA: Essas configurações de filtro eliminam artefatos de movimento e reduzem significativamente o ruído de 60 Hz e a contaminação por ECG (que tem potência de pico em ~ 75 Hz), mantendo a grande maioria do conteúdo de frequência do sinal EMG de diâmetro intramuscular. Com base na teoria de Nyquist, digitalize com uma frequência de amostragem de 2000 Hz para evitar aliasing e permitir uma resolução adequada para observar a atividade da unidade motora no EMG composto. Se estiver realizando análises especializadas de conteúdo de frequência da faixa de frequência abaixo de 100 Hz, é importante definir o préampconfigurações de filtro do amplificador para garantir que as frequências de interesse não sejam filtradas.
   2. Monitore dois canais (EMG hemidiafragma esquerdo e direito) no software de visualização em um computador e salve os dados em um formato apropriado para análises posteriores.
   3. Colete pelo menos 1-2 minutos de gravações eupneicas para ter dados suficientes para análises.
   4. Certifique-se de que os dados sejam coletados em três ou mais momentos:
      1. Antes de C₂SH, estabeleça um registro eupneico basal em condições acordadas e anestesiadas.
      2. Durante a cirurgia C₂SH para estabelecer o silenciamento da atividade eupneica de iDIAm EMG em condições anestesiadas.
      3. No dia 3 pós-C₂SH para confirmar que a ausência de atividade eupneica iDIAm EMG persiste e estabelecer um ponto inicial da extensão do déficit em animais acordados que não é tão influenciado pelo choque espinhal ^2,39 ou administração de depressores respiratórios como a buprenorfina.
   5. Analise as gravações EMG DIAm usando qualquer software que permita que os cálculos sejam realizados em sinais digitalizados (por exemplo, Matlab, Python, R). O processo básico é o seguinte:
      1. Carregue os arquivos EMG brutos. Dependendo das configurações de filtragem, pode ser necessário levar em conta um deslocamento CC no sinal.
         NOTA: Uma solução fácil é subtrair a média do sinal EMG bruto de si mesmo.
      2. Calcule a raiz quadrada média do sinal EMG com uma janela móvel de 50 ms. Isso pode ser feito movendo uma janela de cálculo de 50 ms para frente em um ponto de amostragem de cada vez até que o final do sinal seja alcançado.
         NOTA: As análises de eventos EMG DIAm individuais fornecem o maior poder estatístico e permitem o agrupamento de atividade eupneica e não eupneica. Assim, a detecção do início e do deslocamento das respirações individuais na EMG do DIAm é fundamental, conforme destacado em um relatório anterior⁴⁰.
   6. Realizar a filtragem da atividade eupneica visualizando os histogramas da frequência respiratória instantânea e da duração do burst, conforme mostrado em relatório anterior⁴¹.
2. Gravações acordadas.
   1. Realize gravações acordadas colocando ratos em uma gaiola de roedores estilo Bowman. Uma gaiola cilíndrica estilo Bowman pode acomodar ratos adultos de até 750 g.
   2. Desaparafuse as hastes de metal em um lado da gaiola estilo Bowman e gentilmente convença o rato a entrar. Aparafuse as hastes de metal de volta, prendendo o rato na gaiola cilíndrica.
      NOTA: Aclimate os ratos à gaiola por pelo menos 30 minutos antes de prosseguir com a gravação. Se possível, é melhor aclimatar os ratos à gaiola estilo Bowman por vários dias antes de qualquer medição. É uma boa prática fornecer guloseimas enquanto os ratos estão na gaiola durante esta fase de aclimatação.
   3. Para minimizar os estímulos visuais externos, use uma toalha de papel ou objeto semelhante para fazer uma barraca ao redor da frente da gaiola onde está a cabeça do rato. Além disso, minimize ruídos altos e garanta o conforto físico do rato em todos os pontos.
      NOTA: Sinais óbvios de desconforto incluem inquietação, respiração rápida e luta contra a gaiola. Se algum desses sinais for observado, pode ser necessário devolver o rato à gaiola de casa e tentar gravar quando o rato estiver mais calmo.
   4. Para ratos menores (<300 g), insira materiais de enchimento (por exemplo, toalha de papel, bolas de algodão) em espaços extras na gaiola para desencorajar o rato de girar 180 graus.
   5. Depois que o rato estiver aclimatado, conecte cuidadosamente os fios que saem do dorso do rato a um pré-amplificador, que alimenta os sinais analógicos em um conversor analógico-digital, e siga os procedimentos descritos na etapa 3.1.
3. Gravações anestesiadas
   1. Coloque os ratos na mesma posição todas as vezes, de preferência propensos a imitar mais de perto a postura do rato acordado.
   2. Conecte os fios que saem do dorso do rato a um pré-amplificador, que alimenta os sinais analógicos em um conversor analógico-digital, e siga os procedimentos descritos na etapa 3.1.
4. Recuperação de animais
   1. Coloque os ratos dentro de uma gaiola vazia e limpa, sem cama para recuperação.
   2. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento.
   3. Monitore o rato em intervalos regulares (<15 min) durante as primeiras 3 h ou até que o rato comece a se mover. Monitore em intervalos menos regulares (30 min) até que o animal esteja acordado novamente.
   4. Depois que o rato estiver ambulatorial, coloque-o em uma gaiola limpa com cama, acesso a comida e água e enriquecimento ambiental.
   5. Continue a monitorar o rato pelo menos uma vez ao dia durante todo o período do experimento. Preste atenção especial às mudanças no peso/capacidade de alimentação, bem como à integridade dos locais de incisão e suturas.

Resultados

A abordagem apresentada neste artigo minimiza a variabilidade interoperadora, estabelecendo critérios claros para avaliar a EMG DIAm em um modelo de rato de C₂SH. Primeiro, deve-se observar a cessação da atividade EMG eupneica do iDIAm imediatamente após C₂SH, conforme mostrado na Figura 2. Caso contrário, uma transecção secundária pode ser realizada até que a atividade eupneica do iDIAm desapareça. Em segundo lugar, no dia 3 pós-C₂SH, a ausência contínua de EMG iDIAm eupneica deve ser verificada enquanto os animais são anestesiados. A Figura 4A mostra um exemplo de um C₂SH bem-sucedido, conforme determinado pela ausência contínua de atividade eupneica de EMG iDIAm sob anestesia no dia 3 após a lesão. A Figura 4B mostra a atividade EMG DIAm no mesmo animal em condições acordadas não anestesiadas, destacando a redução - mas não a ausência - da atividade iDIAm em comparação com a linha de base pré-lesão. Notavelmente, a atividade EMG cDIAm é aumentada em condições acordadas e anestesiadas. Os registros anestesiados no dia 3 fornecem validação de que o C₂SH inicial foi bem-sucedido, mas análises quantitativas devem ser realizadas em animais acordados. Em animais acordados, a atividade EMG DIAm no Dia 3 pós-C₂SH representa o ponto de partida para a recuperação. A Figura 4B mostra que a atividade do iDIAm EMG é reduzida, mas não ausente, no Dia 3 em ratos acordados.

Em alguns casos, C₂SH não é acompanhado pela cessação total da atividade eupneica de EMG iDIAm (Figura 5A). Um C₂HS inadequado ocorre em menos de 5% de todos os casos usando a abordagem descrita no presente manuscrito; no entanto, é essencial que uma avaliação da atividade EMG DIAm no Dia 3 pós-C₂SH seja realizada em cada rato para validar o sucesso do C₂SH. A Figura 5A mostra um exemplo de atividade EMG DIAm de um rato no Dia 3 pós-lesão, no qual o C₂SH foi inadequado na eliminação da atividade EMG iDIAm eupneica no Dia 3. É importante ressaltar que a validação da eficácia do C₂SH foi realizada enquanto o animal estava anestesiado. A atividade EMG eupneica contínua sugere que pelo menos uma parte da via bulboespinhal ipsilateral descendente foi poupada, o que pode complicar a interpretação dos resultados. A Figura 5B mostra que a atividade EMG iDIAm é reduzida, mas não ausente, no Dia 3 em ratos acordados. No entanto, a preservação de insumos descendentes ipsilaterais pode diminuir o déficit inicial.

Figura 1: Estrutura conceitual. O grupo respiratório ventral rostral (rVRG) envia entradas descendentes para os neurônios motores frênicos na medula espinhal cervical (C_{3-C 5}). A maioria desses axônios descendentes inerva o pool de neurônios motores frênicos ipsilaterais, mas uma pequena fração cruza a linha média para ativar o pool de neurônios motores contralaterais. Imediatamente após um C₂SH, as entradas descendentes do rVRG para o pool de neurônios motores frênicos ipsilaterais são interrompidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Atividade representativa de C₂SH e EMG DIAm. (A) A visão transversal da medula espinhal do rato e do local tran (sombreado em vermelho) com estruturas importantes marcadas é mostrada. A lesão espinhal é realizada inserindo uma faca de dissecação logo abaixo do ponto onde a raiz dorsal entra e cortando aproximadamente a linha média (área vermelha translúcida sombreada). Observe o corte dos principais tratos motores nos funículos lateral e ventral, mas a preservação dos funículos dorsais. (B) A visão longitudinal, representando o silenciamento da atividade do neurônio motor ipsilateral, complementa os traços brutos de EMG usados para confirmação em tempo real de uma lesão satisfatória (C). À medida que a medula espinhal é lesionada, a atividade eupneica da EMG iDIAm cessa, sugerindo que as entradas ipsilaterais para os neurônios motores frênicos foram cortadas; enquanto isso, o cDIAm EMG aumenta imediatamente sua atividade, conforme mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fabricação de eletrodos. O processo de fabricação de eletrodos EMG DIAm é mostrado. O processo básico envolveu medir e cortar um comprimento apropriado de fio (Etapa 1), amarrar um nó de ancoragem e remover o isolamento para expor o eletrodo (Etapa 2), prender uma agulha de calibre 25 ao fio (Etapas 3 e 4), dobrar a agulha para dar-lhe uma curvatura semelhante a uma agulha de sutura cirúrgica (Etapa 5), e retirar o isolamento para expor uma parte do fio que será conectado ao amplificador para gravação de EMG (Etapa 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Hemissecção espinhal bem-sucedida. (A) A atividade EMG DIAm é mostrada em um rato anestesiado antes de C₂SH e no dia 3 após a lesão. Não há evidência de atividade eupneica de iDIAm EMG neste rato no dia 3 pós-lesão, indicando que o C₂SH inicial foi bem-sucedido. Observe o aumento compensatório na atividade EMG cDIAm e aumento na frequência respiratória em comparação com a condição pré-lesão. (B) A atividade EMG DIAm é mostrada no mesmo rato em condições de vigília não anestesiada no Dia 3 pós-C₂SH. Há evidências claras de atividade EMG iDIAm reduzida, embora não completamente silenciada. Observe o aumento compensatório na atividade EMG cDIAm e aumento na frequência respiratória em comparação com a condição pré-lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Hemissecção espinhal malsucedida. (A) A atividade EMG DIAm é mostrada em um rato anestesiado antes de C₂SH e no dia 3 após a lesão. Neste rato, a atividade eupneica de EMG iDIAm persistiu no dia 3 após a lesão, indicando que o C₂SH inicial era inadequado. Consequentemente, este rato foi excluído de análises adicionais de recuperação funcional. Observe o aumento compensatório na atividade EMG cDIAm apesar de um C₂SH malsucedido, mas aumento mínimo na frequência respiratória. (B) A atividade EMG de DIAm é mostrada na mesma corrida em condições de vigília não anestesiada no Dia 3 pós-C₂SH. Há evidências de redução da EMG iDIAm, aumento da atividade da EMG cDIAm e um ligeiro aumento na frequência respiratória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

C₂ hemissecção da coluna vertebral
O procedimento descrito neste artigo enfatiza avaliações da atividade EMG DIAm que servem como validação de uma lesão espinhal C₂ que atravessa os funículos lateral e ventral enquanto poupa os funículos dorsais (Figura 2A). A abordagem cirúrgica proposta tem dois grandes benefícios. Primeiro, poupa os funículos dorsais, que preservam a função ambulatorial em ratos, enquanto ainda corta as entradas ipsilaterais para os neurônios motores frênicos. Em segundo lugar, monitorando a EMG DIAm, podemos validar a eficácia da lesão C₂ na eliminação da atividade eupneica da EMG iDIAm inicialmente durante a cirurgia enquanto os animais são anestesiados. No dia 3 pós-lesão, enquanto os animais são anestesiados, verificamos se há de fato um silenciamento contínuo da atividade eupneica do iDIAm EMG. Foi demonstrado anteriormente que as entradas excitatórias de rVRG nos neurônios motores frênicos e a expressão do receptor NMDA nos neurônios motores frênicos são reduzidas em 3 a 7 dias após a lesão e que tanto a entrada sináptica glutamatérgica quanto a expressão do receptor NMDA aumentam ao longo do tempo após 7 dias após a lesão^33,42. Esses dados, combinados com a confirmação histológica da lesão C₂ ^{10 , 13 , 29 , 30 , 33} , sugerem que a inatividade contínua sob anestesia no dia 3 após a lesão fornece informações sobre a eficácia da HAS C₂inicial. Em estudos realizados em vários anos, taxas relativamente estáveis de recuperação espontânea sob anestesia entre 30% e 40% foram observadas em 14 dias após a HAS C₂ 18,19,20,29,31,43, sugerindo que este método de verificação do sucesso do C₂SH é reprodutível e confiável.

O procedimento C₂SH envolve várias etapas críticas. É importante ressaltar que o modelo C₂SH proposto aqui poupa os funículos dorsais e, portanto, não leva a déficits motores dos membros. Nos modelos de hemissecção espinhal C₂ completa envolvendo os funículos dorsais, os déficits motores dos membros são consideravelmente maiores 3,4,5,6,7,37. Assim, um benefício adicional do modelo C₂SH (Figura 2A) é que, além do silenciamento da atividade eupneica da EMG iDIAm em ratos com lesão C₂ anestesiados, os ratos são funcionalmente semelhantes aos ratos laminectomy simulados em termos de deambulação e outras funções. Assim, eles geralmente são capazes de se alimentar e se limpar, o que reduz a carga de cuidados e ainda permite estudos de controle neuromotor DIAm e neuroplasticidade respiratória. Para garantir que o modelo C₂ seja implementado adequadamente, deve-se tomar muito cuidado para evitar lesões excessivas. Inserir a faca de dissecação logo abaixo de onde a raiz dorsal entra na medula espinhal e cortar a porção ventral com moderação são regras úteis. O objetivo é garantir que a atividade eupneica de EMG iDIAm cesse; Isso pode ser feito com vários pequenos cortes, se necessário. De fato, na semana seguinte ao C₂SH, ficará claro se houve danos excessivos à medula espinhal se os animais tiverem dificuldade em deambular e alcançar pellets de comida.

Colocação de eletrodos e gravações EMG
Os eletrodos EMG DIAm crônicos têm vários benefícios claros em relação a outras abordagens. Os eletrodos podem (e devem) ser implantados vários dias antes do procedimento C₂SH, permitindo tempo suficiente para a recuperação e não exigindo uma laparotomia e um C₂SH durante a mesma sessão cirúrgica. Isso é importante porque é bem aceito que a laparotomia causa inibição do DIAm^35,36. Com o implante de eletrodos de DIAm crônico, também não há necessidade de laparotomias repetidas, que foram realizadas em trabalhos anteriores^10,13; há também um risco reduzido de pneumotórax, pois os eletrodos não estão sendo inseridos no DIAm durante cada sessão. No entanto, vários eventos adversos potencialmente graves podem ocorrer como resultado da colocação do eletrodo. Embora o risco de pneumotórax seja reduzido evitando inserções repetidas de eletrodos, ele não é completamente anulado e, de fato, o pneumotórax pode ocorrer, causando morte imediata ou problemas prolongados. Para reduzir esse risco, é uma prática recomendada garantir que a agulha que está sendo enfiada no diâmetro dialógico não perfure a superfície superior do diâmetro. Além disso, evite usar pinças afiadas que possam causar danos ao diâmetro ao manipular os fios do eletrodo. Ocasionalmente, os ratos podem mastigar os pontos no abdômen, potencialmente estripando-se se deixados por conta própria. Os ratos devem ser observados em intervalos regulares após a colocação do eletrodo para detectar esses tipos de comportamentos precocemente. Em alguns casos, pode ser possível anestesiar os ratos para reparar danos aos pontos. No entanto, é melhor que esse comportamento seja mitigado, proporcionando alívio adequado da dor durante e após a cirurgia e garantindo que o campo estéril não seja quebrado durante a cirurgia. Em casos extremos, pode ser necessário sacrificar ratos que removem repetidamente seus pontos.

O registro e a análise dos sinais EMG não são o foco principal do presente estudo e são altamente dependentes do equipamento e software específicos disponíveis em cada laboratório. Embora as informações sobre o equipamento sejam fornecidas na Tabela de Materiais, existe uma ampla variedade de opções de hardware para amplificar e registrar a atividade EMG, e as especificidades dependerão de uma mistura de recursos, disponibilidade e acessibilidade para cada laboratório. No entanto, existem alguns princípios gerais de gravação de EMG que são importantes mencionar. Um problema potencial é o movimento ou destruição de eletrodos implantados, o que pode limitar as avaliações quantitativas da EMG DIAm. Se os eletrodos se soltaram do DIAm, ou se os ratos conseguiram consumir ou danificar os fios externalizados, pode não ser possível registrar a atividade EMG ou o nível de ruído pode mudar. Isso pode ser evitado confirmando que os eletrodos estão firmemente presos no DIAm, e um sinal com uma alta relação sinal-ruído (SNR) pode ser registrado a partir deles durante a cirurgia de colocação do eletrodo DIAm. Além disso, externalizar os fios do eletrodo no alto do dorso e cortar o excesso de fio de forma que os ratos não consigam acessar os fios do eletrodo são propícios ao sucesso dos eletrodos crônicos. Como alternativa aos fios externalizados, as tampas de cabeça³⁷ ou telemetria^44,45 podem ser opções razoáveis. Ambas as abordagens podem obter gravações em animais acordados com mais facilidade, mas podem ser um pouco mais difíceis de implementar do que simplesmente externalizar os fios multifilamentos. Todas as fontes eletrônicas próximas podem ser fontes de ruído. É fundamental que todos os equipamentos sejam aterrados adequadamente, cabos blindados sejam usados e os ratos não sejam tocados enquanto as gravações ativas estão ocorrendo. Além de desligar as almofadas térmicas eletrônicas durante a gravação, luzes, equipamentos próximos, mesas cirúrgicas operadas eletricamente e outros dispositivos podem precisar ser temporariamente desligados para obter gravações de baixo ruído. Para minimizar as influências ambientais, os equipamentos eletrônicos que não precisam estar ligados para as gravações EMG DIAm devem ser desligados. Quando possível, as gravações devem ser feitas em uma sala com blindagem elétrica. Com o tempo, cicatrizes teciduais e fibrose ao redor dos eletrodos EMG DIAm podem diminuir a condutividade do eletrodo, reduzindo a SNR. Além disso, mesmo pequenas mudanças na postura podem ter grandes impactos no sinal EMG DIAm; assim, para minimizar esses problemas potencialmente complicadores, o EMG DIAm deve ser registrado com os ratos na mesma postura durante as sessões de gravação.

Outra consideração importante são as configurações de filtragem e amostragem. O tipo de eletrodo (ou seja, intramuscular vs. esofágico/superfície) é extremamente relevante quando se trata de determinar o conteúdo de frequência e, consequentemente, filtros passa-alta e passa-baixa apropriados para um sinal. Um esforço considerável foi despendido para determinar os filtros ideais para EMG⁴⁶ de diâmetro superficial / esofágico. Estudos semelhantes na EMG de ratos não foram realizados, mas anteriormente, mostramos que, efetivamente, a totalidade do conteúdo de frequência da EMG de DIAm registrada usando eletrodos intramusculares crônicos em ratos estava abaixo de 1000 Hz, com a frequência do centróide em torno de 300 Hz⁴⁷. Em uma comparação direta das frequências média e mediana do espectro de potência da EMG do bíceps braquial em humanos obtidos por meio de eletrodos de superfície e intramusculares, Christensen et ^al.48 descobriram que as frequências média e mediana eram aproximadamente 3 vezes maiores para eletrodos intramusculares em comparação com eletrodos de superfície. No DIAm, os pesquisadores relataram frequências centróide em torno de 100 Hz ao usar eletrodos esofágicos bipolares 49,50,51,52,53,54, o que sugeriria que os 300 Hz, que foram previamente determinados para eletrodos intramusculares, correspondem aproximadamente à mesma tendência mostrada por Christensen et ^al.48. Apesar disso, vários estudos publicados utilizando EMG DIAm intramuscular em modelos de roedores colocaram seus filtros passa-alta em 300 Hz 4,37,55,56 e alguns chegaram a 500 Hz ⁵⁷. É incontroverso que tal abordagem de filtragem reduziria substancialmente a amplitude do sinal EMG DIAm em pelo menos metade. Propomos uma abordagem muito menos destrutiva: (1) filtragem passa-alta a 100 Hz porque a maior parte do espectro de potência do ECG está abaixo de 100 Hz, enquanto comparativamente pouco do espectro de potência do EMG DIAm está abaixo de 100 Hz^51,52 e (2) subsequentemente removendo o ECG restante por correspondência de forma de onda⁵⁸. Assim, os filtros apropriados para EMG DIAm para a maioria dos estudos podem ser ajustados entre 100 Hz e 1000 Hz, com uma frequência de amostragem de pelo menos 2000 Hz para capturar todas as características relevantes nos dados. Análises detalhadas da EMG DIAm podem então ser realizadas usando as técnicas publicadas em relatórios anteriores 40,41,47,58.

Animais acordados e anestesiados
Notavelmente, alguns estudos destacaram que os modelos C₂SH de cSCI não levam à inatividade completa do iDIAm EMG eupneico^23,37. Em certo sentido, isso não é surpreendente, pois foi observado anteriormente que a atividade de "avanço" ocorre durante comportamentos que necessitam de maior impulso (por exemplo, respirações profundas e resposta à oclusão das vias aéreas) ^{4 , 7 , 29 , 42} . Esses dados sugerem que provavelmente não é apropriado pensar no modelo C₂SH como um verdadeiro modelo de inatividade contínua. De fato, parece que o impulso é suficientemente alto em animais acordados para que a atividade eupneica de EMG iDIAm esteja presente tão cedo quanto quatro dias após um C₂SH³⁷ completo, embora não esteja presente consistentemente em um dia após a lesão²³. Em todos os casos, a anestesia suprime a atividade da DIAm após a hemissecção da coluna cervical superior, conforme destacado em relatórios anteriores^23,38 e mostrado na Figura 4 e na Figura 5. Não há dados publicados disponíveis sobre a atividade EMG DIAm em ratos acordados com o C₂SH com funículos dorsais poupados propostos no presente manuscrito (Figura 2A). Trabalhos futuros devem fornecer uma caracterização detalhada do curso temporal da atividade EMG DIAm em animais acordados com este modelo C₂SH. Dito isso, ainda é prudente realizar a validação da ausência contínua de inatividade eupneica do iDIAm no dia 3 pós-lesão sob anestesia para imitar as condições experimentais durante as quais a medula espinhal foi inicialmente lesionada / seccionada. Quando a atividade eupneica de iDIAm EMG em animais acordados no Dia 3 pós-lesão pode estar presente, observa-se que mesmo meias doses de anestésicos geralmente levam a uma cessação completa da atividade eupneica de iDIAm EMG. Com essas doses, os animais ficam calmos e sedados. Além de verificar o silenciamento da atividade eupneica da EMG iDIAm durante C₂SH e no Dia 3 pós-lesão, recomenda-se que a medula espinhal seja extraída após o experimento terminal para confirmação histológica do local e extensão do C₂SH ^9,29,59. A confirmação histológica da lesão - quando combinada com a confirmação funcional da atividade eupneica silenciada da EMG iDIAm - fornece fortes evidências de um sucesso de C₂SH.

O presente artigo apresenta um C₂SH de cSCI em ratos que leva ao silenciamento imediato da atividade eupneica de EMG iDIAm com silenciamento contínuo sob anestesia no dia 3 pós-lesão. Devido à preservação do funículo dorsal no modelo C₂SH proposto no presente manuscrito, a função motora do membro é preservada, evitando efeitos fora do alvo. Isso permite que estudos longitudinais dos efeitos de uma lesão cervical alta no controle neuromotor do DIAm sejam realizados em ratos que são relativamente saudáveis, adicionando assim uma carga mínima de cuidado para os investigadores. A validação da inatividade sob anestesia no dia 3 pós-lesão garante que uma linha de base clara seja estabelecida para avaliar a extensão subsequente da recuperação da EMG eupneica iDIAm. Essa abordagem fornece um método rigoroso, confiável e reprodutível para realizar um C₂SH em ratos. Este modelo tem o potencial de melhorar muito a compreensão do curso temporal da neuroplasticidade respiratória e sua interseção com possíveis estratégias terapêuticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha de 25 G Cardinal	Health	1188825100	Covidien Monoject Agulhas Padrão Hipdérmicas: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Trançado Sutura	Ethicon	J774D	3-0
Pinça Adson-Brown	Ferramentas de Ciência Fina	11627-12 Forma da	Ponta: Reta, Pontas: Dentes de Tubarão, Largura da Ponta: 1.4mm, Dimensões da Ponta: 2 x 1.4 m, Liga / Material: Aço Inoxidável, Comprimento: Gaiola estilo Bowman de 12 cm
	Braintree Scientific	POR-530 Faixa de	peso: 250 até 750 g; Comprimento máximo: 9" (228 mm); A unidade básica é construída em acrílico com joias de 5" (123 mm).
Porta-agulhas Castroviejo	Fine Science Tools	12565-14	Forma da ponta: Reta, Largura da ponta: 1,5 mm, Comprimento de fixação: 10 mm, Trava: Sim, Tesoura: Não, Liga / Material: Aço inoxidável, Comprimento: 14 cm, Serrilhado: Sim, Característica: Chumbo de clipe de carboneto de tungstênio
1m TP Blindado	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	Fios blindados para
software de aquisição de dados	LabChart	LabChart 7.3.8	Software de gravação, visualização e análise de dados para gravações multicanal e avaliações em tempo real
Software de análise de dados - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	Versão 23.2	Linguagem de programação de uso geral para análise post hoc
Faca de Dissecação	Ferramentas de Ciência Fina	10056-12	Borda de corte: 4 mm, Espessura: 0,5 mm, Liga / Material: Aço inoxidável, Comprimento: 12,5 cm, Forma da lâmina: Angular 30°
Dumont #3 Fórceps	Fine Science Tools	11293-00	Estilo: #3, Forma da ponta: Reta, Dicas: Padrão, Dimensões da ponta: 0,17 x 0,1 mm, Comprimento: 12 cm, Liga / Material: Amplificador
eletromiograma	Biopac Systems, Inc	EMG100C	Amplificador EMG
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	Forma da ponta: Curva, Tamanho do copo: 2,5 mm, Liga / Material: Aço inoxidável, Comprimento: 13cm, Ação conjunta: Único
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	Liga / Material: Aço Inoxidável, Comprimento: 14cm, Ação Conjunta: Único, Tamanho do Copo: 1mm, Forma da Ponta:
Módulo de Fonte de Alimentação Isolado	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Opera módulos amplificadores da série 100 independente do Sistema de Aquisição de Dados da série MP da Biopac Systems, Inc.
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	13019-14	Dicas: Serrilhada, Largura da Ponta: 1,5 mm, Comprimento de Fixação: 22 mm, Liga / Material: Aço Inoxidável, Comprimento: 14 cm, Forma da Ponta:
Cureta de Faca	Curva V. Mueller	VM101-4414	Ponta: Afiada, Diâmetro da Ponta: 2 mm
Tesoura de Micro Dissecação Biomedical	Research Instruments, Inc.	11-2420	Comprimento: 4", Ângulo: Reto, Comprimento da lâmina: 23 mm
Fio de aço inoxidável multifilamento	Cooner Wire, Inc.	AS 631	AWG 40; Diâmetro total: 0,011 mm (com isolamento), 0,008 mm (sem isolamento).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	Sistema de aquisição de dados
Lâmina de bisturi #11	Fine Science Tools	10011-00	Forma da lâmina: Angular, Borda de corte: 20 mm, Espessura: 0,4 mm, Liga / Material: Cabo de bisturi de aço carbono
#3	Fine Science Tools	10003-12	Liga / Material: Aço inoxidável, Comprimento: 12 cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	Código de pedido: 002	Ratos Sprague Dawley (fêmeas e machos)
Microscópio Cirúrgico	Olympus	SZ61	Microscópio cirúrgico
Tesoura de corte de sutura	George Tiemann & Co.	110-1250SB	Liga / Material: Aço Inoxidável, Forma da Ponta: Reta, Pontas: Afiada/Sem Corte, Comprimento: 4.5"
Tesoura de Mola Vannas	Ferramentas de Ciência Fina	15000-08	Dicas: Afiada, Ponta: 2.5 mm, Diâmetro da Ponta: 0.05 mm, Comprimento: 8 cm, Liga / Material: Aço Inoxidável, Serrilhado: Não, Forma da Ponta:
Retrator Weitlaner Retrator Reto	Codman	50-5647	Pontas: 2 x 3 Sem Corte, Comprimento: 4.5"