Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.
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Artigo de método
Isolamento de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical com alto rendimento e baixo dano
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células multipotentes com propriedades regenerativas e imunomoduladoras notáveis. A geléia de Wharton (WJ) do cordão umbilical (UC) tem ganhado um interesse crescente no campo biomédico como uma excelente fonte de MSCs. No entanto, surgiram desafios como oferta limitada e falta de padronização nos métodos existentes. Este artigo apresenta um novo método para aumentar o rendimento do MSC dissecando WJ intacto do cordão umbilical. O método emprega dissecção romba para remover a camada epitelial, mantendo a integridade de todo o WJ e resultando em um aumento da quantidade e viabilidade das MSCs colhidas. Essa abordagem reduz significativamente o desperdício de WJ em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda. Para garantir a pureza das WJ-MSCs e minimizar a influência celular externa, foi realizado um procedimento utilizando tensão interna para descascar o endotélio após a inversão do UC. Além disso, a placa de Petri foi invertida por um curto período de tempo durante o cultivo de explantes para melhorar a fixação e o crescimento celular. A análise comparativa demonstrou a superioridade do método proposto, mostrando um maior rendimento de WJ e WJ-MSCs com melhor viabilidade do que os métodos tradicionais. A morfologia e o padrão de expressão semelhantes dos marcadores de superfície celular em ambos os métodos confirmam sua caracterização e pureza para várias aplicações. Este método fornece uma abordagem de alto rendimento e alta viabilidade para o isolamento de WJ-MSC, demonstrando grande potencial para a aplicação clínica de MSCs.
Introdução
Desde o primeiro isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da geléia de Wharton (WJ) em 1991, essas células-tronco multipotentes ganharam atenção significativa dos pesquisadores devido às suas propriedades regenerativas e capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens1. As CTMs podem ser isoladas de várias fontes, incluindo medula óssea, sangue periférico, polpa dentária, tecido adiposo, fetal (aborto humano) e tecidos relacionados ao parto2. O cordão umbilical () tem emergido como um reservatório promissor devido à sua natureza não invasiva, abundante rendimento celular e capacidade de diferenciação, exibindo uma alta taxa de proliferação, potencial de diferenciação e propriedades de imunomodulação3. As CTMs fetais exibem forte estaminalidade e propriedades imunológicas, tornando-as o foco principal de ensaios clínicos e pesquisas básicas realizadas nas últimas duas décadas 2,4,5. As CTMs derivadas de têm potencial terapêutico superior em comparação com outras fontes de CTM, como medula óssea ou tecido adiposo 6,7.
O é composto por epitélio amniótico, três vasos (duas artérias e uma veia) e a substância gelatinosa conhecida como WJ3. Curiosamente, a UC constitui uma vasculatura simples, constituída apenas pelo endotélio e mesotélio, mas não pela túnica adventícia; o WJ não contém linfa ou nervos8. A UC apresenta uma estrutura única ideal para separação segmentar. As UC-MSCs estão localizadas principalmente no WJ. As CTMs podem ser isoladas de diferentes compartimentos da JM, incluindo âmnio, subâmnio (âmnio e subâmnio também designados como região de revestimento do cordão) e a área perivascular da JE8. Cada região da WJ tem sua própria estrutura, características imuno-histoquímicas e função 3,6.
As CTMs isoladas da WJ da UC são amplamente consideradas como tendo utilidade clínica superior em comparação com as de outras regiões3. As WJ-MSCs têm sido extensivamente estudadas em ambientes pré-clínicos e clínicos para o tratamento de várias doenças devido ao seu potencial de diferenciação multilinha, propriedades imunomoduladoras, efeitos parácrinos, efeitos anti-inflamatórios e propriedades imuno-privilegiadas 2,3. As WJ-MSCs provaram ser promissoras no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD), rejeição do enxerto, doença de Crohn, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares 9,10,11,12,13,14. À medida que a demanda clínica por WJ-MSCs continua a aumentar, a escassez de oferta de cordões umbilicais é atualmente um impedimento para suas aplicações generalizadas.
O rendimento das WJ-MSCs depende do método usado para extração celular15. Embora as WJ-MSCs possam ser isoladas por meio de cultura de explante ou digestão enzimática, o último método tem um tempo de propagação mais longo que pode aumentar o risco de dano celular e diminuir a viabilidade celular16. No entanto, vários estudos mostraram que o método de cultura de explante aumenta a produtividade e a viabilidade celular, e que fatores parácrinos liberados dos tecidos do explante também ajudam a promover a proliferação celular17,18.
Este estudo aplicou uma abordagem de dissecção única para obter WJ inteiro, produzindo MSCs com maior capacidade proliferativa, viabilidade e quantidade, minimizando os danos ao WJ. Este método inovador oferece uma estratégia simplificada para isolar WJ-MSCs, atendendo às necessidades críticas em aplicações MSC.
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Protocolo
As amostras foram obtidas de doadores saudáveis e consentidos do Hospital de Saúde Infantil e Maternidade do Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. O uso de amostras humanas para o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (SZLDH2020LSYM-095) e Comitê de Ética Médica do Hospital de Maternidade e Saúde Infantil do Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de cordão umbilical humano
- Obter amostras do cordão umbilical humano do hospital cooperativo em condições estéreis.
NOTA: Escolha um doador com menos de 35 anos de idade, de preferência um primípara, sem histórico de hepatite, doenças sexualmente transmissíveis ou distúrbios genéticos. Os resultados do exame de admissão para vírus da hepatite B, vírus da hepatite C e citomegalovírus precisam ser negativos. Escolha a cesariana como via de parto. - Selecione uma peça reta e intacta de UC de aproximadamente 10-15 cm de comprimento.
- Feche ambas as extremidades com pinça hemostática e ligue com nós cirúrgicos na extremidade interna entre as pinças logo após o parto de um recém-nascido a termo por cesariana. (UC coletado conforme mostrado na Figura 1, etapa 1).
NOTA: A operação da cesariana garante que a coleta seja estéril. Use nós cirúrgicos de sutura tamanho 0 ou 2-0 para melhor resistência à tração. - Corte o cordão umbilical amarrado entre a pinça e os nós usando uma tesoura cirúrgica (Figura 1, passo 1).
- Enxágue com solução salina para remover quaisquer coágulos sanguíneos contaminantes na superfície e transfira imediatamente para um tubo de plástico estéril de 50 mL contendo 20 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Nenhum antibiótico foi usado durante a transferência. - Sele o tubo. Colocá-lo sobre gelo numa caixa de poliestireno e guardá-lo a 4 °C antes de o transportar para o laboratório.
NOTA: Disseque o cabo dentro de 4 h após a coleta.
2. Isolamento da geléia de Wharton do cordão umbilical
- Processe o cordão umbilical seguindo as etapas abaixo:
- Prepare uma bandeja esterilizada com instrumentos cirúrgicos, pratos de 90 mm embalados assepticamente, pipetas de 1000 μL, PBS estéril, solução de etanol a 75% e meio de cultura MSC humano livre de xeno.
NOTA: A pinça dentada e as pinças de mosquito permitem que o cordão escorregadio seja tratado com eficiência. - Descontamine a superfície dos itens necessários e a zona de trabalho antes de colocar os itens dentro do gabinete de biossegurança.
NOTA: Deixe o ar da zona de trabalho purgar por alguns minutos antes de iniciar o trabalho. - Desinfete a superfície do tubo e remova a amostra em uma placa de Petri no gabinete de biossegurança. Mergulhe a amostra com os nós em etanol a 75% por 30 s e depois enxágue várias vezes com PBS estéril em uma nova placa de Petri.
NOTA: O cabo deve ser ligado antes da imersão em etanol a 75%, e o tempo de imersão deve ser limitado a 30 s a 1 min para desinfetar totalmente o cabo sem danos. - Corte os nós e corte o cordão entre dois nós transversalmente em pedaços curtos de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e pinça.
NOTA: As extremidades do cabo com nós devem ser descartadas. O comprimento da UC não deve ser muito longo ou muito curto; Ambas as condições podem aumentar a dificuldade da operação. - Perfundir a veia (vaso maior) com PBS usando pipetas de 1000 μL até que o fluido que sai da outra extremidade do cordão se torne completamente transparente19.
- Prepare uma bandeja esterilizada com instrumentos cirúrgicos, pratos de 90 mm embalados assepticamente, pipetas de 1000 μL, PBS estéril, solução de etanol a 75% e meio de cultura MSC humano livre de xeno.
- Disseque o cordão umbilical.
- Transfira um dos pedaços já cortados para uma nova placa de Petri.
NOTA: Duas artérias e uma veia devem estar expostas visivelmente na seção transversal8 (Figura 2B). - Adicione a quantidade apropriada de PBS para manter o cabo úmido durante toda a operação.
- Segure o cordão com uma pinça e puxe as artérias ao longo de seu eixo principal com a ajuda de grampos de mosquito.
NOTA: Tente puxar da outra extremidade do cordão se a artéria tiver sido arrancada, pois a parede da artéria tem grande elasticidade. - Fixe o cordão horizontalmente com o lado mais grosso voltado para cima, inserindo uma lâmina da pinça na veia umbilical e, em seguida, apertando firmemente, garantindo que a pinça prenda no lado mais grosso.
- Faça uma incisão linear na camada de epitélio amniótico de uma extremidade à outra ao longo da borda da outra lâmina da pinça usando um bisturi (Figura 3).
NOTA: Preserve a integridade da geléia de Wharton cortando o mínimo de WJ possível. - Comece em um canto da lacuna de corte. Levante o canto do epitélio amniótico com grampos dentados e continue a cortar horizontalmente um pouco mais com uma tesoura de córnea ao longo da superfície interna do epitélio.
- Separe a geléia de Wharton e o epitélio amniótico com grampos e expanda gradualmente para todo o círculo de uma extremidade da UC. Retire a camada epitelial longitudinalmente (Figura 3).
NOTA: A geléia de Wharton é um tecido conjuntivo mucoso envolvido pelo epitélio amniótico denso8. Toda a operação deve ser suave, mas grampos de mosquito podem ser usados para dissecção romba se houver dificuldades durante o peeling.
- Separe a geléia de Wharton e o epitélio amniótico com grampos e expanda gradualmente para todo o círculo de uma extremidade da UC. Retire a camada epitelial longitudinalmente (Figura 3).
- Insira as duas lâminas da pinça dentro da veia, prenda uma parte do WJ e, em seguida, vire-a do avesso para expor o epitélio da veia umbilical (Figura 3).
- Retire o epitélio da veia facilmente, pois a tensão interna cria uma separação entre o epitélio da veia e a WJ perivascular (Figura 3).
- Transfira um dos pedaços já cortados para uma nova placa de Petri.
- Dissecar o usando o método convencional para comparação20.
- Escolha outra amostra já cortada com quase o mesmo peso do cordão anterior e transfira-a para uma nova placa de Petri.
- Corte longitudinalmente ao longo da veia umbilical com tesoura e espalhe o para expor os vasos e a JU.
- Remova a veia umbilical e duas artérias e retire o WJ da camada endotelial com tesoura e bisturi.
3. Isolamento e cultura de UC-MSCs
- Coloque o WJ coletado em uma placa de Petri pré-rotulada de 90 mm e corte-o em pedaços de 1-3 mm com tesoura e pinça.
- Inverta o prato com a tampa no fundo e coloque-o em uma incubadora de CO5% 2 a 37 °C por 30 min para fortalecer a fixação entre as peças e a superfície plástica.
- Vire o prato e adicione delicadamente uma quantidade adequada de meio de cultura MSC humano para cultura posterior.
NOTA: Use a velocidade mais baixa para garantir que as peças ainda estejam presas. - Troque o meio de cultura MSC humano a cada 3 dias. Troque dois terços do meio e observe o aparecimento de crescimento de células fibrosas a cada 2 dias nos primeiros 7 dias, troque o meio completo e observe-o diariamente a partir de então.
NOTA: Evite mover a placa de Petri nos primeiros 7 dias. O crescimento distinto de células semelhantes a fibroblastos foi observado em cerca de 4 dias. - Subcultura até que a confluência atinja 80%.
NOTA: Esta etapa leva de 7 a 10 dias.- Pré-aqueça o meio de cultura PBS, 0,25% de tripsina e MSC humano livre de xeno a 37 ° C em banho-maria.
- Enxágüe com PBS após aspirar o sobrenadante com pipetas e retire as células com tripsina a 0,25% pré-aquecida até que as células possam ser desalojadas batendo na placa de Petri.
- Inative a tripsina misturando o meio de cultura MSC pré-aquecido na proporção de 4:1, colete a suspensão celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 °C.
NOTA: Essas células são consideradas passagem 0 (P0). - Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender as células no meio de cultura MSC humano e inocular em novas placas de Petri com uma densidade de semeadura de 1x104 células/cm2 para propagação.
- Usando um hemocitômetro, conte o número total de células dos dois métodos após a amplificação na primeira, segunda e terceira passagem. Determine a morfologia celular ao microscópio na primeira, terceira e quinta passagens.
NOTA: A morfologia dessas células deve ser semelhante às células P0. - Use células na quinta passagem para citometria de fluxo e outros experimentos.
4. Expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo
- Separe as células de passagem 5 (P5) com 0,25% de tripsina, lave as células com tampão de coloração celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda os grânulos com tampão de coloração celular a 100 μL cada.
- Rotular cada tubo e adicionar as quantidades apropriadas de anticorpos, que foram conjugados com aloficocianina (APC), isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguindo as instruções do fabricante21. Incube por 15-20 min no escuro em temperatura ambiente.
- Centrifugue as células coradas a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C, aspire o sobrenadante com uma pipeta e lave uma vez com tampão de coloração celular.
- Repita a centrifugação e ressuspensão das células com 300 μL do tampão de coloração celular.
- Passe as células pelo citômetro de fluxo e analise as células coradas com anticorpos de acordo com as instruções do fabricante.
5. Determinação da curva de crescimento celular pelo método de contagem de células
- Preparar uma suspensão unicelular de células P5 utilizando dois métodos, diluindo-as num meio de cultura MSC humano.
- Semeie 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços, com um total de 21 poços de cada método sendo semeado.
NOTA: Misture as células suavemente soprando e aspirando com pipetas antes da semeadura. - Colha células de três poços após 24 h de semeadura. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro para calcular o valor médio.
NOTA: Agite a placa antes da contagem da célula. A duração da agitação pode ser estendida para evitar a formação de agregados celulares. - Repita a contagem de células a cada 24 h por um período total de 7 dias. Trace uma curva de crescimento usando o tempo (d) no eixo X e a contagem de células (x104/mL) no eixo Y.
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Resultados
Os procedimentos para coleta e cultura de UC-MSCs, bem como sua análise subsequente, estão resumidos na Figura 1. A UC foi cuidadosamente dissecada em várias seções usando o método único; o diagrama de operação específico dos principais procedimentos é ilustrado na Figura 2. O crescimento de células de culturas de explantes foi rotineiramente monitorado e registrado. Células fusiformes aderentes foram observadas aproximadamente 4 dias após a cultura dos explante...
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Discussão
As CTMs representam uma área dinâmica de pesquisa com profundas implicações para a medicina regenerativa22. Suas propriedades únicas os tornam um ponto focal para a investigação científica e têm o potencial de revolucionar o tratamento de uma ampla gama de doenças e lesões7. As WJ-MSCs são um subconjunto distinto de MSCs, que podem ser obtidas do tecido conjuntivo gelatinoso dentro da UC situado entre o epitélio intervascular e amniótico23. A aplicaç...
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Divulgações
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82172107), Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Fundo de Pesquisa Médica de Shenzhen (SMRF. D2301015), o Comitê Municipal de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e o Fundo Especial do Distrito de Longgang para o Desenvolvimento Econômico e Tecnológico (LGKCYLWS2022007).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-CD44 humano APC | Biolenda | ||
| placas de cultura de células de 24 poços | Thermo Scientific | 142475 | |
| APC anti-humano CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Anticorpo | Biolenda | ||
| Mouse APC IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo | Biolegend | ||
| 400122 Autoclave | HIRAYAMA | HVE-50 | |
| Contador Automático de Células | Countstar | FL-CD | |
| BAMBANKER Solução de Criopreservação | Wako | 302-14681 | |
| Tampão de Coloração Celular | Biolegend | ||
| Centrífuga | Eppendorf | 5424R | |
| Bancada Limpa | Shanghai ZhiCheng | C1112B | |
| CO2 Incubadora | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| D-PBS | Solarbio | D1040 | |
| Forno de Explosão Eletrotermostático | Shanghai JingHong | DHG-9423A | |
| Anticorpo anti-CD105 anti-humano FITC | Biolenda | ||
| FITC anticorpo anti-CD90 humano (Thy1) | Biolenda | ||
| Mouse FITC IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo | Biolegend | 400110 | |
| Citometria de Fluxo | Beckman | CytoFLEX | |
| hemocitômetro | Superior Marienfeld | 640410 | |
| Tampão de lavagem de permeabilização de coloração intracelular (10 vezes;) | Biolenda | ||
| Microscópio Biológico Invertido | 421002 ZEISS | Axio Vert. A1 | |
| Tanque de Armazenamento de Nitrogênio Líquido | Thermo Scientific | CY50935-70 | |
| Solução salina normal (NS) | Meilunbio | MA0083 | |
| PBS | Solarbio | P1032 | |
| PE anti-humano CD11b Anticorpo | Biolegend | ||
| Anticorpo anti-CD19 humano PE | Biolenda | ||
| anticorpo anti-CD34 humano PE | Biolegend | ||
| PE anti-humano CD45 Anticorpo | Biolegend | 368510 | |
| PE anti-humano HLA-DR Anticorpo | Biolenda | ||
| PE Mouse IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo | Biolegend | ||
| PE Mouse IgG2a, κ Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo | Biolegend | ||
| Balança Eletrônica de Precisão | Satorius | PRACTUM313-1CN | |
| Máquina de Gelo Floco de Neve | ZIEGRA ZBE | 30-10 | |
| esterilizado 50 mL tubo de plástico | Greniner | 227270 | |
| Banho-maria termostático | Xangai YiHeng | HWS12 | |
| Tripsina 1:250 | Solarbio | T8150 | |
| UltraGRO-Advanced | Helios | ||
| HPCFDCGL50 Sistema de Purificação de Água Ultrapura e Pura | Milli-Q | Milli-Q Referência | |
| Xeno-Free Meio de Cultura MSC Humano | FUKOKU |
Referências
- Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
- Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
- Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
- Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
- Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
- Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
- Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
- Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
- Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
- Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
- Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
- Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
- Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
- Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).
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Reimpressões e permissões
