Artigo de método

Isolamento de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical com alto rendimento e baixo dano

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DOI:

10.3791/66835

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5 de julho de 2024

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células multipotentes com propriedades regenerativas e imunomoduladoras notáveis. A geléia de Wharton (WJ) do cordão umbilical (UC) tem ganhado um interesse crescente no campo biomédico como uma excelente fonte de MSCs. No entanto, surgiram desafios como oferta limitada e falta de padronização nos métodos existentes. Este artigo apresenta um novo método para aumentar o rendimento do MSC dissecando WJ intacto do cordão umbilical. O método emprega dissecção romba para remover a camada epitelial, mantendo a integridade de todo o WJ e resultando em um aumento da quantidade e viabilidade das MSCs colhidas. Essa abordagem reduz significativamente o desperdício de WJ em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda. Para garantir a pureza das WJ-MSCs e minimizar a influência celular externa, foi realizado um procedimento utilizando tensão interna para descascar o endotélio após a inversão do UC. Além disso, a placa de Petri foi invertida por um curto período de tempo durante o cultivo de explantes para melhorar a fixação e o crescimento celular. A análise comparativa demonstrou a superioridade do método proposto, mostrando um maior rendimento de WJ e WJ-MSCs com melhor viabilidade do que os métodos tradicionais. A morfologia e o padrão de expressão semelhantes dos marcadores de superfície celular em ambos os métodos confirmam sua caracterização e pureza para várias aplicações. Este método fornece uma abordagem de alto rendimento e alta viabilidade para o isolamento de WJ-MSC, demonstrando grande potencial para a aplicação clínica de MSCs.

Introdução

Desde o primeiro isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da geléia de Wharton (WJ) em 1991, essas células-tronco multipotentes ganharam atenção significativa dos pesquisadores devido às suas propriedades regenerativas e capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens1. As CTMs podem ser isoladas de várias fontes, incluindo medula óssea, sangue periférico, polpa dentária, tecido adiposo, fetal (aborto humano) e tecidos relacionados ao parto2. O cordão umbilical () tem emergido como um reservatório promissor devido à sua natureza não invasiva, abundante rendimento celular e capacidade de diferenciação, exibindo uma alta taxa de proliferação, potencial de diferenciação e propriedades de imunomodulação3. As CTMs fetais exibem forte estaminalidade e propriedades imunológicas, tornando-as o foco principal de ensaios clínicos e pesquisas básicas realizadas nas últimas duas décadas 2,4,5. As CTMs derivadas de têm potencial terapêutico superior em comparação com outras fontes de CTM, como medula óssea ou tecido adiposo 6,7.

O é composto por epitélio amniótico, três vasos (duas artérias e uma veia) e a substância gelatinosa conhecida como WJ3. Curiosamente, a UC constitui uma vasculatura simples, constituída apenas pelo endotélio e mesotélio, mas não pela túnica adventícia; o WJ não contém linfa ou nervos8. A UC apresenta uma estrutura única ideal para separação segmentar. As UC-MSCs estão localizadas principalmente no WJ. As CTMs podem ser isoladas de diferentes compartimentos da JM, incluindo âmnio, subâmnio (âmnio e subâmnio também designados como região de revestimento do cordão) e a área perivascular da JE8. Cada região da WJ tem sua própria estrutura, características imuno-histoquímicas e função 3,6.

As CTMs isoladas da WJ da UC são amplamente consideradas como tendo utilidade clínica superior em comparação com as de outras regiões3. As WJ-MSCs têm sido extensivamente estudadas em ambientes pré-clínicos e clínicos para o tratamento de várias doenças devido ao seu potencial de diferenciação multilinha, propriedades imunomoduladoras, efeitos parácrinos, efeitos anti-inflamatórios e propriedades imuno-privilegiadas 2,3. As WJ-MSCs provaram ser promissoras no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD), rejeição do enxerto, doença de Crohn, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares 9,10,11,12,13,14. À medida que a demanda clínica por WJ-MSCs continua a aumentar, a escassez de oferta de cordões umbilicais é atualmente um impedimento para suas aplicações generalizadas.

O rendimento das WJ-MSCs depende do método usado para extração celular15. Embora as WJ-MSCs possam ser isoladas por meio de cultura de explante ou digestão enzimática, o último método tem um tempo de propagação mais longo que pode aumentar o risco de dano celular e diminuir a viabilidade celular16. No entanto, vários estudos mostraram que o método de cultura de explante aumenta a produtividade e a viabilidade celular, e que fatores parácrinos liberados dos tecidos do explante também ajudam a promover a proliferação celular17,18.

Este estudo aplicou uma abordagem de dissecção única para obter WJ inteiro, produzindo MSCs com maior capacidade proliferativa, viabilidade e quantidade, minimizando os danos ao WJ. Este método inovador oferece uma estratégia simplificada para isolar WJ-MSCs, atendendo às necessidades críticas em aplicações MSC.

Protocolo

As amostras foram obtidas de doadores saudáveis e consentidos do Hospital de Saúde Infantil e Maternidade do Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. O uso de amostras humanas para o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (SZLDH2020LSYM-095) e Comitê de Ética Médica do Hospital de Maternidade e Saúde Infantil do Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de cordão umbilical humano

  1. Obter amostras do cordão umbilical humano do hospital cooperativo em condições estéreis.
    NOTA: Escolha um doador com menos de 35 anos de idade, de preferência um primípara, sem histórico de hepatite, doenças sexualmente transmissíveis ou distúrbios genéticos. Os resultados do exame de admissão para vírus da hepatite B, vírus da hepatite C e citomegalovírus precisam ser negativos. Escolha a cesariana como via de parto.
  2. Selecione uma peça reta e intacta de UC de aproximadamente 10-15 cm de comprimento.
  3. Feche ambas as extremidades com pinça hemostática e ligue com nós cirúrgicos na extremidade interna entre as pinças logo após o parto de um recém-nascido a termo por cesariana. (UC coletado conforme mostrado na Figura 1, etapa 1).
    NOTA: A operação da cesariana garante que a coleta seja estéril. Use nós cirúrgicos de sutura tamanho 0 ou 2-0 para melhor resistência à tração.
  4. Corte o cordão umbilical amarrado entre a pinça e os nós usando uma tesoura cirúrgica (Figura 1, passo 1).
  5. Enxágue com solução salina para remover quaisquer coágulos sanguíneos contaminantes na superfície e transfira imediatamente para um tubo de plástico estéril de 50 mL contendo 20 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: Nenhum antibiótico foi usado durante a transferência.
  6. Sele o tubo. Colocá-lo sobre gelo numa caixa de poliestireno e guardá-lo a 4 °C antes de o transportar para o laboratório.
    NOTA: Disseque o cabo dentro de 4 h após a coleta.

2. Isolamento da geléia de Wharton do cordão umbilical

  1. Processe o cordão umbilical seguindo as etapas abaixo:
    1. Prepare uma bandeja esterilizada com instrumentos cirúrgicos, pratos de 90 mm embalados assepticamente, pipetas de 1000 μL, PBS estéril, solução de etanol a 75% e meio de cultura MSC humano livre de xeno.
      NOTA: A pinça dentada e as pinças de mosquito permitem que o cordão escorregadio seja tratado com eficiência.
    2. Descontamine a superfície dos itens necessários e a zona de trabalho antes de colocar os itens dentro do gabinete de biossegurança.
      NOTA: Deixe o ar da zona de trabalho purgar por alguns minutos antes de iniciar o trabalho.
    3. Desinfete a superfície do tubo e remova a amostra em uma placa de Petri no gabinete de biossegurança. Mergulhe a amostra com os nós em etanol a 75% por 30 s e depois enxágue várias vezes com PBS estéril em uma nova placa de Petri.
      NOTA: O cabo deve ser ligado antes da imersão em etanol a 75%, e o tempo de imersão deve ser limitado a 30 s a 1 min para desinfetar totalmente o cabo sem danos.
    4. Corte os nós e corte o cordão entre dois nós transversalmente em pedaços curtos de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e pinça.
      NOTA: As extremidades do cabo com nós devem ser descartadas. O comprimento da UC não deve ser muito longo ou muito curto; Ambas as condições podem aumentar a dificuldade da operação.
    5. Perfundir a veia (vaso maior) com PBS usando pipetas de 1000 μL até que o fluido que sai da outra extremidade do cordão se torne completamente transparente19.
  2. Disseque o cordão umbilical.
    1. Transfira um dos pedaços já cortados para uma nova placa de Petri.
      NOTA: Duas artérias e uma veia devem estar expostas visivelmente na seção transversal8 (Figura 2B).
    2. Adicione a quantidade apropriada de PBS para manter o cabo úmido durante toda a operação.
    3. Segure o cordão com uma pinça e puxe as artérias ao longo de seu eixo principal com a ajuda de grampos de mosquito.
      NOTA: Tente puxar da outra extremidade do cordão se a artéria tiver sido arrancada, pois a parede da artéria tem grande elasticidade.
    4. Fixe o cordão horizontalmente com o lado mais grosso voltado para cima, inserindo uma lâmina da pinça na veia umbilical e, em seguida, apertando firmemente, garantindo que a pinça prenda no lado mais grosso.
    5. Faça uma incisão linear na camada de epitélio amniótico de uma extremidade à outra ao longo da borda da outra lâmina da pinça usando um bisturi (Figura 3).
      NOTA: Preserve a integridade da geléia de Wharton cortando o mínimo de WJ possível.
    6. Comece em um canto da lacuna de corte. Levante o canto do epitélio amniótico com grampos dentados e continue a cortar horizontalmente um pouco mais com uma tesoura de córnea ao longo da superfície interna do epitélio.
      1. Separe a geléia de Wharton e o epitélio amniótico com grampos e expanda gradualmente para todo o círculo de uma extremidade da UC. Retire a camada epitelial longitudinalmente (Figura 3).
        NOTA: A geléia de Wharton é um tecido conjuntivo mucoso envolvido pelo epitélio amniótico denso8. Toda a operação deve ser suave, mas grampos de mosquito podem ser usados para dissecção romba se houver dificuldades durante o peeling.
    7. Insira as duas lâminas da pinça dentro da veia, prenda uma parte do WJ e, em seguida, vire-a do avesso para expor o epitélio da veia umbilical (Figura 3).
    8. Retire o epitélio da veia facilmente, pois a tensão interna cria uma separação entre o epitélio da veia e a WJ perivascular (Figura 3).
  3. Dissecar o usando o método convencional para comparação20.
    1. Escolha outra amostra já cortada com quase o mesmo peso do cordão anterior e transfira-a para uma nova placa de Petri.
    2. Corte longitudinalmente ao longo da veia umbilical com tesoura e espalhe o para expor os vasos e a JU.
    3. Remova a veia umbilical e duas artérias e retire o WJ da camada endotelial com tesoura e bisturi.

3. Isolamento e cultura de UC-MSCs

  1. Coloque o WJ coletado em uma placa de Petri pré-rotulada de 90 mm e corte-o em pedaços de 1-3 mm com tesoura e pinça.
  2. Inverta o prato com a tampa no fundo e coloque-o em uma incubadora de CO5% 2 a 37 °C por 30 min para fortalecer a fixação entre as peças e a superfície plástica.
  3. Vire o prato e adicione delicadamente uma quantidade adequada de meio de cultura MSC humano para cultura posterior.
    NOTA: Use a velocidade mais baixa para garantir que as peças ainda estejam presas.
  4. Troque o meio de cultura MSC humano a cada 3 dias. Troque dois terços do meio e observe o aparecimento de crescimento de células fibrosas a cada 2 dias nos primeiros 7 dias, troque o meio completo e observe-o diariamente a partir de então.
    NOTA: Evite mover a placa de Petri nos primeiros 7 dias. O crescimento distinto de células semelhantes a fibroblastos foi observado em cerca de 4 dias.
  5. Subcultura até que a confluência atinja 80%.
    NOTA: Esta etapa leva de 7 a 10 dias.
    1. Pré-aqueça o meio de cultura PBS, 0,25% de tripsina e MSC humano livre de xeno a 37 ° C em banho-maria.
    2. Enxágüe com PBS após aspirar o sobrenadante com pipetas e retire as células com tripsina a 0,25% pré-aquecida até que as células possam ser desalojadas batendo na placa de Petri.
    3. Inative a tripsina misturando o meio de cultura MSC pré-aquecido na proporção de 4:1, colete a suspensão celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 °C.
      NOTA: Essas células são consideradas passagem 0 (P0).
    4. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender as células no meio de cultura MSC humano e inocular em novas placas de Petri com uma densidade de semeadura de 1x104 células/cm2 para propagação.
  6. Usando um hemocitômetro, conte o número total de células dos dois métodos após a amplificação na primeira, segunda e terceira passagem. Determine a morfologia celular ao microscópio na primeira, terceira e quinta passagens.
    NOTA: A morfologia dessas células deve ser semelhante às células P0.
  7. Use células na quinta passagem para citometria de fluxo e outros experimentos.

4. Expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo

  1. Separe as células de passagem 5 (P5) com 0,25% de tripsina, lave as células com tampão de coloração celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda os grânulos com tampão de coloração celular a 100 μL cada.
  2. Rotular cada tubo e adicionar as quantidades apropriadas de anticorpos, que foram conjugados com aloficocianina (APC), isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguindo as instruções do fabricante21. Incube por 15-20 min no escuro em temperatura ambiente.
  3. Centrifugue as células coradas a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C, aspire o sobrenadante com uma pipeta e lave uma vez com tampão de coloração celular.
  4. Repita a centrifugação e ressuspensão das células com 300 μL do tampão de coloração celular.
  5. Passe as células pelo citômetro de fluxo e analise as células coradas com anticorpos de acordo com as instruções do fabricante.

5. Determinação da curva de crescimento celular pelo método de contagem de células

  1. Preparar uma suspensão unicelular de células P5 utilizando dois métodos, diluindo-as num meio de cultura MSC humano.
  2. Semeie 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços, com um total de 21 poços de cada método sendo semeado.
    NOTA: Misture as células suavemente soprando e aspirando com pipetas antes da semeadura.
  3. Colha células de três poços após 24 h de semeadura. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro para calcular o valor médio.
    NOTA: Agite a placa antes da contagem da célula. A duração da agitação pode ser estendida para evitar a formação de agregados celulares.
  4. Repita a contagem de células a cada 24 h por um período total de 7 dias. Trace uma curva de crescimento usando o tempo (d) no eixo X e a contagem de células (x104/mL) no eixo Y.

Resultados

Os procedimentos para coleta e cultura de UC-MSCs, bem como sua análise subsequente, estão resumidos na Figura 1. A UC foi cuidadosamente dissecada em várias seções usando o método único; o diagrama de operação específico dos principais procedimentos é ilustrado na Figura 2. O crescimento de células de culturas de explantes foi rotineiramente monitorado e registrado. Células fusiformes aderentes foram observadas aproximadamente 4 dias após a cultura dos explantes e cada vez mais rastejadas em forma de vórtice. Essas células também foram identificadas como P0 e continuaram a proliferar para a passagem subsequente, mantendo tamanho e morfologia uniformes durante a proliferação e a passagem. Os métodos convencional e atual exibiram diferenças insignificantes em termos de tamanho e morfologia celular (Figura 3).

O método convencional de dissecção envolve raspar o WJ dos vasos sanguíneos e do epitélio interno do UC. A produtividade de WJ representou uma diferença significativa entre os dois métodos por ajuste de peso. O rendimento do WJ pode ser calculado medindo a porcentagem de peso do WJ no cordão de 2 cm (2,4 g ± 0,2 g). Uma comparação da razão de rendimento de WJ entre os métodos atual e tradicional mostrou um aumento significativo no rendimento de WJ usando a nova abordagem (Figura 4A). Uma análise mais aprofundada, contando a quantidade total de WJ-MSCs colhidas por ambos os métodos a partir do peso equivalente de UC simultaneamente, mostrou uma lacuna pronunciada na quantidade de células com o aumento do número de passagens (Figura 4B). A curva de crescimento indicou que a taxa de proliferação de MSCs no novo método foi significativamente maior do que no método convencional sob a mesma densidade de inoculação após 2 dias (Figura 4C). Esses experimentos demonstram as vantagens do método atual, que permite uma maneira eficiente de aumentar o fornecimento eficiente do mesmo material.

Seguindo os critérios mínimos da diretriz da International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) para a definição de CTMs, o imunofenótipo das CTMs demonstra expressão positiva de CD105, CD44, CD90, CD73 (mais de 95%), estando ausente de CD45, CD19, CD34, CD11b e HLA-DR (menos de 2%)22. As CTMs derivadas de WJ foram investigadas por citometria de fluxo quantitativa (Figura 5); as células isoladas por ambos os métodos foram altamente positivas para os antígenos de superfície CD105, CD44, CD90 e CD73 (todos acima de 99%), com a expressão das moléculas de superfície CD45, CD19, CD34, CD11b e HLA-DR foram expressas abaixo dos níveis detectáveis (dados não mostrados). Com base nos resultados dos marcadores de superfície celular, as células aderentes podem ser finamente consideradas como MSCs, e sua identificação e pureza podem ser garantidas.

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Figura 1: Representação esquemática da dissecção e isolamento de WJ-MSCs do cordão umbilical. Passo 1: A amostra do cordão umbilical humano é coletada do recém-nascido e enxaguada com solução salina, seguida de perfusão da veia. O cordão é então cortado em pedaços de 2 cm. Passo 2: A geléia de Wharton pura (WJ) é obtida usando o método atual, envolvendo a separação das artérias, epitélio amniótico e epitélio venoso. O método tradicional também é usado para comparação. O cordão umbilical é dissecado em conformidade. Passo 3: O WJ dissecado é cortado em pedaços de 1-3 mm e o prato é colocado de cabeça para baixo na incubadora por 30 min para fortalecer a fixação entre os pedaços e a superfície plástica. As peças WJ são então cultivadas e passadas a uma densidade de semeadura de 1 x 104 células/cm2 até atingir 80% de confluência. Etapa 4: A citometria de fluxo é usada para caracterizar as células P5 analisando os marcadores de superfície das células-tronco mesenquimais (MSC). Passo 5: A capacidade proliferativa das células é determinada traçando uma curva de crescimento celular usando o método de contagem de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Anatomia do cordão umbilical e demonstração esquemática da dissecção. (A) O corte transversal do CV, destacando as artérias (A), veia (V), geléia de Wharton (WJ) e a dissecção subsequente separa o CV em diferentes compartimentos. (B) Demonstração esquemática da remoção da camada epitelial amniótica. A incisão é feita ao longo da linha tracejada do epitélio amniótico, separando o epitélio começando com o canto lateral da medula. (C) Demonstração esquemática da remoção do epitélio da veia. Virar o cordão do avesso (a direção da seta indica a direção da força) expõe o epitélio da veia para remoção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Características morfológicas de WJ-MSCs cultivadas primárias e passadas. O crescimento distinto de células fibroblastóides dos explantes pode ser observado por volta do dia 4 (denotado pelas setas) e exibiu cada vez mais um padrão de crescimento semelhante a um vórtice. Os explantes foram removidos e subcultivados; As células isoladas foram homogêneas em relação ao tamanho e morfologia visualizados. Uma diferença insignificante foi observada no tamanho e morfologia das células entre os dois métodos. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise comparativa gráfica do rendimento de WJ e das características de crescimento das MSCs cultivadas. (A) Comparação da produtividade de WJ usando 2 cm UC com um peso inicial de 2,4 g ± 0,2 g por ambos os métodos. Rendimento de WJ = (peso de WJ) / (peso inicial do cordão não processado. Razão entre o rendimento de WJ (%) = (rendimento de WJ) / (rendimento médio de WJ do método atual) × 100. (B) Comparação da contagem de células após cultura e passagem sob a mesma condição por ambos os métodos. (C) Curvas de crescimento de células P5 em ambos os métodos. Todos os experimentos incluíram três repetições biológicas, e as diferenças estatísticas foram analisadas pelo método ANOVA de duas vias (***p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Expressão da superfície celular de MSC analisada por citometria de fluxo. As células P5 coletadas pelos métodos convencional e atual são submetidas à análise por citometria de fluxo. Os antígenos de superfície CD44, CD105, CD90 e CD73 foram altamente positivos (todos acima de 99%), enquanto as expressões das moléculas de superfície CD45, CD19, CD34, CD11b e HLA-DR estavam abaixo do limite de detecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

As CTMs representam uma área dinâmica de pesquisa com profundas implicações para a medicina regenerativa22. Suas propriedades únicas os tornam um ponto focal para a investigação científica e têm o potencial de revolucionar o tratamento de uma ampla gama de doenças e lesões7. As WJ-MSCs são um subconjunto distinto de MSCs, que podem ser obtidas do tecido conjuntivo gelatinoso dentro da UC situado entre o epitélio intervascular e amniótico23. A aplicação clínica das CTMs consiste em atingir um número suficiente de células24. No entanto, à medida que o número de passagens aumentou, as células começaram a apresentar um certo grau de fenômeno de envelhecimento, e a capacidade proliferativa das CTMs diminuiu gradualmente após o P524. A otimização de métodos para aumentar o rendimento do MSC é, portanto, imperativa.

A maneira mais eficiente de isolar WJ-MSCs é dissecar todo o WJ, preservando sua integridade6. Pesquisas mostram que essas células de borda das regiões da borda do cordão umbilical têm uma característica de migração mais alta e uma taxa de proliferação mais alta do que as WJ-MSCs intervasculares23. No entanto, as regiões e métodos para dissecar WJ não foram padronizados, e ainda não está claro se as populações de células-tronco dentro das WJ-MSCs compartilham as mesmas qualidades devido à falta de limites histológicos claros entre as partições3.

Estudos anteriores indicaram diferenças significativas nas propriedades das WJ-MSCs derivadas de vários compartimentos do cordão umbilical, com células localizadas próximas à superfície amniótica exibindo maior capacidade proliferativa3. O método exclusivo atual de dissecar UC e isolar WJ-MSCs visa reduzir a perda do revestimento WJ e o dano celular, o que aumenta o rendimento e a viabilidade celular. Este protocolo demonstra um método que facilitou o processamento de UC em WJ quase intacto. A etapa principal do protocolo envolve a remoção da camada epitelial por meio de peeling e dissecção romba. A etapa inovadora é descascar a camada epitelial longitudinalmente com grampos de mosquito. Essa abordagem é eficaz na redução do dano celular adjacente causado pela dissecção cortante convencional com tesoura25.

O endotélio da veia é frágil e difícil de se livrar. Depois de remover o epitélio amniótico da veia umbilical, o cordão umbilical é virado através da veia para expor o endotélio. A tensão interna criada pelo WJ é então usada para descascar o endotélio da veia, minimizando assim a interferência da interferência das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante os processos subsequentes de cultura de células.

O método de cultura de explante é adotado por apresentar maior rendimento em comparação com outros métodos disponíveis18. As células soltas serão gradualmente removidas através da troca do meio de cultura MSC humano, resultando na perda de células26. Os explantes que não aderem ao plástico podem impedir o crescimento celular em experiências anteriores. O impacto do vapor d'água emitido do tecido devido às mudanças entre as temperaturas interna e externa da incubadora precisa ser considerado. Para manter o estado seco da placa de Petri, foi implementada uma etapa inovadora de virar a placa de cabeça para baixo por 30 min durante a incubação com a tampa no fundo. Essa inversão de uma placa evitou a condensação de vapor de água no contato entre o tecido e a superfície da placa de Petri, o que, por sua vez, permite uma melhor fixação dos exossomos à superfície plástica para melhorar o crescimento celular.

O método atual é comparado com o método convencional de dissecação, medindo a porcentagem em peso do WJ obtido e a quantidade de MSCs cultivadas e passadas; um rendimento significativamente maior de WJ e uma quantidade adicional de MSCs colhidas foram mostrados pelo novo método. Embora qualquer protocolo para isolar populações de células-tronco de cada um desses compartimentos acarrete o risco de contaminação celular dos outros compartimentos, os resultados demonstraram a pureza das MSCs isoladas, caracterizadas por alta expressão de marcadores mesenquimais (todos acima de 99%) e detecção mínima de marcadores hematopoiéticos e endoteliais (dados não mostrados). Os resultados provaram que os WJ-MSCs são puros e adequados para várias aplicações, alinhando-se com as diretrizes do ISCT21. As MSCs cultivadas exibiram células semelhantes a fibroblastos em um curto período, e as células se formaram cada vez mais em células em forma de vórtice, exibindo grande potencial proliferativo e propriedades migratórias.

O protocolo delineado neste estudo apresenta várias deficiências. Em primeiro lugar, a proficiência exigida para o operador é alta, conforme indicado pela separação do epitélio amniótico. Isso pode dificultar sua ampla adoção em pesquisas ou aplicações clínicas. Em segundo lugar, o protocolo depende muito da manipulação manual durante a dissecação, o que pode introduzir inconsistência entre experimentos ou operadores. A padronização do processo de dissecção aumentaria a confiabilidade e a reprodutibilidade do protocolo25. Além disso, a falta de outras comparações com o método convencional deixa perguntas sem resposta.

Em conclusão, o método atual fornece uma maneira eficiente de separar o WJ intacto do epitélio amniótico e dos vasos, resultando em uma colheita que inclui a geléia de Wharton perivascular e subamniótica. A introdução de uma etapa de incubação invertida contribui ainda mais para melhorar a fixação do MSC. A análise comparativa com métodos tradicionais demonstra as vantagens significativas do protocolo proposto em termos de obtenção de maior rendimento de WJ e colheita de mais CTMs com melhor capacidade proliferativa. Os resultados também destacam a pureza das MSCs isoladas, conforme indicado por um padrão distinto de expressão de marcadores de superfície celular. Este método pode aumentar o rendimento e a capacidade proliferativa das MSC, oferecendo um método econômico para aumentar a produção de MSC.

Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82172107), Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Fundo de Pesquisa Médica de Shenzhen (SMRF. D2301015), o Comitê Municipal de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e o Fundo Especial do Distrito de Longgang para o Desenvolvimento Econômico e Tecnológico (LGKCYLWS2022007).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-CD44 humano APC Biolenda 
placas de cultura de células de 24 poçosThermo Scientific142475
APC anti-humano CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Anticorpo Biolenda 
Mouse APC IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
400122 AutoclaveHIRAYAMAHVE-50
Contador Automático de CélulasCountstarFL-CD
BAMBANKER Solução de CriopreservaçãoWako302-14681
Tampão de Coloração CelularBiolegend 
CentrífugaEppendorf5424R
Bancada LimpaShanghai ZhiChengC1112B
CO2 IncubadoraThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Forno de Explosão EletrotermostáticoShanghai JingHongDHG-9423A
Anticorpo anti-CD105 anti-humano FITC Biolenda 
FITC anticorpo anti-CD90 humano (Thy1) Biolenda 
Mouse FITC IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 400110
Citometria de FluxoBeckmanCytoFLEX
hemocitômetroSuperior Marienfeld640410
Tampão de lavagem de permeabilização de coloração intracelular (10 vezes;) Biolenda 
Microscópio Biológico Invertido421002 ZEISSAxio Vert. A1
Tanque de Armazenamento de Nitrogênio LíquidoThermo ScientificCY50935-70
Solução salina normal (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-humano CD11b AnticorpoBiolegend 
Anticorpo anti-CD19 humano PE Biolenda 
anticorpo anti-CD34 humano PEBiolegend
PE anti-humano CD45 AnticorpoBiolegend 368510
PE anti-humano HLA-DR Anticorpo Biolenda 
PE Mouse IgG1, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
PE Mouse IgG2a, κ Isotipo Ctrl (FC) AnticorpoBiolegend 
Balança Eletrônica de PrecisãoSatoriusPRACTUM313-1CN
Máquina de Gelo Floco de NeveZIEGRA ZBE30-10
esterilizado 50 mL tubo de plásticoGreniner227270
Banho-maria termostáticoXangai YiHengHWS12
Tripsina 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
HPCFDCGL50 Sistema de Purificação de Água Ultrapura e PuraMilli-QMilli-Q Referência
Xeno-Free Meio de Cultura MSC HumanoFUKOKU 
338806344006Máquina 420201 323204328108393112392506343606307606400114400214T2011301

Referências

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