Integração da Avaliação Comportamental Animal e Rede Neural Convolucional para Estudar a Interação Sabor-Cheiro Wasabi-Álcool

Resumo

Este artigo descreve um conjunto de métodos para medir a capacidade supressora de cheirar bebidas alcoólicas na sensação de picada provocada por wasabi.

Resumo

As pastas comerciais de wasabi comumente usadas para preparação de alimentos contêm um composto homólogo de isotiocianatos quimiossensoriais (ITCs) que provocam uma sensação irritante após o consumo. O impacto de cheirar bebidas alcoólicas dietéticas na sensação de tempero do wasabi nunca foi estudado. Embora a maioria dos estudos de avaliação sensorial se concentre em alimentos e bebidas individuais separadamente, há uma falta de pesquisas sobre o estudo olfativo de cheirar licor durante o consumo de wasabi. Aqui, é desenvolvida uma metodologia que combina o uso de um estudo comportamental animal e uma rede neural convolucional para analisar as expressões faciais de camundongos quando eles cheiram licor e consomem wasabi simultaneamente. Os resultados demonstram que o modelo de deep learning treinado e validado reconhece 29% das imagens que retratam o co-tratamento de wasabi e álcool pertencentes à classe do grupo wasabi-negativo para licor positivo sem a necessidade de filtragem prévia de materiais de treinamento. A análise estatística dos escores da escala de caretas de camundongos obtidos a partir das imagens de quadros de vídeo selecionadas revela uma diferença significativa (P < 0,01) entre a presença e ausência de bebidas alcoólicas. Esse achado sugere que as bebidas alcoólicas dietéticas podem ter um efeito decrescente nas reações provocadas por wasabi em camundongos. Esta metodologia combinatória tem potencial para triagem individual de compostos ITC e análises sensoriais de componentes de espíritos no futuro. No entanto, mais estudos são necessários para investigar o mecanismo subjacente da supressão da pungência de wasabi induzida pelo álcool.

Introdução

Wasabia japonica, comumente conhecido como wasabi, ganhou reconhecimento no preparo de alimentos ^1,2. A intensa experiência sensorial que provoca no consumo, caracterizada por lacrimejar, espirrar ou tossir, é bem conhecida. Essa pungência distinta do wasabi pode ser atribuída a um composto homólogo de isotiocianatos quimiossensoriais (ITCs). Eles são fitoquímicos organossulfurados voláteis que podem ser categorizados em isotiocianatos de ω-alquenil e ω-metiltioalquil³. Dentre esses compostos, o isotiocianato de alila (AITC) é o produto natural ITC mais predominado em plantas pertencentes à família Cruciferae, como raiz-forte e mostarda⁴. As pastas comerciais de wasabi são comumente preparadas a partir de raiz-forte, tornando o AITC um marcador químico usado para controle de qualidade desses produtos comerciais⁵.

A combinação de bebidas alcoólicas dietéticas com pratos com infusão de wasabi pode ser considerada um exemplo de disposição cultural⁶. Subjetivamente, essa combinação pode complementar o tempero e o calor entre o wasabi e o destilado, aprimorando a experiência culinária geral. A avaliação comportamental qualitativa animal (QBA) é uma abordagem metodológica abrangente de animais inteiros que examina as mudanças comportamentais em indivíduos em resposta a estímulos externos de curto ou longo prazo usando termos numéricos⁷. Esse método engloba testes de dor, testes motores, testes de aprendizado e memória, além de testes de emoção projetados especificamente para modelos de roedores⁸. No entanto, estudos que investigam a avaliação sensorial sinérgica da gustação juntamente com o olfato permanecem escassos na literatura até o momento ^9,10. A maioria dos estudos sobre sensação quimestésica limita-se a examinar separadamente o consumo individual de alimentos e bebidas¹¹. Consequentemente, há uma escassez de pesquisas sobre a interação paladar-cheiro envolvendo o ato de cheirar licor enquanto consome wasabi.

Como se acredita que a sensação de picada induzida por wasabi seja uma forma de nocicepção¹², as avaliações comportamentais dos animais são adequadas para avaliar as respostas sensoriais nociceptivas em roedores ^8,13,14. Um método para avaliar a nocicepção em camundongos, conhecido como pontuação da escala de careta de camundongo (MGS), foi desenvolvido por Langford et ^al.15,16. Este método de estudo comportamental é uma abordagem de avaliação relacionada à dor, contando com a análise das expressões faciais exibidas pelos camundongos experimentais. A configuração experimental é simples, envolvendo uma gaiola transparente e 2 câmeras para gravação de vídeo. Ao incorporar tecnologias avançadas ^17,18,19 para captura automática de dados, medidas comportamentais quantitativas e qualitativas podem ser obtidas, aumentando o bem-estar animal durante o monitoramento comportamental²⁰. Consequentemente, o MGS tem potencial para ser aplicado no estudo dos efeitos de vários estímulos externos em animais de forma ininterrupta e ad libitum. No entanto, o processo de pontuação envolve apenas a seleção de algumas (menos de 10) imagens de quadros de vídeo para avaliação pelos painelistas, e é necessário treinamento prévio. Marcar um grande número de imagens de amostra pode ser trabalhoso. Para superar esse desafio demorado, vários estudos empregaram técnicas de aprendizado de máquina para prever o escore MGS ^21,22. No entanto, é importante notar que o MGS é uma medida contínua. Portanto, um modelo de classificação multiclasse seria mais adequado para avaliar um problema lógico e categórico, como determinar se as imagens de camundongos ingerindo wasabi e cheirando licor simultaneamente se assemelham às de camundongos normais.

Neste estudo, foi proposta uma metodologia para investigar a interação paladar-cheiro em camundongos. Essa metodologia combina estudos comportamentais de animais com uma rede neural convolucional (CNN) para analisar as expressões faciais dos camundongos. Dois camundongos foram observados três vezes em condições comportamentais normais, durante a experiência de nocicepção induzida por wasabi e enquanto cheiravam licor em uma gaiola especificamente projetada. As expressões faciais dos camundongos foram gravadas em vídeo e as imagens geradas foram utilizadas para otimizar a arquitetura de um modelo de aprendizado profundo (DL). O modelo foi então validado usando um conjunto de dados de imagens independentes e implantado para classificar as imagens adquiridas do grupo experimental. Para determinar a extensão da supressão da pungência do wasabi quando os camundongos cheiraram simultaneamente licor durante o consumo de wasabi, os insights fornecidos pela inteligência artificial foram corroborados por meio da validação cruzada com outro método de análise de dados, a pontuação MGS¹⁶.

Protocolo

Neste estudo, dois camundongos machos ICR de 7 semanas de idade pesando entre 17-25 g foram utilizados para a avaliação comportamental animal. Todos os procedimentos experimentais e de alojamento foram aprovados pelo Comitê da Universidade Batista de Hong Kong sobre o Uso de Seres Humanos e Animais no Ensino e Pesquisa. A sala dos animais foi mantida a uma temperatura de 25 °C e uma umidade ambiente de 40%-70% em um ciclo claro-escuro de 12 horas.

1. Projeto da gaiola

1. Prepare tijolos de acrilonitrila butadieno estireno em 3 dimensões diferentes para a construção de gaiolas: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm e 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Prepare uma placa de acrilonitrila butadieno estireno (312 mm x 147 mm x 2 mm) como base da gaiola.
3. Prepare uma placa de acrílico não transparente de 239 mm x 107 mm com uma espessura de 2 mm para ser usada como placa inferior.
4. Prepare uma placa de acrílico transparente de 239 mm x 107 mm com uma espessura de 5 mm para ser usada como placa superior.
5. Prepare uma placa de acrílico transparente de 107 mm x 50 mm com uma espessura de 7 mm para ser usada como placa terminal.
6. Construa 2 paredes laterais opacas empilhando tijolos a uma altura de 54 mm.
7. Incorpore as placas de acrílico na gaiola à base de acrilonitrila butadieno estireno, conforme ilustrado na Figura 1A.
8. Prepare uma câmara de ração construída por cinco placas de acrílico transparente de 90 mm x 50 mm com espessura de 2 mm, conforme ilustrado na Figura 1B. Entre as 5 placas de acrílico transparente, use 2 placas para as laterais, 1 placa para a parte superior, 1 placa para a parte inferior e 1 placa para o terminal.
9. Prepare uma placa de acrílico transparente de 60 mm x 50 mm e 2 mm como placa de introdução da ração e coloque-a na câmara da ração.

2. Avaliação comportamental animal

1. Irmãos de ninhada de 2 camundongos machos ICR de 7 semanas juntos em uma gaiola regular.
2. Forneça aos irmãos de ninhada de 2 ratos acesso gratuito a pellets de comida e água da torneira por um período de adaptação de 1 semana.
3. Após 1 semana, introduza os irmãos de ninhada de 2 camundongos com uma garrafa de etanol (~ 40% v / v).
   NOTA: Certifique-se de que eles só podem cheirar ou inalar o etanol aquoso fornecido ad libitum enquanto o consumo estiver restrito.
4. Realize experimentos comportamentais usando o modelo de camundongo de 9 a 10 semanas de idade e a gaiola de cubículo transparente representada na Figura 1A.
5. Desmonte todas as placas de acrílico e placas de acrilonitrila butadieno estireno e limpe-as bem. Comece enxaguando-os com água ultrapura pelo menos 3 vezes e depois seque-os com papel toalha. Em seguida, borrife-os com etanol a 75%, seguido de limpeza com papel para lentes. Por fim, deixe-os secar ao ar por pelo menos 15 min.
6. Pese os camundongos e registre seus pesos corporais antes de cada replicação do experimento comportamental.
7. Prepare na hora uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim pesando 1 g de wasabi comercial e 4,5 g de manteiga de amendoim. Misture-os em um saco plástico com zíper.
   NOTA: Devido à volatilidade dos isotiocianatos no wasabi, é importante armazenar o wasabi comercial em um freezer a -20 °C.
8. Pese e forneça duas pastas de 0,5 g de manteiga de amendoim ou uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim na placa de introdução da ração, conforme ilustrado na Figura 1B, C.
9. Coloque a placa de introdução de ração preparada na câmara das rações, conforme ilustrado na Figura 1B, C, para permitir que os 2 camundongos tenham acesso ad libitum aos alimentos durante cada sessão de gravação de vídeo.
10. Preencha a ranhura abaixo com 30 mL de líquido, água pura ou licor (~ 42% v / v etanol), para facilitar a inalação simultânea, conforme indicado na Figura 1B, C.
11. Comece a gravar usando as câmeras em 2 smartphones colocados nos suportes do telefone em cada terminal.
    NOTA: As especificações dos vídeos são as seguintes: largura do quadro, 1920; altura do quadro, 1080; taxa de dados, 20745 kbps; taxa de quadros, 30,00 quadros por segundo (fps).
12. Coloque cuidadosamente os 2 irmãos de ninhada treinados de camundongos na plataforma de estudo comportamental animal projetada a partir do topo e prenda imediatamente a gaiola com a placa superior.
    NOTA: Certifique-se de que esta etapa seja concluída em 15 s.
13. Grave cada vídeo por 2-3 min.
    NOTA: Certifique-se de que toda a duração do experimento, desde a preparação da mistura de manteiga de amendoim e wasabi até a conclusão da gravação do vídeo, seja limitada a 5 min.
14. Repita todo o experimento 3 vezes.
    NOTA: Certifique-se de que cada réplica do experimento seja separada por pelo menos 6 h.
15. Imite diferentes cenários.
    NOTA: Por exemplo, neste trabalho, um par de camundongos foi usado em 4 grupos com 4 cenários diferentes que foram imitados usando a configuração experimental descrita acima. Esses cenários incluem o Cenário A para o estudo de fundo, o Cenário B para o estudo de controle positivo, o Cenário C para o estudo de interação sabor-cheiro de wasabi-álcool e o Cenário D para o estudo de controle negativo. A Tabela 1 fornece um resumo desses cenários.

3. Reconhecimento de imagem

Semelhante a muitos estudos sobre processamento de imagens 23,24,25, um modelo de classificação foi obtido treinando uma CNN. O script para operações DL foi escrito em Python v.3.10 no Jupyter Notebook (anaconda3). Ele está disponível no seguinte repositório GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Para construir e treinar a CNN, bibliotecas de código aberto foram usadas, incluindo numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 e keras v.2.11.0. Essas bibliotecas forneceram as ferramentas e funcionalidades necessárias para desenvolver e treinar a CNN para reconhecimento de imagem.

1. Exporte uma série de imagens de quadro de vídeo dos videoclipes coletados para gerar um conjunto de dados para treinamento de modelo usando o Jupyter Notebook fornecido, chamado Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Selecione apenas as imagens com pelo menos 1 mouse consumindo a pasta fornecida. Exemplos das imagens selecionadas são fornecidos na Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5, Figura Suplementar 6 e Figura Suplementar 7.
3. Execute o aumento de dados invertendo horizontalmente as imagens geradas implementando o script fornecido no Jupyter Notebook, chamado Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Reserve os dados de imagem de cada segunda replicação para validação de modelo CNN independente externo. Use as imagens de cada primeira e terceira réplicas para treinamento e teste de modelo interno.
5. Pré-processe os dados de imagem usados na modelagem CNN executando o script no Jupyter Notebook, chamado Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluindo redimensionamento de imagem, conversão de cor preta e normalização de sinal de imagem.
6. Divida os materiais de treinamento em conjuntos de dados internos de treinamento e teste de forma aleatória de 8:2.
7. Inicialize a arquitetura da CNN. Projete o número de saídas da CNN com base no número de cenários a serem examinados.
   NOTA: Por exemplo, neste estudo, a rede neural foi designada para classificar 3 classes. Certifique-se de que o script para lidar com o desequilíbrio de dados no peso da classe seja compilado.
8. Encontre a combinação de hiperparâmetros que produz perda mínima nas amostras de teste internas para construção de CNN.
9. Adote a combinação ideal de hiperparâmetros para construir a arquitetura CNN.
10. Abra os Jupyter Notebooks fornecidos Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb e Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Valide o modelo obtido usando as imagens independentes (originais e invertidas) da segunda réplica do experimento comportamental animal.
11. Implante o modelo obtido e validado para classificar as imagens de quadro de vídeo geradas a partir do grupo experimental usando o Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Por exemplo, é o cenário C neste trabalho.

4. Pontuação manual da escala de caretas do mouse

NOTA: Para validar os insights fornecidos pela predição do modelo CNN, outro método previamente desenvolvido e validado por Langford et al. foi aplicado¹⁶. Este método envolve a pontuação do MGS com base nas 5 unidades de ação facial (AUs) específicas do camundongo: aperto orbital, protuberância do nariz, protuberância da bochecha, orelhas apertando para fora e mudança de bigode. Cada UA recebe uma pontuação de 0, 1 ou 2, indicando a ausência, presença moderada ou presença óbvia da UA, respectivamente. Este sistema de pontuação permite a quantificação e escalonamento de cada UA para avaliar o nível de nocicepção ou desconforto experimentado pelos camundongos.

1. Capture 3 imagens de quadro de vídeo dos irmãos de ninhada ingerindo a pasta para cada videoclipe. Certifique-se de que cada quadro esteja separado por pelo menos 3 segundos.
2. Codifique cegamente e reordene aleatoriamente imagens de diferentes classes de cenários em sequência usando o arquivo de modelo fornecido chamado "shuffleSlides.pptm" (Arquivo Suplementar 1) e executando o código de macro inserido.
3. Convide pelo menos 10 palestrantes para pontuar as imagens de amostra.
4. Treine os membros do painel para pontuar amostras de imagem usando o MGS. Fornecer aos painelistas materiais de treinamento que incluam o artigo original sobre MGS e seu manual^15,16.
5. Calcule a pontuação MGS de cada animal em um quadro capturado, calculando a média de todos os pontos de pontuação das 5 AUs faciais correspondentes. Apresente o escore MGS como a média ± erro padrão de medida (EPM).
6. Determine se existem diferenças estatisticamente significativas entre diferentes classes de cenários por análise de variância (ANOVA) unidirecional com o teste post-hoc de comparação múltipla de Bonferroni.
   NOTA: Um valor de P < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O principal objetivo deste estudo é estabelecer uma estrutura robusta para investigar a interação paladar-cheiro em camundongos. Essa estrutura incorpora o uso de inteligência artificial e QBA para desenvolver um modelo de classificação preditiva. Além disso, os insights obtidos da DL são validados com uma avaliação quantitativa do MGS para uma análise interna independente. A principal aplicação desta metodologia é examinar a extensão da supressão da nocicepção invocada pelo wasabi quando os camundongos cheiram bebidas alcoólicas dietéticas.

Reconhecimento de 29% das imagens de cotratamento wasabi-álcool pertencentes à classe do grupo wasabi-negativo para licor positivo pelo modelo de deep learning
A reação exagerada facial pode ocorrer em humanos após o consumo comercial de pasta de wasabi. Uma experiência semelhante também pode ser observada em camundongos (Vídeo Suplementar 1). Como a nocicepção sensorial está bem correlacionada com as expressões faciais em roedores, os comportamentos de 2 irmãos de ninhada foram monitorados para determinar sua resposta quando fornecidos com alimentos contendo ou sem wasabi comercial. Neste estudo, uma CNN foi treinada usando técnicas de DL. Como 3 réplicas foram conduzidas para cada cenário, os materiais de imagem da^1ª e^3ª réplicas foram usados para ajuste de hiperparâmetros do modelo CNN e treinamento e teste interno de modelagem. A evolução da arquitetura da CNN neste estudo é detalhada na Tabela 2. A arquitetura otimizada da CNN consistia em uma camada de entrada com resolução de 268 x 268 pixels, seguida por 4 camadas de convolução bidimensionais, cada uma com 8 filtros. Além disso, 2 camadas de agrupamento, 2 camadas de dropout, uma camada de achatamento e 2 camadas densas foram incorporadas para a tarefa de classificação de 3 classes. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para a arquitetura CNN.

O modelo neste estudo foi treinado usando um conjunto de dados de 35.486 imagens e testado em 8.872 imagens ao longo de 7 épocas. O desempenho do modelo treinado durante o treinamento, incluindo métricas como perda, taxa de precisão-recall, precisão e sensibilidade (ou recall), nos conjuntos de dados internos de treinamento e teste pode ser visto na Figura Suplementar 8A-D. O modelo demonstrou sua exatidão, precisão e sensibilidade de 1 para conjuntos internos de treinamento e teste. Isso indica que as previsões do modelo se alinharam com as classes reais das imagens nos conjuntos de dados internos de treinamento e teste. Após o treinamento do modelo, as imagens da^2ª réplica foram usadas para garantir e validar de forma independente que o sobreajuste não era um problema para o modelo CNN alcançado. O modelo exibiu sua robustez de predição pelos valores de exatidão, precisão e sensibilidade de 1 para 4.820 imagens no estudo de fundo (cenário A), 3.900 imagens no estudo de controle positivo (cenário B) e 2.731 imagens no estudo de controle negativo (cenário D). O modelo preditivo alcançado foi implantado para classificar as imagens de quadros de vídeo de camundongos cheirando álcool e consumindo manteiga de amendoim contendo wasabi (cenário C) em diferentes cenários de estudo, ou seja, Cenários A, B e D. Os resultados mostram que 0% e 29% das imagens foram categorizadas nas classes de estudo de fundo (cenário A, água pura e manteiga de amendoim sem wasabi presentes) e estudo de controle negativo (cenário D, aguardente chinesa e manteiga de amendoim sem wasabi presentes), respectivamente, enquanto 71% das imagens foram classificadas como as classes de grupo controle positivo (cenário C, onde água pura e mistura de wasabi-manteiga de amendoim estavam presentes). Esses achados implicam que a presença de licor dietético pode reduzir a nocicepção evocada por wasabi em camundongos. Para avaliar o que a máquina aprendeu com os materiais de treinamento fornecidos, mapas de recursos foram gerados para cada camada de convolução. Conforme ilustrado na Figura Suplementar 9A-D, observou-se que a atenção da máquina estava focada em uma variedade de características faciais, como olhos orbitais, nariz, bordas da bochecha e do corpo, orelhas e também na superfície de contato dos chows. Com base nessas observações, outro método de análise de dados, o MGS, foi conduzido. O MGS se concentra nas AUs faciais de camundongos, permitindo uma avaliação estatística e posterior validação da capacidade de supressão da apresentação de bebidas alcoólicas à nocicepção induzida por wasabi.

A pontuação manual da escala de caretas do mouse valida estatisticamente as previsões de aprendizado de máquina.
A intensidade da nocicepção evocada por wasabi foi avaliada por meio do escore MGS, que atribui escores que variam de 0 a 2, sendo que o escore 0 representa o menos grave e o escore 2 indica a resposta mais grave. Neste estudo, os escores MGS de 24 camundongos (ou seja, 2 camundongos foram apresentados nas 12 imagens selecionadas como Figura Suplementar 10, Figura Suplementar 11, Figura Suplementar 12, Figura Suplementar 13 mostrada) foram avaliados por 22 painelistas treinados. A análise da ninhada de 2 camundongos, com experimentos triplicados, mostrou que as precisões intra-lote e as precisões inter-lote tiveram derivação padrão relativa variando de 0%-25% e 9%-33%, respectivamente. Isso indica boa precisão e consistência no processo de pontuação do MGS. Uma diferença significativa foi observada entre os escores MGS dos camundongos que receberam uma pasta de manteiga de amendoim (Figura 3A, 0,73 ± 0,04) e aqueles que receberam uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim (Figura 3B, 1,59 ± 0,11). Isso valida a configuração experimental para o estudo comportamental animal e confirma a eficácia do wasabi na indução de respostas nociceptivas. Embora o vapor de álcool liberado da bebida alcoólica fornecida por baixo (~ 42% v / v de álcool) possa ser irritante, o escore MGS (Figura 3D, 0,86 ± 0,16) não mostrou uma diferença significativa em comparação com o grupo controle (Figura 3A, 0,73 ± 0,04). No entanto, foi observada uma diferença significativa entre os escores MGS de camundongos que receberam a mistura de wasabi e manteiga de amendoim (Figura 3B, 1,59 ± 0,11) e aqueles expostos ao vapor de álcool durante o consumo de wasabi (Figura 3C, 0,95 ± 0,07) com um valor de P de <0,05. Essas descobertas sugerem que a co-aplicação de wasabi e bebidas alcoólicas pode potencialmente diminuir a irritação induzida por wasabi, alinhando-se com a perspectiva da inteligência artificial. Mais investigações são necessárias para explorar o ingrediente eficaz dentro do destilado chinês fornecido que contribui para a supressão da pungência de wasabi, provavelmente atribuível à presença de etanol.

Exemplo de código que já está disponível. Todo o código para executar o reconhecimento de imagem associado ao envio atual está disponível em um repositório público do GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Quaisquer atualizações também serão publicadas no Repositório GitHub com uma citação do DOI final deste trabalho.

Figura 1: Configuração experimental para o estudo comportamental animal relacionado à dor. (A) Toda a configuração para gravação de vídeo das expressões faciais de 2 camundongos usando as câmeras de 2 smartphones colocados no telefone fica em cada terminal. (B) A câmara dos chows costumava fornecer duas pastas de 0,5 g de manteiga de amendoim ou uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim para 2 camundongos ad libitum , e 30 mL de líquido (água ou ~ 42% v / v licor) foi preenchido na ranhura embaixo das pastas para inalação simultânea. (C) Um olhar mais atento do sulco que foi preenchido por 30 mL de líquido e continha 2 pastas de mistura de wasabi e manteiga de amendoim. A mistura foi preparada misturando 1 g de wasabi comercial em 4,5 g de manteiga de amendoim. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A arquitetura do modelo de rede neural convolucional e sua entrada e saída. Imagens de 3 cenários diferentes foram usadas para treinamento, incluindo o cenário A para o estudo de fundo, o cenário B para o estudo de controle positivo e o cenário D para o estudo de controle negativo. As imagens do cenário C para o estudo de interação sabor-cheiro wasabi-álcool foram classificadas nos cenários A, B ou D após o treinamento do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As pontuações da escala de caretas de camundongos (MGS) dos camundongos que receberam comidas diferentes. A pontuação MGS é de 0 a 2, com a pontuação 0 representando a menos grave e a pontuação 2 para a mais grave. A escala MGS de referência foi adaptada de Langford et al. (2010)¹⁶. A careta dos ratos que receberam (A) manteiga de amendoim para consumo marcou 0,73 ± 0,04; (B) uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim (1 g de wasabi comercial em 4,5 g de manteiga de amendoim) para ingestão pontuou 1,59 ± 0,11; (C) uma mistura de wasabi e manteiga de amendoim para ingestão, enquanto a inalação de álcool estava disponível a partir do destilado fornecido por baixo (~ 42% v / v de álcool), marcou 0,95 ± 0,07; (D) manteiga de amendoim para consumo enquanto a inalação de álcool estava disponível no destilado fornecido por baixo marcou 0,86 ± 0,16. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ns, sem diferença significativa por meio de análise de variância unidirecional com o teste post-hoc de comparação múltipla de Bonferroni sob intervalo de confiança de 95%. As barras de erro representaram o erro padrão de medidas (SEM). Medições triplicadas foram realizadas para 2 camundongos em cada cenário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Resumo dos quatro cenários mimetizados na avaliação comportamental animal. Observações: ^a A mistura foi preparada misturando 1 g de wasabi comercial em 4,5 g de manteiga de amendoim. ^b Aguardente chinesa que contém ~ 42% de álcool v / v. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Resumo do desempenho do modelo. Os hiperparâmetros de um tamanho de lote de 64, número de filtros da^1ª camada de convolução 2D de 8 sem abandono subsequente, número de filtros da^2ª camada de convolução 2D de 8, número de filtros da^3ª camada de convolução 2D de 8 com 0,1 abandono, número de filtros da^4ª camada de convolução 2D de 8, e o número de filtros da camada densa de 64 com 0,5 dropout produziu a menor perda para o conjunto de teste de divisão interna. Esses hiperparâmetros foram então adotados para treinar um modelo de classificação de 3 grupos (cenário A, B e D) para prever as imagens do cenário C. O cenário A foi para o estudo de fundo. O cenário B foi para o estudo de controle positivo. O cenário D foi para o estudo de controle negativo. O cenário C foi para o estudo de interação paladar-cheiro wasabi-álcool. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Exemplos de materiais de treinamento para aprendizado profundo da turma do cenário A (estudo de fundo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplos de materiais de treinamento para aprendizado profundo da turma do cenário B (estudo de controle positivo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Exemplos de materiais de treinamento para aprendizado profundo da turma do cenário D (estudo de controle negativo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Previsões e exemplos de materiais independentes da classe do cenário A (estudo de fundo) para validação do modelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Previsões e exemplos de materiais independentes da classe do cenário B (estudo de controle positivo) para validação do modelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Previsões e exemplos de materiais independentes da classe do cenário D (estudo de controle negativo) para validação do modelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 suplementar: Previsões e materiais de exemplo da classe do cenário C (estudo de interação sabor-cheiro wasabi-álcool) para aplicação do modelo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 8 suplementar: Desempenho preditivo do modelo ideal de aprendizado profundo. (A) Perda de treinamento e perda de validação interna ao longo de 7 épocas; (B) Curvas de precisão-recordação, (C) Precisão e (D) Recordação de treinamento e validação interna ao longo de 7 épocas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 9: Mapas de recursos de cada camada de convolução. Mapas de recursos da (A) primeira, (B) segunda, (C) terceira e (D) última camada de convolução nos cenários A, B e D, classificados em ordem de superior para inferior. O cenário A foi para o estudo de fundo. O cenário B foi para o estudo de controle positivo. O cenário D foi para o estudo de controle negativo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 10: Imagens selecionadas para pontuação manual da escala de caretas do mouse para o cenário A (estudo de fundo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 11: Imagens selecionadas para pontuação manual da escala de caretas do mouse para o cenário B (estudo de controle positivo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 12: Imagens selecionadas para pontuação manual da escala de caretas do mouse para o cenário C (estudo de interação sabor-cheiro de wasabi-álcool). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 13 suplementar: Imagens selecionadas para pontuação manual da escala de caretas do mouse para o cenário D (estudo de controle negativo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Caretas de ratos após o consumo de wasabi com a presença ou ausência de bebidas alcoólicas fornecidas por baixo. De 0 s a 8 s, o videoclipe apresentou as expressões faciais normais de camundongos ao consumir manteiga de amendoim. De 8 s a 17 s, ilustrou as caretas de ratos após a ingestão de wasabi. Os camundongos mostraram aperto orbital, protuberância do nariz, protuberância da bochecha, orelhas apertadas para fora e mudança de bigode. De 17 s a 29 s, mostrou que a nocicepção induzida por wasabi poderia ser suprimida quando o espírito estava disponível por baixo. De 29 s até o final, mostrou uma coleção de caretas em diferentes cenários descritos acima. Observe que o vídeo fornecido é usado apenas para ilustração. Sua qualidade é diferente do requisito de qualidade descrito para reconhecimento e modelagem de imagens. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: shuffleSlides.pptm. Apresentação suplementar habilitada para macro do Microsoft PowerPoint, chamada "shuffleSlides.pptm". Este arquivo foi preparado para embaralhar imagens para o teste cego de pontuação da escala de caretas de camundongos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: A arquitetura da CNN. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O método proposto para estudar a interação paladar-olfato neste trabalho é baseado no método original de codificação comportamental para expressão facial de dor em camundongos, desenvolvido por Langford et ^al.16. Vários artigos publicados recentemente introduziram a CNN para rastreamento automático de rosto do mouse e subsequente pontuação MGS 21,26,27,28. A aplicação de CNNs oferece uma vantagem sobre o método exclusivamente original, pois segue para a geração de uma série de imagens de quadro de vídeo que podem ser usadas para treinar um modelo de previsão. Em contraste, o método original exigia pré-selecionado um número limitado de imagens para MGS, o que pode introduzir subjetividade e viés.

Dentre os métodos baseados em CNN publicados anteriormente, todos foram desenvolvidos para avaliar o grau de angústia ou desconforto após a injeção direta de um agente causador de dor na circulação sanguínea ^26,28. Uma desvantagem dessa abordagem de introdução de drogas é que uma quantidade significativa de esforço é necessária para filtrar imagens de quadros de vídeo que não capturam o perfil facial do mouse. Neste estudo, o wasabi comercial do agente causador de nocicepção é fornecido ad libitum. Além de mascarar o ingrediente volátil AITC, a manteiga de amendoim também é capaz de atrair indivíduos de camundongos para apresentar um gesto claro de visão frontal, facilitando a captura de seus perfis faciais durante a gravação de vídeo. Além disso, essa abordagem elimina qualquer interferência potencial da dor causada pela inserção da agulha. No entanto, é importante observar que o movimento de ingestão dos camundongos pode interferir na pontuação MGS para protuberância do nariz e bochecha. Para resolver isso, um experimento de controle de linha de base deve ser conduzido, fornecendo aos camundongos manteiga de amendoim pura.

Em certos algoritmos baseados em CNN para estudo comportamental animal, apenas um subconjunto de unidades de ação facial de camundongos é selecionado a partir de imagens de treinamento e programado para ser capturado^21,22. Esses métodos computacionais dependem de recursos predefinidos associados à sensação de nocicepção, enquanto potencialmente negligenciam outros recursos importantes específicos de indivíduos de camundongos. Como resultado, pode levar à perda de informações. Em contraste, este estudo adota uma abordagem diferente ao usar toda a imagem do rosto do mouse para treinar um modelo CNN. Esse método baseado em uso somente de imagem (IOU) tem se mostrado mais eficiente para a classificação de imagens²⁵. Portanto, a abordagem de modelagem CNN proposta no presente estudo é semelhante a alguns métodos propostos que primeiro treinam um modelo CNN usando a imagem inteira sem anotação de região e, em seguida, validam o modelo por meio de avaliação humana manual^27,29. Essa abordagem pode reter mais informações nas imagens e evitar a introdução de subjetividade.

No entanto, uma limitação da configuração experimental neste trabalho é que os indivíduos de camundongos foram alojados como irmãos de ninhada de 2, e não em habitats individuais. Essa decisão foi intencional, considerando que os ratos são animais sociais e normalmente prosperam em ambientes de grupo. Um achado interessante é que, durante o período de treinamento dos animais, apenas 2 irmãos de ninhada em 1 gaiola de 3 gaiolas foram treinados para serem adaptados à presença do espírito chinês. Como resultado, apenas experimentos triplicados foram conduzidos exclusivamente nesses 2 irmãos de ninhada. Para os materiais de treinamento para modelagem CNN, uma imagem individual contendo 2 irmãos de ninhada também foi tomada como amostra individual sem realizar qualquer segmentação. Essa abordagem nos permitiu capturar a interação entre os irmãos de ninhada e analisar seus comportamentos junto com as expressões faciais coletivamente.

Semelhante ao método de pontuação MGS baseado em imagem, espera-se que o método proposto neste estudo possa ser transferível para outros tipos de animais, como felinos e cavalos^30,31. Ao aplicar a metodologia proposta, um método de introdução de alimentos indutores de alimentos com a aplicação de visão computacional pode ser uma abordagem para facilitar o estudo comportamental animal, especificamente para a interação paladar-cheiro em vários animais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol absoluto (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Tijolos de estireno de acrilonitrila butadieno	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
placas de estireno de butadieno de acrilonitrila	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
isotiocianato de alilo (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS # 57-06-7
Anidro dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	CAS # 67-68-5
Espírito chinês	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
wasabi comercial	S & B ALIMENTOS INC.
Ácido fórmico (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
acetonitrila de grau HPLC (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
Metanol de grau HPLC (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
sistema de água Milli-Q	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse:	Centro de Serviços para Animais de Laboratório ICR (Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Manteiga de amendoim	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Placas de acrílico transparente	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU