Aqui, mostramos que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem efetivamente excitar o Hoechst 33342 e servir como uma alternativa viável ao laser de 355 nm para detecção de células da população lateral (SP), expandindo assim a gama de lasers disponíveis em aplicações de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Detecção eficaz de células da população do lado de Hoechst por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). O método Hoechst SP é utilizado para o isolamento de células-tronco com base nas propriedades de efluxo de corante de transportadores de de ligação de ATP (ABC). O método foi inicialmente empregado para a identificação e isolamento de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), mas agora evoluiu para se concentrar principalmente na identificação e isolamento de células-tronco cancerígenas (CSCs). O método tradicional de detecção de FCM usa um laser de 355 nm para excitar o corante para detectar células SP. Por meio deste estudo, identificamos com sucesso abordagens alternativas para excitação de corante que podem efetivamente substituir a detecção de células SP usando um laser de 355 nm. Isso é conseguido através da utilização de lasers de alta potência de 375 nm ou 405 nm. Isso nos permite exercer seletividade aprimorada na detecção de células SP, em vez de nos limitarmos apenas à citometria de fluxo a laser de 355 nm.
Introdução
As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). As células SP são caracterizadas pelo bombeamento do corante de DNA fluorescente para fora das células através de seu transportador de de ligação a ATP (ABC) 1,2. O método foi originalmente estabelecido para isolar células-tronco hematopoiéticas (HSCs) da medula óssea murina1. As células SP da medula óssea foram enriquecidas com uma população de HSCs caracterizada porbaixa expressão de CD117+Sca-1+Lin-Thy1
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Protocolo
Os experimentos neste estudo utilizaram um total de 10 camundongos C57BL/6 com idades entre 8 e 12 semanas. As operações experimentais foram conduzidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan (#201609309). Os materiais experimentais e os parâmetros de citometria de fluxo usados neste artigo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento e coleta de células da medula óssea de camundongos
- Eutanásia de camundongos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais. Para induzir a inconsciência no camundongo, adm....
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Resultados
Na Figura 2, o grupo controle foi tratado com verapamil, que bloqueia os transportadores ABC nas células-tronco para evitar a eliminação de Hoechst 33342. Assim, as células-tronco do grupo não-verapamil expelem Hoechst 33342 e formam uma população de células negativas conhecidas como células SP. O laser de 355 nm excitou efetivamente o corante Hoechst 33342, resultando em uma observação clara das células SP da medula óssea (Figura 2A). As células SP das mesmas a.......
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Discussão
Usamos o protocolo descrito para realizar três experimentos, com cada tentativa envolvendo 3-4 camundongos, resultando em um total de 10 camundongos. A proporção de células SP variou de 0,05% a 0,76%. É importante notar que variações individuais foram observadas entre os camundongos. Utilizamos quatro citômetros de fluxo para analisar as amostras de Hoechst. Observa-se que a excitação do corante Hoechst por um laser de 20 mW de 355 nm na nova versão da citometria de fluxo é equivalente à de um laser de 100 mW de 355 nm n.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas doações a J.H. da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 81800207). A assistência da Beckman Coulter, Inc. no fornecimento de suporte para citometria de fluxo e calibração de parâmetros é muito apreciada. Agradecemos a Jiao Chen, do Laboratório Estadual de Doenças Bucais do Hospital de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan, e Yu Qi, do Centro de Pesquisa em Medicina Regenerativa, Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan, por sua assistência na aquisição de dados de citometria de fluxo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Contador de células automático | Countstar | 1M1200 | |
| Cell Filter(100 µ m) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| Fluorosferas de controle de qualidade diário | Beckman Coulter | B5230 | |
| Modificação de Dulbecco do meio de Eagle com 4,5 g / L de glicose (meio DMEM) | CORNING | 10-013-CVRC | |
| Soro fetal bovino | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iodeto de propídio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Beyotime | C3702 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Referências
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
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Reimpressões e permissões
