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Detecção eficaz de células da população do lado de Hoechst por citometria de fluxo

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DOI:

10.3791/67012

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23 de agosto de 2024

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

Neste artigo

Resumo

Aqui, mostramos que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem efetivamente excitar o Hoechst 33342 e servir como uma alternativa viável ao laser de 355 nm para detecção de células da população lateral (SP), expandindo assim a gama de lasers disponíveis em aplicações de citometria de fluxo.

Resumo

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). O método Hoechst SP é utilizado para o isolamento de células-tronco com base nas propriedades de efluxo de corante de transportadores de de ligação de ATP (ABC). O método foi inicialmente empregado para a identificação e isolamento de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), mas agora evoluiu para se concentrar principalmente na identificação e isolamento de células-tronco cancerígenas (CSCs). O método tradicional de detecção de FCM usa um laser de 355 nm para excitar o corante para detectar células SP. Por meio deste estudo, identificamos com sucesso abordagens alternativas para excitação de corante que podem efetivamente substituir a detecção de células SP usando um laser de 355 nm. Isso é conseguido através da utilização de lasers de alta potência de 375 nm ou 405 nm. Isso nos permite exercer seletividade aprimorada na detecção de células SP, em vez de nos limitarmos apenas à citometria de fluxo a laser de 355 nm.

Introdução

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). As células SP são caracterizadas pelo bombeamento do corante de DNA fluorescente para fora das células através de seu transportador de de ligação a ATP (ABC) 1,2. O método foi originalmente estabelecido para isolar células-tronco hematopoiéticas (HSCs) da medula óssea murina1. As células SP da medula óssea foram enriquecidas com uma população de HSCs caracterizada porbaixa expressão de CD117+Sca-1+Lin-Thy1 3,4. Depois disso, o método foi amplamente utilizado para isolar e enriquecer células-tronco de outros tecidos, incluindo músculo cardíaco5, fígado6, pulmão7, rim8 e prosencéfalo9. Em particular, o método foi aplicado para isolar células-tronco cancerígenas (CSCs) na última década. As CSCs representam uma pequena população de células que possuem as propriedades de iniciação tumoral, auto-renovação, resistência à quimioterapia e potencial metastático10. As CSCs foram inicialmente identificadas em neoplasias hematopoiéticas11 e posteriormente observadas em vários tumores sólidos, como carcinomas de próstata12, ovário13, gástrico14, mama15 e pulmão16. Apesar da disponibilidade de várias técnicas para identificação de CSC, a técnica SP continua sendo uma escolha preferida devido à sua ampla aplicabilidade em diversos tecidos e linhagens celulares. Além disso, é uma técnica valiosa que isola CSCs usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)16,17,18. Os achados experimentais demonstram que as células SP exibem tumorigenicidade pronunciada e exibem níveis elevados de expressão de genes associados a células-tronco19,20. Nosso estudo anterior21 também demonstrou que a análise transcriptômica de células SP isoladas no mieloma múltiplo revela enriquecimento das vias de sinalização associadas às células-tronco, como a via hedgehog. Enquanto isso, realizamos análises de enriquecimento de vias nos genes diferencialmente expressos nas células SP da leucemia mielóide aguda22. Os genes alterados foram enriquecidos em vias relacionadas a células-tronco (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Descobrimos que 1 x 105 células SP poderiam formar tumores em camundongos BALB/c nulos22, enquanto as células não-SP não podiam, indicando que as células SP tinham características de células-tronco de leucemia. A eficácia do método Hoechst SP na identificação de CSCs é evidente.

O protocolo Hoechst SP foi refinado e aprimorado através da progressão da pesquisa. O protocolo envolve um controle rigoroso da concentração do corante, densidade celular, temperatura e duração da incubação, composição do tampão e valor do pH. As amostras de células preparadas de acordo com este protocolo foram submetidas à análise por citometria de fluxo. Devido à excitação do corante Hoechst com um laser UV a 355 nm e à detecção de sua emissão de fluorescência usando um filtro de 690/50 nm (Hoechst Red) e um filtro de 450/50 nm (Hoechst Blue), um laser de 350 nm é necessário para FCM. No entanto, os lasers de 350 nm não são comumente equipados na maioria dos FCMs devido ao seu alto custo. Assim, tentamos encontrar uma abordagem alternativa para a excitação do corante para a detecção efetiva de células SP por citometria de fluxo. Neste estudo, a capacidade dos lasers de 375 nm e 405 nm na detecção de células SP foi avaliada e comparada com a do laser de 355 nm. Nossos achados demonstram uma notável semelhança entre as células SP detectadas pelos lasers de 355 nm, 375 nm e 405 nm. Esses resultados sugerem que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem servir como alternativas viáveis ao laser de 355 nm para detecção de células SP. A inclusão de fontes de luz de excitação adicionais para Hoechst 33342 facilita o uso de mais modelos de citometria de fluxo.

Protocolo

Os experimentos neste estudo utilizaram um total de 10 camundongos C57BL/6 com idades entre 8 e 12 semanas. As operações experimentais foram conduzidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan (#201609309). Os materiais experimentais e os parâmetros de citometria de fluxo usados neste artigo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e coleta de células da medula óssea de camundongos

  1. Eutanásia de camundongos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais. Para induzir a inconsciência no camundongo, administre anestésicos inalatórios começando com isoflurano a 2%, seguido por um aumento gradual na dose para isoflurano a 5% até a cessação da respiração.
  2. Disseque os ratos na sala cirúrgica ou no armário de exaustão. Limpe e esterilize os camundongos com etanol 70%.
  3. Corte completamente a pele e o músculo da perna com uma tesoura afiada e disseque os fêmures.
  4. Esmague o fêmur suavemente com uma haste de moagem em um pilão e lave as células da medula óssea com meio DMEM até que o osso fique branco.
  5. Filtrar as células da medula óssea obtidas com um filtro de 100 μm para tubos de 15 ml. Centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C.
  6. Descarte o sobrenadante e lise os glóbulos vermelhos residuais com 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos por 1 min a 4 ° C. Centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C. Após centrifugação, lave novamente com meio DMEM.
  7. Ressuspenda as células em 2 mL de solução de incubação (meio DMEM + 5% FBS), conte as células com um contador automático de células e ajuste a concentração celular para 1,0 x 106 células/mL com solução de incubação.

2. Coloração celular

  1. Suplementar 2 ml de suspensão de células da medula óssea de cada ratinho com 5 μg/ml de Hoechst 33342. A outra alíquota de 1 ml, adicionar 100 μM de verapamil como controlo negativo.
  2. Incubar em banho-maria a 37 °C durante 90 min com agitação suave de 30 em 30 min.
  3. Após a incubação, arrefecer as células em gelo durante 5 min e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células em uma solução de funcionamento a frio (HBSS + 2% FBS). Centrifugar a 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
  4. Ressuspenda o grânulo celular resultante em 500 μL de solução corrente por amostra. Antes da análise FCM, suplemente as células com 2 μg/mL de iodeto de propídio (PI) e coloque no gelo por aproximadamente 5 min.

3. Citometria de fluxo

NOTA: Para obter um resumo dos vários sistemas e configurações usados, consulte a Tabela 1.

  1. Calibre os valores do coeficiente de variação (CV) dos canais necessários usando fluoroesferas de controle de qualidade (CQ) diárias nos FCMs e realize testes de amostra após a conclusão bem-sucedida do controle de qualidade.
    1. Selecione o atalho da área de trabalho do software e inicie o software.
    2. Selecione Iniciar CQ/Padronização no menu CQ/Padronização para acessar o experimento de CQ.
    3. Insira o tubo de amostra de fluoroesferas QC no suporte do tubo.
    4. Selecione Iniciar para carregar o exemplo e começar a executar o procedimento de controle de qualidade. Os FCMs estão prontos para uso após a aprovação do CQ.
  2. Excite o corante Hoechst 33342 das mesmas amostras com um laser de 355 nm, 375 nm e 405 nm, respectivamente, para detecção de vermelho Hoechst no canal de 690/50 nm e azul Hoechst no canal de 450/50 nm.
    1. Crie um novo experimento selecionando Novo experimento no menu Arquivo, especifique o caminho do arquivo e salve o experimento.
    2. Selecione Definir canal no menu Configurações. Marque a caixa de seleção do sinal do canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) e adicione o nome do reagente na coluna Rótulo (Y585: PI; V450: Hoechst Blue-405 nm; V660: Hoechst vermelho-405 nm; NUV450: Hoechst Blue-375 nm; NUV660: Hoechst Blue-375 nm; UV450: Hoechst Azul-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).
    3. Clique nos ícones Pseudo Color Plots na área de plotagem para criar plotagens. Selecione um nome de eixo para alterar qual canal é exibido.
    4. Clique em Adicionar tubo na tela Tubo de ensaio para criar novos tubos de amostra e alterar seus nomes.
    5. Selecione Executar para carregar a amostra, exibir as plotagens e estabelecer as portas. Ajuste as configurações de ganho e limite. Selecione Gravar para salvar os dados.
  3. Projete a lógica de configuração do portão.
    1. Para o primeiro gráfico, clique no eixo X para selecionar FSC-W e clique no eixo Y para selecionar FSC-A. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta A para circundar a célula individual e excluir as células aderentes (Figura 1A).
    2. Para o segundo gráfico, clique no eixo X para selecionar FSC-A e clique no eixo Y para selecionar SSC-A. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta B para separar células não fragmentárias e excluir detritos celulares (Figura 1B).
    3. Para o terceiro gráfico, clique no eixo X para selecionar PI-A e clique no eixo Y para selecionar SSC-A. Selecione a porta do polígono para desenhar a porta D. Selecione células vivas exibindo PI negativo (Figura 1C) e desenhe a porta C para obter células vivas.
    4. Para o quarto gráfico bidimensional, clique no eixo X para selecionar Hoechst Red e clique no eixo Y para selecionar Hoechst Blue. Clique com o botão direito do mouse em Plotagem e selecione Propriedade no menu suspenso. Selecione Formato linear fou ambos os eixos X e Y. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta SP para obter células SP (Figura 1D).
  4. Para avaliar a elegibilidade da amostra, use 355 nm de um citômetro de fluxo específico23 para detecção de células SP.
  5. Use os lasers de 355 nm (potência do laser: 20 mW) e 405 nm (potência do laser: 80 mW) simultaneamente para detectar as células de controle (com adição de verapamil) e as células experimentais.
  6. Adquira sinais de fluorescência nos canais de 690/50 nm e 450/50 nm correspondentes aos dois lasers. Observe a estimulação efetiva do corante Hoechst 33342 por lasers de 355 nm e 405 nm com células SP transparentes ( Figura 2B-C ).
  7. Para as mesmas amostras, use os lasers de 375 nm (potência do laser: 60 mW) e 405 nm (potência do laser: 80 mW) para detecção de células.

Resultados

Na Figura 2, o grupo controle foi tratado com verapamil, que bloqueia os transportadores ABC nas células-tronco para evitar a eliminação de Hoechst 33342. Assim, as células-tronco do grupo não-verapamil expelem Hoechst 33342 e formam uma população de células negativas conhecidas como células SP. O laser de 355 nm excitou efetivamente o corante Hoechst 33342, resultando em uma observação clara das células SP da medula óssea (Figura 2A). As células SP das mesmas amostras detectadas pelo laser de 355 nm e pelo laser de 405 nm foram consideradas essencialmente idênticas (Figura 2D).

A partir da Figura 2 e da Figura 3, vimos que outros modelos de medidores de vazão não tradicionais também podem identificar células SP. Os resultados indicam que os lasers de 375 nm e 405 nm excitaram efetivamente o Hoechst 33342 para obter células SP ( Figura 3A-B ). Quando é necessário detectar ou isolar CSCs ou HSCs, podemos optar por um laser de 375 nm ou 405 nm em vez de um laser de 355 nm.

figure-results-1
Figura 1: Lógica de configuração de porta baseada em citometria de fluxo para detectar células SP. (A) FSC-A e FSC-W foram utilizados para excluir células aderentes. A porta A representa o cluster de célula única. (B) Os parâmetros de FSC-A e SSC-A foram empregados para a remoção de detritos celulares. A porta B representa o aglomerado de células não fragmentário. (C) Células vivas exibindo iodeto de propídio (PI) negativo foram selecionadas. A porta C representa o aglomerado de células vivas. (D) Os sinais de fluorescência foram adquiridos através dos canais de 690/50 nm (Hoechst-vermelho) e 450/50 nm (Hoechst-azul). A porta SP representa o cluster de células SP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O laser de 405 nm de alta potência detecta células SP com a mesma eficácia que o laser de 355 nm. (A) O corante Hoechst 33342 foi excitado pelo laser de 355 nm de um citômetro de fluxo convencional para detectar as células SP da medula óssea. (B, C) As células SP da medula óssea foram identificadas pelos lasers de 355 nm e 405 nm do mesmo FCM. (D) As células SP das mesmas amostras detectadas pelo laser de 355 nm e pelo laser de 405 nm foram consideradas essencialmente idênticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm são capazes de detectar células SP. (A) O laser de alta potência de 375 nm pode detectar células SP. (B) As células SP da medula óssea também podem ser detectadas utilizando os lasers de 405 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de laserComprimento de onda do laser (nm)Potência do laser (mW)Filtro vermelho Hoechst (nm)Filtro azul Hoechst (nm)
Moflo Astrios EQGás argônio355100692/75448/59
CytoFLEX LXSemicondutor35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX SSemicondutor37560690/50450/50
CytoFLEX SRTSemicondutor40580690/50450/50

Tabela 1: Resumo das configurações do citômetro de fluxo.

Discussão

Usamos o protocolo descrito para realizar três experimentos, com cada tentativa envolvendo 3-4 camundongos, resultando em um total de 10 camundongos. A proporção de células SP variou de 0,05% a 0,76%. É importante notar que variações individuais foram observadas entre os camundongos. Utilizamos quatro citômetros de fluxo para analisar as amostras de Hoechst. Observa-se que a excitação do corante Hoechst por um laser de 20 mW de 355 nm na nova versão da citometria de fluxo é equivalente à de um laser de 100 mW de 355 nm na citometria de fluxo à moda antiga. Esse fenômeno pode ser atribuído à variação nos tipos de laser empregados em ambos os sistemas. A razão potencial para o efeito observado dos lasers de 375 nm e 405 nm pode ser atribuída à potência substancial de ambos os lasers em conjunto com a utilização do detector de fotodiodo de avalanche (APD). O canal Hoechst Red-A capturou o comprimento de onda longo quase vermelho de 690 nm, onde a eficiência de conversão fotoelétrica do tubo fotomultiplicador (PMT) era relativamente baixa. No entanto, o APD demonstrou uma eficiência de conversão fotoelétrica aproximadamente dez vezes maior que a do PMT24. Portanto, quando combinados com lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm, os detectores APD distinguem eficientemente as células SP. O laser de 405 nm não apenas detecta efetivamente as células SP, mas também exibe capacidade superior em distinguir um subconjunto de populações fracamente positivas de Hoechst Red em comparação com o laser de 355 nm.

A etapa crítica do protocolo é usar citometria de fluxo com um laser de 375 nm ou um laser de 455 nm para detectar células com canais de 690/50 nm (Hoechst-vermelho) e 450/50 nm (Hoechst-azul). Enquanto a técnica detecta células SP com lasers de 375 nm e 405 nm em vez de laser de 355 nm (laser tradicional para análise de células SP1), que são mais comuns em FCMs, são necessários lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm. Isso leva às limitações dessa tecnologia. O significado do método é expandir a gama de lasers usados para detectar corantes Hoechst para que outros modelos de citometria de fluxo possam ser usados para detecção de células SP.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelas doações a J.H. da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 81800207). A assistência da Beckman Coulter, Inc. no fornecimento de suporte para citometria de fluxo e calibração de parâmetros é muito apreciada. Agradecemos a Jiao Chen, do Laboratório Estadual de Doenças Bucais do Hospital de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan, e Yu Qi, do Centro de Pesquisa em Medicina Regenerativa, Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan, por sua assistência na aquisição de dados de citometria de fluxo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Contador de células automáticoCountstar1M1200
Cell Filter(100 µ m)BIOFILCSS-013-100
Fluorosferas de controle de qualidade diárioBeckman CoulterB5230
Modificação de Dulbecco do meio de Eagle com 4,5 g / L de glicose (meio DMEM)CORNING10-013-CVRC
Soro fetal bovinoCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Iodeto de propídio (PI)Sigma-AldrichP4170
Tampão de lise de glóbulos vermelhosBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

Referências

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