Artigo de método

Atividade semelhante a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas usando um sistema complementar de matriz de microeletrodos de alta densidade com semicondutor de óxido metálico

DOI:

10.3791/67065

⸱

27 de setembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Brigham Young University, 2Neuroscience Center, Brigham Young University, 3Department of Statistics, Brigham Young University, 4Department of Biology, Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy, Brigham Young University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de semicondutores de óxido metálico (CMOS-HD-MEAs) para registrar a atividade semelhante a convulsões de fatias cerebrais ex vivo .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de óxido metálico-semicondutor (CMOS-HD-MEA) podem registrar a atividade neurofisiológica de culturas de células e fatias cerebrais ex vivo em detalhes eletrofisiológicos sem precedentes. Os CMOS-HD-MEAs foram otimizados pela primeira vez para registrar a atividade da unidade neuronal de alta qualidade a partir de culturas de células, mas também demonstraram produzir dados de qualidade a partir de cortes agudos de retina e cerebelar. Os pesquisadores usaram recentemente CMOS-HD-MEAs para registrar potenciais de campo local (LFPs) de fatias cerebrais agudas de roedores corticais. Um LFP de interesse é a atividade semelhante a convulsões. Embora muitos usuários tenham produzido descargas epileptiformes breves e espontâneas usando CMOS-HD-MEAs, poucos usuários produzem de forma confiável atividade semelhante a convulsões de qualidade. Muitos fatores podem contribuir para essa dificuldade, incluindo ruído elétrico, a natureza inconsistente de produzir atividade semelhante a convulsões ao usar câmaras de gravação submersas e a limitação de que os chips 2D CMOS-MEA registram apenas a partir da superfície da fatia do cérebro. As técnicas detalhadas neste protocolo devem permitir que os usuários induzam e registrem consistentemente atividades semelhantes a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas com um sistema CMOS-HD-MEA. Além disso, este protocolo descreve o tratamento adequado dos chips CMOS-HD-MEA, o gerenciamento de soluções e fatias cerebrais durante a experimentação e a manutenção do equipamento.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os sistemas de matriz de microeletrodos de alta densidade (HD-MEA) disponíveis comercialmente, que incluem um chip MEA com milhares de pontos de gravação 1,2 e uma plataforma MEA para amplificar e digitalizar os dados, são uma ferramenta emergente para a pesquisa eletrofisiológica. Esses sistemas HD-MEA usam tecnologia de semicondutor de óxido metálico complementar (CMOS) para registrar dados eletrofisiológicos com alta sensibilidade de culturas de células e preparações de fatias cerebrais ex vivo. Esses sistemas MEA oferecem resolução espacial e temporal sem precedentes para pesquisas neurofisiológicas por meio de alta densidade de eletrodos e relações sinal-ruídode qualidade 3. Essa tecnologia tem sido usada principalmente para estudar potenciais de ação extracelulares, mas também pode capturar potenciais de campo local (LFPs) de alta qualidade de várias preparações neuronais de fatias cerebrais 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Devido à capacidade de gravação de alta resolução dos sistemas CMOS-HD-MEA mencionada acima, os usuários podem rastrear a atividade eletrofisiológica com grande precisão espacial 16,17,18. Esse recurso é particularmente relevante para rastrear padrões de propagação de LFPs de rede 5,12,15,19,20,21. Portanto, os sistemas CMOS-HD-MEA podem fornecer uma compreensão sem precedentes dos padrões de propagação da atividade fisiológica e patológica de várias culturas de células e preparações de fatias de cérebro. É importante notar que esses recursos dos sistemas CMOS-HD-MEA podem permitir que os pesquisadores contrastem os padrões de convulsões de diferentes regiões do cérebro simultaneamente e testem como vários compostos antiepilépticos afetam esses padrões. Ao fazer isso, fornece um método inovador para estudar a ictogênese e a propagação ictal e para entender como a farmacologia interrompe a atividade patológica da rede 7,10,14. Portanto, essas novas capacidades dos sistemas CMOS-HD-MEA podem contribuir significativamente para a pesquisa de distúrbios neurológicos, bem como auxiliar na pesquisa de descoberta de medicamentos 5,7,11,22. Nosso objetivo é fornecer detalhes sobre o uso de sistemas CMOS-HD-MEA para estudar a atividade semelhante a convulsões.

Ao usar sistemas CMOS-HD-MEA para estudar LFPs, como a atividade epileptiforme em fatias cerebrais agudas, os usuários podem enfrentar muitos desafios, incluindo ruído elétrico debilitante, manter a fatia saudável durante a experimentação e detectar um sinal de qualidade de um chip CMOS-MEA bidimensional (2D) que grava apenas da superfície da fatia cerebral. Este protocolo descreve as etapas básicas para o aterramento adequado da plataforma MEA e outros equipamentos usados na experimentação, uma etapa crucial que pode exigir personalização individual para cada configuração de laboratório. Além disso, discutimos as etapas para ajudar a manter o corte cerebral saudável durante longas gravações nas câmaras submersas usadas com os sistemas CMOS-HD-MEA 23,24,25. Além disso, em contraste com os métodos de gravação eletrofisiológica mais comuns, que registram profundamente a fatia do cérebro, a maioria dos sistemas CMOS-HD-MEA usa chips 2D que não penetram na fatia. Portanto, esses sistemas requerem uma camada externa neuronal saudável para produzir a maioria dos sinais LFP registrados. Outros desafios incluem a visualização da enorme quantidade de dados gerados por milhares de eletrodos. Para superar esses desafios, recomendamos um protocolo simples, mas eficaz, que aumente a probabilidade de alcançar uma atividade epileptiforme de rede de alta qualidade que se propaga pela fatia cerebral. Também incluímos uma breve descrição de uma interface gráfica do usuário (GUI) disponível publicamente que desenvolvemos com recursos associados para auxiliar na visualização de dados10.

Publicações anteriores forneceram protocolos relacionados para o uso de sistemas de registro MEA 26,27,28,29. No entanto, este trabalho visa auxiliar os experimentadores que usam sistemas CMOS-HD-MEA com chips 2D, especificamente aqueles que buscam estudar a atividade epileptiforme de alta qualidade a partir de fatias de cérebro. Além disso, comparamos duas das manipulações de solução mais comuns para indução de atividade semelhante a convulsões, ou seja, os paradigmas 0 Mg2+ e 4-AP, para ajudar os usuários a identificar os meios convulsivantes mais apropriados para sua aplicação específica. Embora o protocolo seja focado principalmente na geração de atividade semelhante a convulsões, ele pode ser modificado para explorar outros fenômenos eletrofisiológicos usando fatias de cérebro.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os procedimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Brigham Young. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas (n = 8) com idade mínima de P21 foram utilizados nos experimentos a seguir.

figure-protocol-1
Figura 1: Figura esquemática da experimentação CMOS-HD-MEA. (A) A fatia do cérebro é preparada pelo método de corte preferido e subdissecada para caber no MEA. (B) Prepare as soluções e o chip CMOS-HD-MEA. (C) A fatia de cérebro subdissecada é colocada no feixe de eletrodos e banhada nas soluções apropriadas. (D) Os canais relevantes são selecionados a partir dos dados coletados. Os dados são então preparados para análise no programa preferido do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NomeConcentração (mM)g/L
Cloreto de sódio (NaCl)1267.36
Cloreto de potássio (KCl)3.50.261
Fosfato de di-hidrogênio sódico (NaH2PO4)1.260.151
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)262.18
Glicose (C6H12O6)101.80
Cloreto de magnésio (MgCl2)1 (de 1 M estoque)1 mL
Cloreto de cálcio (CaCl2)2 (a partir de 1 M de estoque)2 mL

Tabela 1: Solução de aCSF.

1. Preparando soluções

  1. Prepare as soluções experimentais.
    1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) (consulte a Tabela 1 para obter detalhes).
    2. Prepare 1 L de solução pró-convulsivante.
      NOTA: As soluções usadas para gerar atividade semelhante a convulsões neste protocolo utilizaram aCSF com 100 μM de 4-aminopiridina (4-AP) ou aCSF livre de íons de magnésio.
    3. Carbogenar todas as soluções por pelo menos 10 minutos antes de usar pedras porosas.
    4. Obter um copo para rejeitar as soluções.
    5. Colocar 1 L de aCSF, 1 L de solução pró-convulsivante e o copo de descarte numa superfície próxima do sistema de perfusão.
  2. Preparando as soluções de câmara de corte e retenção
    1. Prepare 0,5 L de aCSF, omitindo CaCl2 e adicionando 3 mM MgCl2 (em oposição a 1 mM) para criar uma solução de corte única. Guarde esta solução para uso na preparação de fatias de cérebro de roedores, colocando-a perto da área de preparação de fatias de cérebro agudas.
    2. Prepare 0,5 L de aCSF e coloque-o em uma câmara de retenção de tecido que será usada para reter fatias para uso em experimentação. Insira pedras porosas na câmara de retenção de tecido e carbogene a solução por pelo menos 10 minutos antes de colocar as fatias subdissecadas na câmara.

2. Preparando fatias de cérebro de roedor

  1. Prepare todas as soluções conforme descrito acima (ver secção 1). Certifique-se de que todas as soluções estejam devidamente carbogenadas durante o processo de preparação.
    NOTA: A solução de corte (consulte a seção 1.2) é recomendada, mas outras soluções de corte podem ser usadas para obter fatias de cérebro de qualidade, como uma solução de corte desacarose 30.
  2. Use um micrótomo vibratório para fazer fatias de cérebro de roedor de 350 μm. Os protocolos para uso desses instrumentos estão listados nas referências 30,31,32,33.
  3. Prepare as fatias de cérebro de roedor para caber na área do eletrodo de gravação do chip MEA (veja a Figura 2). Use uma lâmina cirúrgica tamanho 10 para subdissecar as fatias, conforme mostrado na Figura 1A e na Figura 2A , rolando suavemente a lâmina para frente e para trás na fatia do cérebro. Execute a subdissecção na câmara de corte do micrótomo vibratório. Tenha cuidado para não danificar a fatia cerebral subdissecada.
  4. Colocar as fatias subdissecadas numa câmara de fixação de tecido cheia de aCSF. Certifique-se de que a câmara foi carbogenada por pelo menos 10 minutos antes de adicionar as fatias subdissecadas.

3. Preparação do equipamento

  1. Preparando os chips e o sistema MEA (Figura 2 e Figura 3)
    NOTA: Materiais duros como plásticos e metais podem danificar facilmente o chip MEA se entrarem em contato com força com a parte inferior do chip. Ao usar pipetas para transferir a solução para dentro ou para fora dos chips, não entre em contato com a parte inferior do poço do chip com a pipeta, especialmente os eletrodos de referência nas laterais do poço do chip e os eletrodos de registro no centro do poço do chip (Figura 2C). Em vez disso, adicione a solução passando o mouse sobre a parte inferior do poço de cavacos ou entrando em contato ou aproximando as bordas plásticas do poço de cavacos. Para retirar toda a solução facilmente, incline levemente o cavaco para permitir que a solução se acumule em um lado do poço e remova-o do topo da solução agrupada ou use um pano antiestático para enxugar levemente as áreas que ainda têm a solução. Não transporte o cavaco segurando o poço do cavaco ou os pinos do cavaco (Figura 2C). O poço de cavacos pode conter aproximadamente 4 mL de solução. Para as etapas subsequentes, encha bem o cavaco com aproximadamente 2 mL de solução, se não especificado de outra forma.
    1. Designe pipetas de transferência para várias tarefas antes de iniciar a preparação do cavaco. Rotule uma pipeta de transferência para etanol, uma para resíduos, outra para aCSF e outras para quaisquer soluções restantes para evitar a mistura não intencional.
    2. Encha o poço do chip MEA com etanol à prova de 190 para que o fundo do poço do chip fique completamente coberto (Figura 3). Deixe o etanol descansar por 30-60 s e remova-o com uma pipeta de descarte.
    3. Encha o poço do chip MEA com aCSF e remova-o com uma pipeta de descarte para enxaguar o etanol residual do poço do chip. Adicione e remova o aCSF do poço de cavacos três vezes, usando as pipetas de resíduos e aCSF previamente designadas. Depois de lavar bem o chip três vezes, adicione aCSF e deixe repousar por pelo menos 30 s.
      NOTA: Os eletrodos de registro exibem a menor quantidade de ruído de interações hidrofóbicas quando o aCSF permanece na câmara por pelo menos 45 min após o enxágue com etanol e aCSF.
    4. Antes de encaixar o chip MEA, molhe um pano antiestático com etanol à prova de 190 e use-o para limpar os pinos do chip (Figura 2C).
    5. Deslize suavemente o chip MEA na plataforma MEA e engate o mecanismo de encaixe para travar o chip no lugar.
    6. Verifique se há bolhas nos eletrodos de registro e referência (Figura 2C). Se houver bolhas, pegue um pincel limpo e passe levemente sobre os eletrodos para removê-los.
    7. Verifique se há ruído no chip usando o software CMOS-HD-MEA34 e escaneie visualmente o mapa de cores falsas em busca de bolhas, oscilações não biológicas ou picos causados por interferência elétrica. Aterre o sistema MEA adequadamente para negar qualquer ruído encontrado.
      NOTA: A configuração de aterramento dependerá do ambiente de gravação. Para os experimentos deste protocolo, a plataforma MEA e o sistema de perfusão foram aterrados.

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Figura 2: Diagramas de configuração e tecnologia. (A) Diagrama da seleção de fatias agudas de cérebro de camundongo usadas no experimento destacado por este protocolo. (1) Região do hipocampo (2) Região do neocórtex. (B) A colocação adequada de uma fatia aguda de cérebro de camundongo e harpa no microeletrodo Array (MEA). (C) A anatomia de um chip 3Brain Accura CMOS-HD-MEA. (D) A configuração adequada das entradas e saídas de perfusão. A entrada deve estar no fundo do poço do chip, enquanto a saída deve estar no lado oposto da entrada na parte superior do poço do chip para garantir um fluxo constante de aCSF fresco e oxigenado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Diagrama esquemático de preparação e colocação de chips para experimentos de fatias de cérebro. (A) Enxágue bem o chip com etanol uma vez e depois com aCSF três vezes. (B) Limpe os pinos com etanol usando um pano antiestático. (C) Encaixe o chip. (D) Coloque a fatia do cérebro nos eletrodos. (E) Coloque a harpa na fatia do cérebro (consulte a Figura 2 para obter as diretrizes de colocação adequadas). (F) Enxugue o canto do poço dos eletrodos de gravação perto da fatia do cérebro com um pano antiestático torcido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Experimentação

  1. Colocando a fatia do cérebro
    1. Coloque uma harpa de platina em um barco de pesagem (ou outra superfície limpa) perto da plataforma MEA. Cubra a harpa com cerca de 3mL de aCSF para reduzir suas tendências hidrofóbicas.
    2. Use uma tesoura para remover a parte fina da ponta de uma pipeta de transferência. Corte um terço, cerca de 1,5 pol., da ponta da pipeta.
      NOTA: Esta pipeta modificada não contrai ou danifica a fatia do cérebro durante a coleta e o transporte.
    3. Colete uma fatia de cérebro da câmara de retenção da fatia com a pipeta modificada. Dispense suavemente a fatia de cérebro e qualquer solução da pipeta no poço do cavaco. Para posicionar a fatia corretamente, libere suavemente mais aCSF de uma pipeta de transferência para manipular a posição da fatia do cérebro ou use um pincel macio para criar uma corrente na solução que empurra a fatia do cérebro para os eletrodos de gravação. Limite o contato com os eletrodos de gravação ou fatia do cérebro para minimizar os danos.
    4. Usando uma pinça, coloque suavemente a harpa sobre a fatia do cérebro com os fios para baixo para pressionar a fatia nos eletrodos de gravação. Evite entrar em contato com o feixe de eletrodos com a harpa. Oriente a harpa de forma que o lado sem armação fique voltado para a agulha de entrada e a armação da harpa não entre em contato com nenhum dos eletrodos de gravação (Figura 2C, D).
    5. Pegue uma pipeta de descarte e remova o excesso de aCSF. Pegue um pano antiestático, gire um canto para criar uma ponta e use-o para absorver o aCSF restante ao redor dos eletrodos de gravação sem tocar nos eletrodos de gravação, fatia de cérebro ou harpa (Figura 2).
    6. Usando uma pipeta de aCSF designada, adicione rapidamente aCSF carbogenado suficiente para cobrir a fatia do cérebro, cerca de 2 mL.
    7. Repita a etapa 4.1.5. e 4.1.6. mais duas vezes.
    8. Encha o poço com aCSF carbogenado até que o poço esteja aproximadamente 3/4 cheio, cerca de 3 mL.
    9. Tire uma foto da fatia do cérebro no chip MEA com um microscópio ou câmera. Certifique-se de que a foto tenha uma resolução alta o suficiente para ver as bordas do conjunto de eletrodos de gravação e a anatomia da fatia do cérebro.
  2. Executando o experimento
    1. Operando o sistema de perfusão
      1. Coloque os tubos de entrada e saída no béquer cheio de aCSF e as agulhas de entrada e saída no poço de cavacos. Coloque a agulha de entrada perto da parte inferior do chip do poço, do lado de fora dos eletrodos de gravação. Coloque a agulha de saída perto do topo do cavaco bem em direção à borda, de modo que o líquido suba quase até a borda do poço do cavaco, cerca de 4 mL, e a fatia fique submersa durante todo o experimento (Figura 2D).
      2. Defina o fluxo de entrada de perfusão para 5 mL / min e o fluxo de saída de perfusão para 7 mL / min.
        NOTA: Recomenda-se que a taxa de saída exceda a taxa de entrada para evitar o transbordamento da solução para fora do poço do cavaco e para criar uma corrente de solução sobre a fatia do cérebro.
      3. Ligue a entrada e a saída. Remova a agulha de entrada do poço do cavaco até que a agulha comece a produzir solução em vez de ar. Em seguida, coloque a agulha de volta em sua posição dentro do poço do chip, conforme descrito na etapa 4.2.1.1.
      4. Use um aquecedor de solução para manter a solução na temperatura fisiológica ou próxima dela, em torno de 34-37 °C.
      5. Deixe o aCSF perfundir sobre a fatia do cérebro por 10 min. Isso permitirá que a fatia se ajuste ao ambiente de gravação.
      6. Decorridos 10 minutos, desloque o tubo de saída para o copo de eliminação. Em seguida, desloque o tubo de entrada para o copo que contém a solução pró-convulsivante. Deixar que o líquido de aCSF não convulsivante seja eliminado do sistema de perfusão para o copo de descarte durante 10 min.
      7. Transferir o tubo de saída para o copo que contém a solução pró-convulsivante.
      8. Deixe a solução pró-convulsivante circular até que o experimento termine.
      9. Se a duração do registro do corte exceder 2 h, considere preparar outra solução pró-convulsivante para compensar o consumo de glicose do fatia cerebral ativa.
    2. Troca de fatias cerebrais
      1. Desligue o fluxo de entrada. Desligue a vazão 10-15 s depois.
      2. Use uma pinça para remover a harpa e coloque-a em um barco de pesagem ou outra superfície.
      3. Use uma pipeta modificada para extrair e descartar a fatia de cérebro. Não toque nos eletrodos de referência ou no conjunto de eletrodos de gravação (Figura 2C).
      4. Colocar o tubo de entrada no copo que contém a solução não convulsivante de aCSF. Colocar o tubo de saída no copo de eliminação. Deixe as agulhas de entrada e saída no poço de cavacos. Execute o sistema de perfusão por 10 min para remover toda a solução pró-convulsivante residual do poço de cavacos e do sistema de perfusão. Comece o processo de experimentação novamente com uma nova fatia de cérebro (começando na etapa 4.1).
  3. Terminando o experimento
    1. Limpando o equipamento
      1. Remova a harpa, a fatia de cérebro e a solução do poço, respectivamente.
      2. Desencaixe o chip MEA, coloque-o em uma superfície limpa e encha bem o chip com água deionizada.
      3. Descarte a água deionizada para limpar quaisquer sais deixados das soluções de aCSF.
      4. Usando uma pipeta de transferência, encha bem o chip com uma solução detergente. Passe a ponta da pipeta de transferência no poço do chip e aponte-a para os eletrodos de gravação. Aperte e solte o detergente rápida e repetidamente na pipeta de transferência para lavar vigorosamente o detergente sobre os eletrodos de gravação por 1 min. Deixe o detergente descansar por 5-10 min.
      5. Remova o detergente e enxágue bem o cavaco 4-6 vezes com água deionizada para remover a solução detergente e quaisquer solutos restantes.
      6. Remova toda a água do poço do cavaco, coloque um pano antiestático sobre o cavaco MEA e deixe durante a noite para permitir que o cavaco seque.
      7. Coloque um barco de pesagem ou outra placa estanque na plataforma de registro MEA onde o chip MEA estava anteriormente repousado. Coloque a harpa no centro da placa e coloque as agulhas de entrada e saída em ambos os lados da harpa.
      8. Limpe o sistema de perfusão e a harpa enviando 50 mL de água, 50 mL de etanol à prova de 140 e 200 mL de água, respectivamente, através do tubo para o copo de descarte.
        NOTA: Neste momento, as velocidades de perfusão podem ser aumentadas para diminuir o tempo de limpeza, mas a velocidade de saída deve sempre exceder a velocidade de entrada para evitar inundações.
      9. Limpe as pedras de carbogênio colocando-as em um copo de água destilada e enviando o carbogênio através do tubo por 5 min. Coloque-os para descansar em uma superfície seca e limpa durante a noite e cubra-os para evitar o acúmulo de poeira.

5. Análise dos dados

NOTA: Há uma variedade de pacotes de análise usados para analisar dados eletrofisiológicos produzidos por CMOS-HD-MEAs, incluindo BrainWave da 3Brain, Yet Another Spike Sorter (YASS) e ferramentas Python personalizadas 34,35,36,37. Extraímos dados do formato de arquivo de dados BrainWave para uso na plataforma Xenon LFP Analysis para gerar os dados apresentados na Figura 4 e Figura 5. O código Matlab personalizado foi usado para analisar os dados na Figura 6. Os protocolos para a plataforma de análise de xenônio LFP estão disponíveis publicamente10. As etapas do protocolo a seguir são específicas para gravações feitas com Brainwave 438; Para outros sistemas, consulte a documentação de suporte relacionada a esses sistemas 34,35,36,37. Uma visão geral das etapas de análise tomadas para produzir os dados com este protocolo é fornecida abaixo. Para obter detalhes completos sobre como exportar, visualizar e analisar dados, incluindo vídeos tutoriais e todos os arquivos de código relevantes, consulte39.

  1. Exporte o arquivo de gravação para análise.
    1. Crie uma pasta para os arquivos de gravação de dados que serão reduzidos.
    2. Corte a imagem tirada durante a etapa 4.1.9 para incluir apenas a matriz de gravação com as fatias de cérebro.
    3. Abra o arquivo ExportToHDF5-ChannelSelection.py (este arquivo de código pode ser acessado no GitHub em xenon-lfp-analysis/code-files/3Brain-processing40) e copie e cole o URL listado na parte superior da janela em um navegador da Internet.
    4. Insira o caminho do arquivo para o arquivo de gravação de dados e carregue a imagem cortada da matriz associada à gravação.
    5. Em Selecionar canais para exportação, use a ferramenta de seleção de laço para selecionar as regiões hipocampal e neocortical mostradas na imagem recortada da matriz.
    6. Defina o número de linhas a serem ignoradas e o número de colunas a serem ignoradas para 2.
      NOTA: Os arquivos de gravação geralmente são grandes; Se apropriado para a análise desejada, os dados exportados podem ser reduzidos. Existem opções para reduzir a amostragem espacialmente (pulando linhas e colunas de eletrodos de gravação) e temporalmente (reduzindo a amostragem para uma frequência de amostragem mais baixa). Na análise, cada 2 linhas e 2 colunas são ignoradas; Isso permite a redução da amostragem dos dados espacialmente sem ser tendencioso para determinados canais. Cada canal está distante o suficiente para que as diferenças de atividade possam ser significativas entre eles; portanto, nenhuma média de canal é executada. Ao pular linhas e colunas dos eletrodos, os dados de canais não selecionados não são incluídos quando o arquivo de saída é exportado.
    7. Defina a frequência de redução da amostragem para 300 Hz.
    8. Clique no botão Exportar canais para gerar o arquivo de seleção de canal.
      NOTA: O software salvará automaticamente o arquivo de seleção de canal na pasta onde o arquivo de gravação de dados foi salvo.
    9. Abra o arquivo ExportToHDF5-ExtractDownsample.py (também encontrado no GitHub em xenon-lfp-analysis/code-files/3brain-processing40), cole o caminho do arquivo da pasta que contém o(s) arquivo(s) de seleção de canal e o(s) arquivo(s) de gravação de dados e pressione enter no teclado para gerar a versão reduzida do arquivo de gravação de dados.
  2. Usando a plataforma de análise
    1. No prompt de comando do computador, digite run_lfp_analysis e pressione Enter para abrir a plataforma de análise.
    2. Insira os caminhos da imagem e o arquivo de gravação com resolução reduzida e clique em enviar.
    3. Em Selecionar um intervalo de tempo para análise, selecione a gravação inteira.
    4. Em Selecionar canais para plotagens, destaque o hipocampo como Grupo-1 e o neocórtex como Grupo-2.
    5. Em Raster do canal, defina o Limite para 0,06 mV e a Duração do tempo para 0,02 s.
    6. Clique em Aplicar configurações e gerar raster.
    7. Use o gráfico raster para explorar diferentes canais que mostram padrões de atividade de interesse.
      NOTA: Consulte a Figura 4 para exemplos de atividade semelhante a convulsões de alta qualidade (Figura 4A-D) versus atividade abaixo do ideal (Figura 4E-F).

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Figura 4: Exemplo de evolução da atividade epileptiforme dos paradigmas 0 Mg2+ e 4-AP. (A) Exemplo de gráfico raster da aplicação de aCSF com 0 Mg2+ durante aproximadamente 40 min. (B) Exemplo de traços eletrofisiológicos retirados do neocórtex (azul) e hipocampo (vermelho) demonstrando atividade epileptiforme do paradigma 0 Mg2+ . (C) Exemplo de gráfico raster da aplicação 100 mM 4-AP durante aproximadamente 40 min. (D) Exemplo de traços eletrofisiológicos retirados do neocórtex (roxo) e hipocampo (verde) demonstrando atividade epileptiforme da aplicação de 4-AP. (E) Exemplo de gráfico raster da aplicação de aCSF com 0 Mg2+ durante aproximadamente 40 minutos mostrando atividade de explosão em oposição à atividade semelhante a convulsões, conforme encontrado nos outros traços representativos. (F) Exemplo de traços eletrofisiológicos retirados do neocórtex (roxo escuro) e hipocampo (ferrugem) demonstrando atividade subótima do paradigma0 Mg 2+ destinado à comparação com a atividade semelhante a convulsões de qualidade encontrada em B e D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Resultados representativos de descargas epileptiformes dos paradigmas0 Mg 2+ e 4-AP. (A) Exemplos de gráficos de um evento típico semelhante a uma convulsão neocortical induzido pelo paradigma 0 Mg2+ , incluindo (Ai) um espectrograma de um evento semelhante a uma convulsão, (Aii) o traço eletrofisiológico associado, (Aiii) um filtro passa-alta de 80 Hz aplicado ao traço de Aii, (Aiiii) e uma seção ampliada do traço de Aii. (B) Gráficos de exemplo de uma explosão epileptiforme típica do hipocampo induzida pelo paradigma 0 Mg2+ , incluindo (Bi) um espectrograma da explosão epileptiforme, (Bii) o traço eletrofisiológico associado, (Biii) um filtro passa-alta de 80 Hz aplicado ao traço de Bii, (Biiii) e uma seção ampliada do traço de Bii (C) Gráficos de exemplo de um evento típico semelhante a uma convulsão neocortical induzido pelo paradigma 4-AP, incluindo (Ci) um espectrograma de atividade epileptiforme, (Cii) o traço eletrofisiológico associado, (Ciii) um filtro passa-alta de 80 Hz aplicado ao traço de Cii, (Ciiii) e uma seção ampliada do traço de Cii (D) Gráficos de exemplo de uma explosão epileptiforme do hipocampo sob o paradigma 4-AP, incluindo (Di) um espectrograma de atividade epileptiforme, (Dii) o traço eletrofisiológico associado, (Diii) um filtro passa-alta de 80 Hz aplicado ao traço de Dii, (Diiii) e uma seção ampliada do traço de Dii. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Comparação da porcentagem de potência basal nas várias bandas entre paradigma e região do cérebro durante descargas epileptiformes estereotipadas. (A) A potência durante as descargas epileptiformes foi significativamente diferente entre os paradigmas e as regiões cerebrais para a maioria das bandas de frequência (ANOVA de 2 vias com teste de Tukey, * P < 0,05, ** P < 0,001, * * P < 0,0001). A linha do meio para cada caixa representa a média, as bordas da caixa ±1 erro padrão da média (SEM) e as linhas mais externas ±2 SEM. (B) Tanto os paradigmas quanto as regiões cerebrais demonstraram poder limitado em bandas relacionadas à atividade de alta frequência acima de 150 Hz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

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Como é padrão ao visualizar a atividade de muitos canais 1,4,5,10, achamos benéfico primeiro gerar um gráfico raster dos dados que adquirimos com o CMOS-HD-MEA (Figura 4A,C,E). Esse gráfico pode criar uma visão panorâmica da atividade em todos os canais de gravação em cada fatia do cérebro, exibindo cada canal no eixo y e o tempo no eixo x. Neste gráfico raster, cada ponto de sinal representa um canal que excedeu o limite de tensão LFP definido (consulte a etapa 5.2.6 e um trabalho publicado anteriormente10). Esses gráficos raster indicam quando e onde a atividade eletrofisiológica ocorre no espaço e no tempo (Figura 4A, C, E). A visualização dos dados dessa maneira permite que o usuário aproveite ao máximo a resolução espacial e temporal dos recursos do sistema CMOS-HD-MEA. Traços neocorticais e hipocampais representativos dos canais correspondentes aos gráficos raster demonstram como os dados LFP específicos para cada canal também podem ser visualizados (Figura 4B, D, F). Eventos ampliados de descargas epileptiformes são exibidos para diferentes regiões e paradigmas cerebrais na Figura 5, e a comparação das potências de frequência relativa que observamos dos paradigmas 0 Mg2+ e 4-AP está resumida na Figura 6. Em todas as bandas de frequência exibidas (1-150 Hz), a atividade semelhante a convulsão nas regiões hipocampal e neocortical com ambos os paradigmas foi significativamente maior do que a linha de base, após a subtração de todo o ruído elétrico de 60 Hz (frequência CA na América do Norte) com um filtro de entalhe digital.

Ao usar o paradigma 0 Mg2+ ou 4-AP, uma poderosa atividade semelhante a uma convulsão eletrográfica foi freqüentemente observada nas regiões neocorticais. As regiões do hipocampo exibiram mais variabilidade entre as fatias do cérebro, com algumas fatias do cérebro demonstrando atividade semelhante a convulsões e outras exibindo descargas transitórias mais curtas (~ 1 s) (Figura 4 e Figura 5). A potência para cada gravação foi normalizada para uma seção de linha de base "silenciosa" de 10 s no início de cada gravação, na qual nenhuma descarga foi observada. Todas as discussões adicionais sobre "potência" denotam potência espectral em comparação com uma linha de base de controle na amostra. A atividade neocortical mostrou-se mais poderosa em múltiplas bandas de frequência sob o paradigma0 Mg 2+ quando comparada ao paradigma 4-AP. Isso foi verdade para as bandas de frequência delta (1-4 Hz), (4-8 Hz), gama baixa (30-60 Hz) e gama alta (60-150 Hz) (Figura 6). Além disso, a atividade hipocampal no paradigma 0 Mg2+ demonstrou maior potência nas bandas de alta frequência gama (60-150 Hz) quando comparada ao neocórtex no paradigma 0 Mg2+ e quando comparada também a ambas as regiões cerebrais testadas no paradigma 4-AP (Figura 6). Embora o paradigma 4-AP tenha exibido menos poder na maioria das bandas de frequência em nossos estudos, em comparação com as condições de 0 Mg2+ , as amostras de 4-AP do hipocampo tenderam a demonstrar mais descargas epileptiformes gerais (Figura 4D). Não observamos nenhuma diferença entre regiões ou paradigmas cerebrais ao analisar a atividade de alta frequência (Figura 6B). Isso provavelmente ocorre porque as gravações são feitas em um chip de gravação 2D não penetrante, o que significa que a atividade de alta frequência pode não ser captada devido à distância entre os neurônios que produzem a atividade e os locais de gravação do eletrodo. Em conjunto, os resultados apresentados aqui sugerem que, ao usar os sistemas CMOS-HD-MEA com chips 2D CMOS-MEA, geralmente se obterá maior potência geral durante as descargas epileptiformes usando o paradigma0 Mg 2+ , onde dados de qualidade podem ser registrados até as altas bandas gama (de 1 a 150 Hz). Além disso, os dados apresentados aqui sugerem que o modelo 4-AP pode não ser uma ótima escolha com este sistema se alguém deseja estudar informações das bandas gama usando este protocolo. No entanto, ele fornece dados ricos nas bandas de potência mais baixas, ao mesmo tempo em que exibe muitas descargas epileptiformes. É importante ressaltar que ambos os modelos exibirão atividade semelhante a convulsões de alta qualidade com o protocolo acima.

As diferenças nos modelos de convulsão provavelmente resultam em padrões caracteristicamente únicos de atividade semelhante a convulsão induzida com base nos mecanismos celulares desses paradigmas e devido à microanatomia da região cerebral41. Por exemplo, o 4-AP bloqueia certas classes de canais K+ dependentes de voltagem (principalmente a família Kv3), estendendo a duração da excitabilidade neuronal e resultando em um início de atividade epileptiforme dentro de alguns minutos após a exposição no hipocampo 42,43,44,45,46. No entanto, o neocórtex tipicamente tem um início tardio muito mais longo da atividade epileptiforme do que o hipocampo quando exposto ao 4-AP41. Por outro lado, o paradigma 0 Mg2+ induz a atividade epileptiforme principalmente pela lavagem do bloqueio Mg2+ dos receptores NMDA nos neurônios glutamatérgicos, resultando em atividade epileptiforme neocortical precoce 47,48,49,50. Embora houvesse diferenças significativas entre as regiões e paradigmas do cérebro para muitos dos grupos destacados, algumas semelhanças importantes entre os paradigmas e as regiões do cérebro também permaneceram. A potência nas bandas de frequência alfa e beta foi comparável entre as regiões e paradigmas do cérebro e, nas regiões do hipocampo, os paradigmas mostraram desempenho semelhante na banda delta (Figura 6). Além disso, foi observado um aumento geral na potência em comparação com a linha de base para todas as frequências (1-150 Hz) durante a atividade epileptiforme (Figura 5 e Figura 6), como esperado. Uma observação final digna de nota das áreas neocorticais durante a exposição ao 4-AP foi o padrão estriado observado nos espectrogramas, representando maior atividade para frequências mais altas durante o início ictal, seguido por uma diminuição gradual da frequência à medida que a atividade progredia (Figura 5C), possivelmente sugerindo alta sincronia interneuronal durante o início ictal.

Discussão

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Este protocolo inclui diretrizes específicas relacionadas ao gerenciamento de fatias cerebrais agudas que abordam problemas comuns enfrentados pelos usuários de CMOS-HD-MEA, ou seja, desenvolvimento de ruído sob a fatia cerebral e manutenção de um ambiente saudável para a fatia cerebral. O desenvolvimento de ruído sob a fatia ocorre quando a fatia não está devidamente aderida à matriz; Se a fatia do cérebro não estiver adequadamente aderida, bolsas de ar podem se formar embaixo da fatia, o que resulta em ruído. Isso resultará na incapacidade de adquirir dados. Para mitigar esses desafios, o protocolo enfatiza duas etapas críticas: primeiro, garantir a orientação adequada da harpa durante a colocação para evitar empurrões por perfusão de entrada (etapa 4.1.4) e, segundo, usar um lenço antiestático para remover o excesso de aCSF ao redor dos eletrodos, promovendo assim a adesão eficaz do corte (etapas 4.1.5-4.1.7). Outro problema comum abordado no protocolo envolve a hidrofobicidade do chip, que pode levar à formação de bolhas e introduzir ruído durante as gravações. Etapas como tratamento com etanol seguido de enxágue com água deionizada são recomendadas para aliviar esses problemas (etapas 3.1.2, 3.1.3 e 3.1.6). No entanto, se o problema persistir, há etapas adicionais que podem ser tomadas. Encha bem o chip com etanol à prova de 140 e use um pincel para escovar levemente a matriz por 30 s a 60 s. Retire o etanol e enxágue bem o cavaco três vezes com água deionizada. Em seguida, encha o poço com aCSF e continue o protocolo na etapa 4.

Manter um ambiente saudável para a fatia do cérebro é vital e é gerenciado por meio da colocação adequada das agulhas de entrada e saída e da taxa de fluxo do sistema de perfusão (etapa 4.2.1). É imperativo oxigenar adequadamente o corte e encontrar a taxa de perfusão mais eficaz23,51. Devido a esses problemas, as câmaras de interface são comumente usadas para gravações de fatias cerebrais agudas e fornecem oxigenação mais estável. No entanto, foi relatado que o registro com câmaras de interface comprime o espaço extracelular entre os neurônios, o que pode alterar a fisiologia do corte ao longo do tempo 24,52,53. A dinâmica da tensão superficial dessa fisiologia alterada resulta em uma maior sensibilidade elétrica basal dos neurônios54. Essa excitabilidade adicional aumenta a probabilidade de eventos semelhantes a convulsões e outros LFPs de interesse. Em comparação, as câmaras submersas, com as quais a maioria das plataformas CMOS-HD-MEA operam, podem fornecer medicamentos e glicose com mais eficiência à fatia23,51. Para manter um ambiente saudável para o corte durante uma sessão de gravação que duraria mais de 2 h com plataformas CMOS-HD-MEA, é benéfico ter outra solução pró-convulsivante preparada (etapa 4.2.1.9). Isso garantirá que a fatia tenha glicose suficiente para continuar a produzir atividade.

A falta de resolução espacial pode ser uma grande limitação na eletrofisiologia23,55. Por exemplo, o patch-clamping é uma técnica frequentemente usada em eletrofisiologia que pode fornecer grandes detalhes sobre como uma única célula se comporta durante a atividade da rede; No entanto, uma limitação do patch-clamping é que a gravação é realizada a partir de uma única célula e, por padrão, de um único local. O patch-clamping pode ser utilizado para estudar a atividade da rede, mas oferece uma imagem espacial bastante limitada da atividade da rede41,56. Algumas técnicas de imagem fornecem amplos detalhes espaciais da atividade neuronal, como biossensores fluorescentes geneticamente codificados; no entanto, eles o fazem ao custo da resolução temporal 57,58,59. Abordagens multimodais, como gravações de eletrodos monocanal ou multicanal, podem ser combinadas com imagens de cálcio para obter maior resolução espaço-temporal; no entanto, a resolução espacial do registro eletrofisiológico ainda é limitada a alguns locais60,61. Quando usada corretamente, a tecnologia CMOS-HD-MEA permite que os usuários superem essas limitações gravando com alta densidade espacial (os eletrodos são normalmente espaçados de 20 a 200 μm) de várias áreas do cérebro simultaneamente (Figura 4). Os dados do CMOS-HD-MEA podem permitir que os pesquisadores diferenciem e caracterizem os padrões de atividade de propagação em toda a fatia do cérebro com mais detalhes do que a maioria das outras técnicas de registro 10,62,63. Embora a tecnologia CMOS-HD-MEA exiba excelente capacidade de mapeamento espacial com alto detalhe temporal64, existem limitações, como a incapacidade de registrar de forma confiável a partir de células únicas usando fatias corticais devido ao uso de matrizes 2D não penetrantes e a incapacidade de ser usado para experimentação in vivo. Os sistemas CMOS-HD-MEA normalmente registram apenas potenciais de campo locais de fatias corticais; no entanto, eles podem capturar potenciais de ação extracelular em alguns canais com preparações de fatias de alta qualidade, embora essa capacidade possa não ser confiável. A atividade da unidade de célula única pode ser explorada nos canais gravados do sistema CMOS-HD-MEA usando um filtro passa-alta (~ 50 Hz passa-alta), combinado com o software de classificação de pico 65,66,67. Vale ressaltar que é possível combinar gravações de microeletrodos com sistemas CMOS-HD-MEA para possivelmente obter informações de célula única de alguns locais, em camadas com as ricas informações CMOS-HD-MEA5. O método atual com chips 2D não penetrantes é limitado pela dificuldade em detectar atividade de frequência mais alta (150-500 Hz) em regiões corticais do cérebro. Isso provavelmente se deve à distância entre os neurônios que produzem a atividade e os eletrodos de registro (Figura 6B). Esse desafio pode ser superado usando novos chips 3D-CMOS-HD-MEA penetrantes, que gravam de dentro da fatia do cérebro e não apenas em sua superfície68.

Usando o protocolo acima, geramos dados de exemplo para demonstrar os sinais LFP de alta qualidade na forma de atividade semelhante a convulsões que podem ser alcançadas com esses instrumentos (Figura 4 e Figura 5). Demonstramos que a atividade semelhante a convulsões pode ser observada com diferentes paradigmas de registro (especificamente 4-AP e 0 Mg2+) usando sistemas CMOS-HD-MEA, apesar das diferenças idiossincráticas entre os paradigmas.

Em resumo, o protocolo e os dados de exemplo apresentados usando o CMOS-HD-MEA fornecem um roteiro pelo qual os dados LFP espaciais e temporais de alta fidelidade podem ser coletados. Aplicações futuras dessa técnica incluem a aplicação desse protocolo a paradigmas adicionais que induzem a atividade epileptiforme e a integração do CMOS-HD-MEA com técnicas complementares, como imagens. Esses estudos, sem dúvida, ajudarão em nossa compreensão dos distúrbios convulsivos humanos usando esses modelos simples de fatias cerebrais69. Por exemplo, o aumento deste protocolo pode fornecer um exame cruzado perspicaz do comportamento eletrofisiológico e mapeamento genético de vários modelos animais de epilepsia com mutações em genes clinicamente relevantes70. Embora tenhamos nos concentrado na atividade epileptiforme, outras atividades importantes da rede, como potenciação de longo prazo, também podem ser estudadas com resolução espacial sem precedentes usando sistemas CMOS-HD-MEA. Esperamos que este protocolo e tecnologia sejam implementados para ajudar outras pessoas no campo a superar os desafios de coleta de dados e desenvolver métodos de pesquisa mais precisos para entender vários distúrbios neurológicos, como a epilepsia.

Divulgações

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Os autores declaram que não há conflitos de interesse associados a esta pesquisa.

Agradecimentos

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Os autores agradecem aos antigos e atuais membros do laboratório Parrish por suas edições neste manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Alessandro Maccione, da 3Brain, por seu feedback sobre este trabalho. Este trabalho foi financiado por um Prêmio de Investigador Júnior AES / EF e pelas Faculdades de Ciências da Vida e de Ciências Físicas e Matemáticas da Universidade Brigham Young.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bancada de trabalho 2DCloudrayLM04CLLD26B
4-aminopiridinaSigma-Aldrich275875
Accura Chip3BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA Agarose
Thermo Fisher ScientificBP160-100
Mesa de isolamento de vibraçãoSistemas cinéticos91010124
Béquer para o câmara de retenção de fatias, 270 mLVWR10754-772
BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA plataforma
Brainwave Software3BrainVersão 4Software CMOS-HD-MEA Cloreto
cálcioThermo Fisher ScientificBP510-500
CarbogenAirgasX02OX95C2003102
CarbogenAirgas12005
Pedras de CarbônioSupelco59277
CompresstomePrecissionaryVF-300-0Z
ComputadorDellPrecission3650
Cabos de Aterramento de Clipe de CrocodiloJWQIDI B06WGZG17W
DetergenteMetrex10-4100-0000
D-GlicoseMacron Fine Chemicals4912-12
Dihidrogênio Fosfato de SódioThermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
EtanolThermo Fisher ScientificA407P-4
FórcepsFine Science Tools11980-13
Placa quenteThermo Fisher ScientificSP88857200
Máquina de GeloHoshizakiF801MWH
Agulhas de entrada e saídaJensen GlobalJG 18-3.0X
Aquecedor de Solução InlineWarner InstrumentsSH-27B
IsofluorinaDechra08PB-STE22002-0122
Kim WipesThermo Fisher Scientific06-666
Magnésio CloroThermo Fisher ScientificFLM33500
MicropipetasGilsonF144069
Mili-Qde Pintura ZR0Q008WWMili-Q
Daler RowneyAF85 Redondo: 0
Filtro de PapelWhatmanEW-06648-24
ParafilmAmerican National CanPM996
Sistema de PerfusãoSistema MulticanalPPS2
PipetorThermo Fisher ScientificFB14955202
Platinum Harp3Brain3Brain
Cloreto de PotássioThermo Fisher ScientificP330-3
Lâmina de barbearPersonnaBP9020
EscalaMetter ToledoAB204
TesouraSolingen92008
Slice Holding ChamberCustomCustom Custom 3D Printer Design, disponível mediante solicitação
Bicarbonato de sódioMacron Fine Chemicals7412-06
Cloreto de sódioThermo Fisher ScientificS271-3
Caixa de controle de temperaturaWarner InstrumentsTC344B
Pipetas de transferênciaGenesee Scientific30-200
TubulaçãoTygonB-44-3 TPE
Vibratome VZ-300PrecissionaryVF-00-VM-NC
Pesar BarcoMicroscopia Eletrônica Ciências70040
de Filtro de Água Pincel

Referências

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