Ancoragem do testículo torcido: um modelo de lesão de isquemia-reperfusão do testículo em ratos

Resumo

Este artigo descreve um procedimento passo a passo para a criação de um modelo de isquemia/reperfusão testicular para a produção de um modelo reprodutível de torção testicular no estudo dos mecanismos patológicos da lesão de isquemia-reperfusão no testículo.

Resumo

As lesões de isquemia-reperfusão (RI) estão associadas a várias patologias, incluindo a lesão testicular. Modelos animais anteriores de IR testicular, que envolve a torção do cordão espermático para obter isquemia, estão repletos de muitas dificuldades técnicas que resultam na incapacidade de reproduzir o modelo de forma consistente. Portanto, apresentamos um método simples para induzir IR testicular em um modelo de rato que pode ser facilmente replicado.

Este método envolve a separação do gubernáculo do testículo, criação de uma bolsa escrotal, torção do testículo 720° no sentido horário em seu pólo inferior e ancoragem do testículo à base do escroto. Este modelo contrai efetivamente os vasos testiculares e induz isquemia testicular. Após 1 h de isquemia, o ponto de ancoragem é removido e o testículo destorcido. O cordão e os vasos que o acompanham são inspecionados para garantir a permeabilidade. Após a RI, o testículo é coletado e seccionado para avaliação histopatológica.

A histologia testicular foi examinada quanto a lesões hemorrágicas focais, congestão vascular, espaço intersticial alargado e infiltração de células inflamatórias. Além disso, marcadores de estresse oxidativo (malondialdeído, glutationa reduzida, catalase e superóxido dismutase), inflamação (MPO, TNF-α, IL-1β) e apoptose (expressão da caspase 3) foram testados. Este método fornece um modelo mais simples e facilmente reprodutível para estudar a fisiopatologia da lesão de IR testicular. Mais ainda, este modelo abre uma janela para explorar potenciais agentes terapêuticos no tratamento da lesão de IR testicular.

Introdução

A torção do testículo (TT) é uma emergência urológica aguda na qual o cordão espermático, juntamente com os vasos que o acompanham, se torce, resultando em isquemia do testículo. É caracterizada por dor abdominal intensa, náuseas e vômitos¹. A isquemia, se não resolvida por destorção oportuna, resulta em necrose e perda do testículo^{em questão 2}. No entanto, a intervenção cirúrgica oportuna por meio de destorção e restauração do fluxo sanguíneo para o testículo resulta em lesão de isquemia-reperfusão (IRI), que resulta em ruptura histológica e bioquímica do testículo e de suas funções ^3,4.

Modelos animais de TT têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos da IRI, que invariavelmente resulta de tentativas de impedir que o TT progrida para necrose ^5,6. Existem dois modelos de TT, clampeamento do cordão espermático e torção do cordão. Ambos são realizados em condições estéreis e anestesia adequada. Os agentes anestésicos comuns usados incluem cetamina isolada ou em combinação com xilazina⁷. Outros agentes anestésicos comumente usados são o uretano e o tiopental sódico, geralmente administrados por via intraperitoneal⁷. No entanto, ambos os modelos têm suas limitações.

Embora o pinçamento direto da artéria testicular com clipes microvasculares ^8,9 tenha sido utilizado como meio de induzir isquemia por um determinado período de tempo (geralmente 1 h) antes da indução da reperfusão pela remoção das pinças, o método não mimetiza com precisão a aparência clínica de torção do testículo¹⁰. Além disso, embora a torção cirúrgica do cordão espermático para obter isquemia^11,12 seja mais representativa da apresentação clínica, ela está repleta de muitas dificuldades técnicas que não foram abordadas pelas breves descrições encontradas na seção de métodos de artigos sobre o assunto.

Uma clara dificuldade técnica frequentemente encontrada tem sido a de retornar e ancorar o testículo ao assoalho do escroto para evitar a torção durante o período de isquemia. Enquanto alguns investigadores não mencionam a ancoragem do testículo à parede escrotal^13,14, outros prescrevem a ancoragem do testículo à parede escrotal costurando a túnica albugínea a ela 15,16,17. As descrições do processo de ancoragem do testículo à parede escrotal foram, em geral, muito breves e não explícitas ^7,18. As tentativas de duplicar os procedimentos descritos nas seções de métodos de artigos anteriores encontraram, portanto, sérias dificuldades práticas, como lesão do testículo por perfuração da túnica albugínea e incapacidade de retornar o testículo ao escroto sem exercer pressão indevida. Além disso, em termos práticos, o retorno do testículo ao saco escrotal após a indução de torção tem sido um grande desafio em nossas tentativas de induzir cirurgicamente o TT experimental. Tais dificuldades técnicas resultaram, portanto, na incapacidade de reproduzir consistentemente o modelo entre diferentes investigadores.

Assim, o procedimento descrito neste estudo para a criação de um modelo de TT em ratos identifica as dificuldades técnicas encontradas em modelos anteriores e oferece soluções para elas. Este modelo fornece uma técnica simples que é facilmente reproduzível e imita a experiência humana. O modelo é, portanto, um ponto de partida confiável e reprodutível no estudo dos mecanismos patológicos decorrentes da IRI.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética da Faculdade de Ciências Médicas Básicas, Universidade de Tecnologia Ladoke Akintola, Ogbomoso, Estado de Oyo, Nigéria (ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024). Vinte ratos Wistar albinos machos, com idade entre 10 e 12 semanas e pesando 180 ± 10 g, foram utilizados para este estudo. Eles foram aclimatados por 2 semanas e, em seguida, alocados aleatoriamente no grupo operado simulado (SO) ou no grupo de torção/destorção (T/D) (n = 10 ratos por grupo). Os ratos SO foram submetidos a uma cirurgia semelhante, assim como os ratos T / D, mas os testículos não foram torcidos ou ancorados para induzir T / D.

1. Preparo pré-operatório e anestesia

1. Exponha os animais (grupos SO e T/D) a um jejum noturno de 12 h antes da cirurgia.
2. No dia da cirurgia, anestesiar os animais (grupos SO e T/D) com uma combinação de cetamina 50 mg/kg e xilazina 10 mg/kg por via intraperitoneal, e confirmar a adequação e profundidade da anestesia observando a falta de resposta dos animais à pressão da almofada das patas e à leve estimulação dos bigodes.
3. Raspe as áreas escrotal, perineal e inguinal esquerda dos animais (grupos SO e T / D) e, em seguida, limpe-as com álcool metilado e solução anti-séptica de povidona.

2. Indução de isquemia do testículo

1. Mobilização do testículo
   1. Exerça suavemente pressão para baixo no abdômen para empurrar o testículo esquerdo (dos grupos SO e T/D) para o escroto.
   2. Segure firmemente o testículo esquerdo (dos grupos SO e T/D) e faça uma incisão escrotal alta, ~ 1,5 cm de comprimento, para expor o testículo subjacente dentro da túnica vaginal (TV).
   3. Localize o pólo inferior do testículo (dos grupos SO e T / D), especificamente o epidídimo da cauda, e faça um corte na TV sobrejacente com uma pequena tesoura de dissecação.
   4. Coloque a tesoura sob a TV e alargue-a ligeiramente para mostrar as duas bordas da TV e, em seguida, segure as bordas de ambos os lados com uma pinça curva da artéria mosquito. Isso se aplica aos grupos SO e T / D.
      NOTA: Esta etapa é muito importante, pois estabelece um plano tecidual que permitirá o fácil retorno do testículo ao escroto após a indução da torção.
   5. Estenda a incisão (de ambos os grupos SO e T / D) na TV proximalmente em ~ 0,5 cm.
   6. Exerça uma leve pressão na parte inferior do abdômen para exteriorizar o testículo (dos grupos SO e T/D).
   7. Apenas para o grupo T/D, mobilize o testículo e identifique o gubernáculo testicular, depois corte-o para desprender o testículo do assoalho do escroto.
      NOTA: Esta etapa é importante, pois permite que o testículo seja torcido. O gubernáculo é identificado como o ligamento que se estende da extremidade caudal do testículo até o canal inguinal e termina em uma expansão em forma de botão^19,20.
   8. Segure o testículo (dos animais T / D) em seu pólo inferior (onde o epidídimo da cauda está localizado) e gire-o 720 ° no sentido horário e registre a hora (marcando o início da isquemia).
2. Ancoragem do testículo isquêmico
   1. Crie uma bolsa escrotal segurando o testículo torcido (dos animais T / D) no lugar e empurrando uma longa tesoura de dissecação para baixo ao longo do plano de tecido sob a TV no escroto para formar uma bolsa.
   2. Apenas para os animais T/D, insira o ponto de ancoragem segurando a tesoura no lugar e inserindo um ponto de ancoragem usando sutura crômica 2-0 do lado de fora do ponto mais baixo da bolsa escrotal criada anteriormente. Insira o ponto no tecido conjuntivo no pólo inferior do testículo e traga-o de volta para dentro da bolsa e para fora dela próximo ao ponto de entrada inicial.
   3. Ancore o testículo na base do escroto puxando o testículo torcido (dos animais T / D) para dentro do escroto e exercendo suavemente tração para baixo nas duas extremidades da sutura e, em seguida, amarre as duas extremidades da sutura firmemente na pele escrotal.
   4. Fechar a incisão escrotal (dos animais SO e T/D) com uma sutura contínua em bolsa usando 2-0 crômico.
      NOTA: Isso é recomendado para fácil remoção quando a reperfusão deve ser feita.

3. Investigações bioquímicas e histopatológicas

NOTA: Certifique-se de que os investigadores que realizam os ensaios bioquímicos e exames histopatológicos estejam cegos para o protocolo do estudo.

1. Ao final do período experimental, fazer com que os animais passem por um jejum de 12 h durante a noite e eutanasiar (50 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina i.p.).
2. Remova e separe os testículos esquerdos das estruturas aderentes.
3. Homogeneizar cinco dos 10 tecidos testiculares de cada grupo em tampão de homogeneização (sacarose 0,25 M, EDTA 0,5 mM, histidina 5 mM e IP dissolvido em PBS, pH 7,4) e fixar os cinco tecidos testiculares restantes na solução de Bouin para avaliação histológica.
4. Centrifugar os homogeneizados a 10 000 × g durante 15 min a 4 °C numa centrifugadora fria para obter o sobrenadante para análises bioquímicas.
5. Determine a atividade da xantina oxidase testicular (XO) por um ensaio colorimétrico enzimático usando kits de laboratório padrão seguindo as diretrizes do fabricante.
6. Ensaio de malondialdeído testicular (MDA) por colorimetria²¹.
   1. Determinação da concentração de peroxidação lipídica utilizando as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) produzidas durante a peroxidação lipídica
      NOTA: Este método é baseado na reação entre o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) e o malondialdeído, um produto final da peroxidação lipídica. O aquecimento a pH ácido dá origem a um complexo cromógeno rosa (aduto de 2-malondialdeído [TBS]) cuja absorbância a 532 nm é medida.
      1. Desproteinize 200 μL da amostra com 500 μL de ácido tricloroacético (TCA) e centrifugue a 3.000 rpm por 10 min.
      2. Adicione 1 mL de 0,75% TBA a 0,1 mL do sobrenadante, ferva em banho-maria por 20 min a 100 ° C e deixe esfriar com água gelada.
      3. Ler a absorvância da amostra/padrão a 532 nm utilizando um espectrofotómetro contra o branco. Determinar a concentração de TBARS gerada por extrapolação da curva padrão.
7. Ensaio de atividades testiculares de superóxido dismutase (SOD)²², catalase²³ e glutationa peroxidase (GPx)²⁴ usando protocolos estabelecidos conforme relatado anteriormente.
   1. Determinação de SOD
      1. Diluir 1 ml da amostra em 9 ml de água destilada para fazer uma diluição de 1 em 10. Adicione 0,2 mL desta amostra diluída a 2,5 mL de tampão carbonato 0,05 M (pH 10,2) para equilíbrio do espectrofotômetro.
      2. Inicie a reação adicionando 0,3 mL de adrenalina 0,3 mM recém-preparada à mistura e misture rapidamente por inversão.
      3. À cubeta de referência, adicione 2,5 mL de tampão, 0,3 mL do substrato (adrenalina) e 0,2 mL de água.
      4. Monitore o aumento da absorbância a cada 30 s por 150 s a 480 nm.
   2. Determinação da catalase
      1. Misturar 1 ml do sobrenadante do homogeneizado testicular com 19 ml de água diluída para obter uma diluição de 1:29 da amostra.
      2. Tomar 4 ml de solução de H₂O₂ (800 μmoles) e 5 ml de tampão fosfato num balão de fundo plano de 10 ml.
      3. Misturar 1 ml da preparação enzimática devidamente diluída (passo 4.6.3.1) com a mistura de reacção (passo 4.6.3.2) utilizando um movimento suave de rotação a 37 °C. Retirar 1 ml da mistura de reacção e adicioná-la a 2 ml de dicromato/ácido acético reagente em intervalos de 60 segundos.
      4. Determinar os níveis de catalase na amostra comparando a absorvância a 653 nm com a de um padrão de catalase certificado.
   3. Ensaio GPx
      1. Incubar a mistura de reação contendo a amostra a 37 °C por 3 min, adicionar 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 10% e centrifugar a 3.000 rpm por 5 min.
      2. A 1 ml do sobrenadante, adicionar 2 ml de tampão fosfato e 1 ml de solução de 5'-5'-ditiobis-(ácido 2-dinitrobenzóico (DTNB) e ler a absorvância a 412 nm contra um branco.
      3. Determine a atividade da glutationa peroxidase traçando a curva padrão e extrapolando a concentração do GSH restante a partir da curva.
8. MPO e fator de necrose tumoral-alfa (TNFα) ensaio
   NOTA: Este ensaio envolve a oxidação do guaiacol em guaiacol oxidado na presença de peróxido de hidrogênio. O guaiacol em sua forma oxidada tem uma cor marrom, que é medida fotometricamente a 470 nm.
   1. Use kits ELISA padrão para determinar a atividade da mieloperoxidase testicular (MPO)^21,25 e os níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
9. Exame histopatológico usando coloração de hematoxilina e eosina (H&E) ^26,27 e imuno-histoquímica para expressão de caspase 3
   1. Preservar o tecido testicular no fluido de Bouin; lavar o tecido com tolueno, mergulhar em cera de parafina e incubar a 60 °C durante a noite.
   2. Pegue seções de ~ 5 μm de espessura, desparafinize e reidrate-as, recupere o antígeno usando tampão de citrato pré-aquecido e deixe esfriar por 30 min.
   3. Limpe as lâminas com lenços umedecidos de laboratório, marque as áreas da seção com uma caneta hidrofóbica e arrume as lâminas em uma câmara umidificada.
   4. Incubar as lâminas durante 10 min após o bloqueio da atividade da peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio. Enxágue as lâminas com PBS uma vez, aplique o bloco de proteína e incube por 10 min.
   5. Enxágue as lâminas com PBS 2x, aplique os anticorpos primários correspondentes (caspase 3), incube as lâminas por 45 min e enxágue 2x com PBS.
   6. Aplique o anticorpo secundário, incube por 25 min, enxágue com PBS 2x e adicione o polímero HRP. Repita o ciclo de incubação por 25 min e enxágue 2x com PBS.
   7. Incube as seções por 5 min em substrato de diaminobenzidina (DAB), enxágue 2x com PBS, contra-core com hematoxilina e enxágue com água destilada.
   8. Aplique a solução azulada nas seções, enxágue, desidrate, limpe e monte para exame qualitativo.
   9. Examine os tecidos sob um microscópio óptico e faça fotomicrografias com aumento de 100x e 400x com uma câmera digital conectada ao microscópio.

4. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas com o software de sua escolha. Realizar o teste de Anderson-Darling, o teste de D'Agostino e Pearson e o teste de Shapiro-Wilk para testar a normalidade.
2. Realize um teste t não pareado para testar a diferença significativa entre os dois grupos: SO e T/D.
3. Apresente os dados como média ± erro padrão da média. Defina o nível de significância em p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001 (conforme relatado nas legendas das figuras).

Resultados

A atividade de XO, o nível de MDA e as atividades de SOD, catalase e GPx no testículo foram empregados como marcadores de estresse oxidativo. A torção/destorção (T/D) aumentou acentuadamente a atividade de XO e os níveis de MDA e reduziu as atividades testiculares de SOD, catalase e GPx em ratos T/D em comparação com os ratos operados de forma simulada (Figura 1), representando o papel do estresse oxidativo na lesão induzida por T/D.

Discussão

Este artigo e o vídeo que o acompanha fornecem uma descrição detalhada passo a passo da indução cirúrgica de TT para o estudo da IRI testicular usando a abordagem de ancoragem. O método é particularmente útil na medida em que evita a exteriorização prolongada do testículo ocasionada por técnicas de pinçamento⁷ e, ao mesmo tempo, modela mais de perto a apresentação clínica do TT em humanos^10,12.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 cc syringes	Não Aplicável	Não Aplicável	para anestésico
2-0 chromic suture	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Bard Parker knife handle	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Curved Mosquito artery forceps	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Dissecting scissors	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
GraphPad Prism (version 8.0.2)
Ketamine injection	Swiss Parenterals LTD Gujarat India	2321154	Anestésico
Paracetamol injection	Shanxi Zhongbao Pharmaceuticals, China	220637	Analgésico
Povidone	JAWA International limited Nigeria	135S	Lavage antisséptico
Procaine penicillin powder	Anhui Chengshi Pharmaceutical Co Ltd China	201906	Para cirurgia
Surgical blade	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Surgical gloves	Zhenjiang huayang latex products China	210325
Stitch scissors	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Toothed dissecting forceps	Não Aplicável	Não Aplicável	Para cirurgia
Xylazine injection	Bioveta Czech Republic	396228A	Anestésico
Light Microscope	Novel Microscope, China	Não aplicável	Para avaliação histopatológica
Digital Camera	Hayear, China	Não aplicável	Para avaliação histopatológica
TNF-α kit	Elabscience, USA	E-EL-H0109	Para ensaio
Thermo Fischer kit (anti-mouse caspase 3 monoclonal for caspase 3 expression )	Thermo Fischer Scientific Inc., USA	Não aplicável	Para Imunohistoquímica (caspase 3)