Artigo de método

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

DOI:

10.3791/67413

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17 de janeiro de 2025

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1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Resumo

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O câncer de pâncreas é uma malignidade agressiva com um prognóstico sombrio e opções terapêuticas limitadas. A terapia celular adotiva, que envolve isolar e ativar as células imunológicas do próprio paciente, como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), antes de reinfundi-los, representa uma abordagem experimental promissora. No entanto, as técnicas de transferência de células adotivas em modelos pré-clínicos de câncer de pâncreas não estão bem estabelecidas. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para terapia celular adotiva usando TILs de um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico. O procedimento envolve a implantação de células cancerígenas pancreáticas de camundongo vivas ou irradiadas em camundongos repórteres marcados com fluorescência para iniciar o influxo de células imunes, isolando os linfócitos de tumores primários por meio de classificação por citometria de fluxo e/ou ativando e expandindo células T reativas ao tumor ex vivo e transferindo adotivamente essas células T ativadas por via intraperitoneal em camundongos portadores de tumor, seguido pela administração de interleucina-2. A imagem bioluminescente do tumor permite o monitoramento longitudinal do crescimento do tumor ortotópico e da resposta à terapia, especialmente avaliando os efeitos citotóxicos específicos do tumor. Essa abordagem recapitula a logística envolvida no desenvolvimento de terapias adotivas de transferência de células para pacientes com câncer de pâncreas. Os resultados demonstram maior eficácia antitumoral de células T reativas a tumores transferidas adotivamente em comparação com controles de linfócitos irrelevantes. Essa metodologia versátil permite o estudo in vivo da imunoterapia adotiva no câncer de pâncreas, bem como a otimização dos parâmetros de processamento celular e regimes de tratamento combinados.

Introdução

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A imunoterapia contra o câncer de pâncreas está em seus estágios iniciais, com exploração e validação pré-clínica contínuas principalmente em modelos de camundongos1. Os tratamentos atuais para o câncer de pâncreas incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapias direcionadas. Infelizmente, esses métodos geralmente falham em erradicar completamente as lesões tumorais, levando à recorrência e progressão. Os tratamentos tradicionais se concentram nas células tumorais, mas muitas vezes ignoram o microambiente tumoral (TME), que inclui células tumorais e estroma associado composto de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), fibroblastos e matriz extracelular2. Os TILs são células imunes dentro do TME, incluindo células T citotóxicas, células T auxiliares, células T reguladoras, células B, células NK, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides3. Essas células participam de respostas imunes que influenciam o crescimento do tumor e os resultados terapêuticos4.

A terapia celular adotiva (ACT) envolve a coleta de células imunológicas de um paciente, modificando-as e expandindo-as in vitro e, em seguida, reintroduzindo-as para atingir e matar células tumorais. A terapia TIL, um tipo de ACT, está sendo pesquisada para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo melanoma, câncer de pulmão e câncer cervical. Esse processo envolve isolar linfócitos do tumor, cultivá-los com IL-2 in vitro e reinfundi-los no paciente, muitas vezes após linfodepleção com quimioterapia ou radioterapia5.

Desde que o estudo de Rosenberg de 1986 demonstrou a eficácia dos TILs em camundongos6, a imunoterapia de transferência celular adotiva tornou-se um ponto de pesquisa e mostrou-se promissora no tratamento do câncer 7,8,9,10. Nosso objetivo é extrair TILs de camundongos, classificá-los para células T específicas por meio de citometria de fluxo e validar seus efeitos de eliminação de tumores por meio de transferência adotiva.

Neste protocolo, descrevemos um método para utilizar TILs de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. O objetivo é verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas. Este método inclui a implantação de células cancerígenas pancreáticas de camundongo vivas ou irradiadas em camundongos repórteres marcados com fluorescência para iniciar o influxo de células imunes, isolando linfócitos de tumores primários por meio de classificação por citometria de fluxo ou ativando e expandindo células T reativas ao tumor ex vivo e transferindo adotivamente essas células T ativadas para camundongos portadores de tumor. A administração subsequente de interleucina-2 e imagens tumorais bioluminescentes permite o monitoramento longitudinal do crescimento tumoral ortotópico e da resposta à terapia, avaliando particularmente os efeitos citotóxicos específicos do tumor. Essa abordagem recapitula a logística envolvida no desenvolvimento de terapias adotivas de transferência de células para pacientes com câncer de pâncreas. Os resultados demonstram maior eficácia antitumoral de células T reativas a tumores transferidas adotivamente em comparação com controles de linfócitos irrelevantes. Essa metodologia versátil permite o estudo in vivo da imunoterapia adotiva no câncer de pâncreas, bem como a otimização dos parâmetros de processamento celular e regimes de tratamento combinado.

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Protocolo

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A colônia de camundongos está alojada em uma instalação credenciada pela AAALAC International, aderindo a todos os regulamentos e padrões relevantes do USDA, HHS e NIH. O Instituto do Câncer da Universidade Médica de Tianjin e o Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital revisaram e aprovaram todos os procedimentos com animais, incluindo a justificativa para a seleção de cepas, atribuições de grupos experimentais e a justificativa estatística para o número de animais e randomização.

1. Indução de Tumor

  1. Use a linha celular KPC-Luc11 para induzir tumores pancreáticos ortotópicos em camundongos.
  2. Prepare uma suspensão celular tripsinizando as células KPC-Luc, lavando-as duas vezes com PBS e ressuspendendo-as a uma concentração de 1 x 106 células / mL em PBS com uma matriz de membrana basal (BMM) de 30%.
  3. Anestesiar o camundongo com isoflurano em uma dose de indução de 4% e, em seguida, mudar para uma dose de manutenção de 2%. Forneça suporte térmico usando uma almofada de aquecimento e monitor, conforme necessário. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
  4. Desinfete a área cirúrgica várias vezes em movimentos circulares usando um esfoliante à base de iodo e álcool. Administre uma injeção subcutânea de carprofeno 5 mg/kg como analgesia antes da cirurgia. Usando uma lâmina de bisturi estéril, faça uma pequena incisão abdominal esquerda (0,5-1 cm) sob a costela esquerda do camundongo para expor o pâncreas.
  5. Use uma pinça para segurar o baço do camundongo e expor o pâncreas do camundongo, misture as células e injete-as no pâncreas do camundongo com 50.000 células por camundongo. Injetar 50 μL da suspensão celular diretamente no pâncreas usando uma agulha de 29 G.
  6. Retorne o pâncreas do camundongo e suture sequencialmente o peritônio e a pele com suturas.
  7. Deixe o mouse se recuperar em uma almofada quente até que esteja totalmente acordado. Administre 5 mg / kg de carprofeno por via subcutânea como analgesia após a cirurgia diariamente por 3 dias.
  8. Realize imagens ao vivo 7 dias após a injeção para monitorar o crescimento do tumor.
    NOTA: Os tratamentos podem ser administrados nesta etapa.
    1. Injete intraperitonealmente no camundongo sal de D-luciferina potássica (150 μg / mL em PBS, 60 μL por camundongo).
    2. Após a anestesia com isoflurano, posicione o mouse no sistema de imagem in vivo para detecção de bioluminescência. Após a imagem, remova o mouse do sistema e deixe-o se recuperar da anestesia naturalmente.

2. Colha tumores

  1. Eutanasiar os camundongos doadores usando uma câmara de CO2 . Esterilize todo o corpo com etanol a 75%.
  2. Coloque o mouse em um capuz estéril. Use tesouras e fórceps estéreis para abrir a cavidade abdominal.
  3. Remova os tumores e coloque-os em PBS no gelo. Meça o tamanho do tumor com um paquímetro e calcule o volume do tumor usando a fórmula (π x comprimento × largura × largura)/6.

3. Digestão do tumor

  1. Prepare a solução de digestão fazendo 0,125 mg / ml de colagenase, 0,125 mg / ml de Dispase II e 10 ug / ml de DNase I em RPMI 1640 na concentração de 1x. Adicione 1-2 mL de solução de digestão por poço em uma placa de 12 poços.
  2. Pique os tumores em pequenos pedaços usando uma tesoura estéril. Digerir os pedaços tumorais a 37°C com agitação a 70 rpm durante 30 minutos.

4. Coleta de células

  1. Termine a digestão adicionando 2-4 mL de soro bovino fetal a 10%. Transfira todas as células para um tubo de coleta.
  2. Lave os poços com PBS duas vezes para coletar as células restantes. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm ou 70 μm.
  3. Coletar as células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células em BSA a 5% para coloração por citometria de fluxo.

5. Preparação da citometria de fluxo

  1. Prepare células mononucleares do baço ou do sangue periférico (PBMCs) de camundongos não portadores de tumor como controle.
    NOTA: Opcional: PBMCs de camundongos portadores de tumor também podem ser usados como controles.
  2. Corar as células com bloqueadores Fc (<1 μg por milhão de células) e anticorpos de fluxo (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 numa diluição de 1:100).
  3. Incube no gelo no escuro por 30 min. Lave duas vezes com PBS frio e ressuspenda as células em 1% BSA em PBS.

6. Classificação de células

  1. Classificar as células CD45+CD3+ utilizando um citómetro de fluxo. Células vivas de porta baseadas em FSC-A e SSC-A (P1). Em seguida, faça o gate de células únicas de P1 com base em FSC-A e FSC-H (P2).
  2. Finalmente, separe CD45 + CD3 + de P2 usando CD45 e CD3 e colete-os nos tubos coletores. Garantir a ressuspensão adequada e a manutenção da viabilidade celular durante a triagem.

7. Preparação da célula para transferência

  1. Centrifugar células classificadas a 400 x g por 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células no soro do camundongo a uma concentração final de 1 x 106 células / mL. Mantenha as células no gelo.
    NOTA: Pode ser realizada cultura ex vivo ou ativação das células classificadas.

8. Transferência adotiva

  1. Realize a indução do tumor para o camundongo receptor 7 dias antes do dia da transferência.
  2. Injetar 2 x 105 células por camundongo por via intraperitoneal em camundongos receptores usando seringa de insulina 29 G x 1/2 ". Administre IL-2 (50 UI por camundongo) por via intraperitoneal por três dias consecutivos.

9. Monitoramento de tumores

  1. Realize imagens ao vivo no dia 4 e no dia 7 após a transferência para avaliar o crescimento do tumor, com imagens ao vivo adicionais semanalmente com o mesmo procedimento descrito na etapa 1.8.
  2. Acompanhe a sobrevivência dos camundongos receptores. No final do experimento, eutanasiar o camundongo conforme descrito acima. Use tesouras oftálmicas e fórceps para remover os tumores e, em seguida, coloque-os em PBS no gelo para uma medição rápida do tamanho do tumor e pode continuar os experimentos subsequentes conforme necessário.

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Resultados

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Os camundongos receptores são divididos em sete grupos para avaliar minuciosamente a eficácia da transferência de TIL: (a) Controle de solução salina (controle em branco): Camundongos que recebem injeções de solução salina para servir como linha de base. (b) Apenas IL-2 (controle em branco): Camundongos que recebem injeções de IL-2 para explicar quaisquer efeitos da citocina isoladamente. c) O mesmo tratamento único que para os ratinhos dadores tratados (controlo positivo): Ratinhos que r...

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Discussão

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Potencial A imunoterapia para câncer de pâncreas pode melhorar o sistema imunológico para atingir e eliminar células tumorais, envolvendo imunoterapia adotiva, inibidores de checkpoint imunológico e vacinas tumorais12. A terapia TIL extrai e expande os linfócitos dos tumores, que são então reinfundidos nos pacientes. Em comparação com outras terapias celulares adotivas, a terapia TIL tem clonalidade TCR diversa, capacidade superior de homing tumoral e baixa toxici...

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Divulgações

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Os autores declararam não ter conflitos de interesse. Ao usar o ChatGPT e o Claude-3 para edição de linguagem, os autores revisaram e validaram cuidadosamente as palavras e frases geradas pelo ChatGPT ou Claude-3 antes de incluí-las no artigo.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi financiada pelas doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC), número de concessão 82272767 e 82072691 para Y.M. Os autores agradecem aos membros de sua equipe por sua discussão e cooperação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de imagem bioluminescentePerkinElmerIVIS SpectrumPara monitorar o crescimento do tumor
Albumina de soro bovino VSolarbioA8020Para ressuspensão celular
Filtro de células (40 μ m ou 70 μ m)JetCSS013040Para filtrar suspensões celulares
CentrífugaEppendorf5810RPara coleta e preparação de células
Câmara de CO2Tianjin LiliangN/APara eutanásia de camundongos
ColagenaseSigma-AldrichC5138Para solução de digestão
Anticorpo CD3-APCBiolegend100236Para citometria de fluxo coloração
de anticorpo CD45-APC/Fire750Biolegend100154Para coloração por citometria de fluxo
C57BL/6 camundongos albinosJackson Laboratory58Camundongos doadores e receptores
Dispase IIGibco17105-041Para solução de digestão
DNase ISparkJadeAC1711Para solução de digestão
D-Luciferina salde potássioBeyotimeST198-10gPara imagens ao vivo
Etanol (75%)N/APara esterilização
Bloqueadores FcBD Biosciences553142Para coloração por citometria de fluxo
Soro bovino fetalGibcoA5669701Para cultura de células
Citômetro de fluxoBD BiosciencesFACSAria IIIPara classificação de células
IL-2 (Interleucina-2)PeproTech200-02Para administração pós-transferência
IsofluranoShandong AnteN/APara narcotismo
Linha celular KPC-LucPI gerado em laboratório/APara indução de tumores pancreáticos ortotópicos
MatrizMatrigel Corning356234Para implantação ortotópica
PBS (solução salina tamponada com fosfato)ServicebioG4207-500MLPara lavar e ressuspender células
RPMI 1640 médioGibco11875093Para preparar solução de digestão
Capuz estérilESCON/APara extracção e processamento de tumores estéreis
Tesouras e pinçasN/APara extracção de tumores
Sutura (4-0, sutura absorvível PGA)Jinhuan MedicalR413Para fecho de feridas
SeringaJiangxi Fenglin1 mL 0,45 × 16RWLBpara injeção
Placa de cultura de tecidos 12 poçosJetTCP001012para digestão de tumores
N estéreis

Referências

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  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
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  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
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