Artigo de método

Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

DOI:

10.3791/67442

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25 de julho de 2025

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1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, mostramos que a câmara de 0,5 mL para respirometria de alta resolução mostra resultados consistentes com a câmara de 2,0 mL se a correção instrumental apropriada de fundo O2 for aplicada. Requer menos amostra, o que é vantajoso para estudos com disponibilidade limitada ou baixa capacidade respiratória.

Resumo

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A investigação dos fluxos respiratórios é decisiva para a compreensão da complexa interação entre os processos metabólicos. Estudos de células e tecidos com disponibilidade limitada de amostras e baixas taxas respiratórias podem se beneficiar de pequenos volumes experimentais. Examinamos se a câmara de 0,5 mL produz resultados consistentes com a câmara de 2,0 mL em concentrações de amostra idênticas usadas na respirometria de alta resolução com o Oroboros. O fluxo de O2 de fundo foi 4 vezes maior em câmaras de 0,5 mL do que de 2,0 mL na saturação de ar, mas foi reprodutível, permitindo uma correção precisa do fundo. A velocidade ideal de agitação foi entre 550 rotações por minuto (rpm) e 750 rpm na câmara de 0,5 mL. Os fluxos respiratórios em células vivas, células permeabilizadas e mitocôndrias isoladas foram medidos em paralelo nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL, usando protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor com 14 a 20 titulações. Os fluxos de O2 nos diferentes tipos de câmara foram idênticos dentro dos limites de detecção. A câmara de 0,5 mL, que requer cerca de quatro vezes menos amostra do que a câmara de 2,0 mL, oferece uma vantagem significativa para estudos com quantidades limitadas de amostra ou baixas capacidades respiratórias.

Introdução

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A investigação das vias respiratórias mitocondriais é fundamental para esclarecer os mecanismos metabólicos subjacentes a várias doenças, envelhecimento ou respostas ao estresse, fornecendo assim alvos potenciais para intervenções terapêuticas e melhorando as capacidades diagnósticas 1,2,3. A respirometria de alta resolução (HRR) permite a análise detalhada do controle da via mitocondrial e do acoplamento na fosforilação oxidativa (OXPHOS) em uma variedade de tipos de amostras e preparações4. O volume da câmara experimental é uma característica fundamental do projeto dos instrumentos respirométricos. O volume da câmara previamente estabelecido é de 2,0 mL no Oroboros. Este volume foi otimizado para implicar baixo fluxo de fundo instrumental de O2 e garantir a homogeneidade do meio agitado. Esses estão entre os principais critérios de qualidade para a medição precisa da respiração em condições de baixo oxigênio e hiperóxico, necessários para a cinética mitocondrial de oxigênio e fibras musculares permeabilizadas, respectivamente 5,6,7,8,9. Além disso, várias inserções multissensores10 requerem o espaço da câmara de 2,0 mL (Tabela 1).

No presente estudo, examinamos a viabilidade de diminuir o volume da câmara para RFC de 2,0 mL para 0,5 mL. Contagens de células ou quantidades mais baixas de tecido podem ser aplicadas em ensaios respirométricos em uma câmara menor sem comprometer a precisão? O esclarecimento dessa questão é importante para investigar biópsias de tecidos humanos e líquidos, células primárias e culturas de células de crescimento lento1. Da mesma forma, uma redução do volume da câmara é potencialmente vantajosa em estudos de amostras com baixas atividades respiratórias em mitocôndrias defeituosas11 e vias mitocondriais com capacidades inerentemente baixas, como a oxidação de ácidos graxos no cérebro12. No entanto, a resolução pode ser diminuída em tamanho de câmara baixo devido ao aumento desproporcional de artefatos de retrodifusão de O2 e calibração de volume imprecisa13,14. Portanto, analisamos o desempenho instrumental do Oroboros com a câmara de pequeno volume (sV) calibrada a um volume experimental mínimo de 0,5 mL, em comparação com a câmara de volume clássico (cV) calibrada a 2,0 mL. Em particular, analisamos o fluxo de fundo instrumental de O2 e a velocidade de agitação ideal.

Os protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor (SUIT) são usados para avaliar as frequências e estados respiratórios na análise OXPHOS. Os protocolos SUIT compreenderam de 14 a 20 titulações por ensaio respirométrico e envolveram fluxos respiratórios deO2 variando de alguns pmol∙s-1∙mL-1 a centenas de pmol∙s-1∙mL-1. Os estados de controle de acoplamento incluem a taxa de vazamento L, ou seja, o componente dissipativo da respiração, que não está disponível para fosforilar adenosina-5'-difosfato (ADP) em adenosina-5'-trifosfato (ATP) e resulta de vazamento de prótons, deslizamento de prótons, ciclagem catiônica e vazamento de elétrons. A capacidade P de OXPHOS é responsável pela respiração das mitocôndrias quando a transferência de elétrons medida como consumo de O2 (oxidação) é acoplada à síntese de ATP (fosforilação) na presença de ADP. A capacidade de transferência de elétrons E no estado desacoplado é quantificada por titulações de um protonóforo na presença de substratos mitocondriais15. O consumo residual de oxigênio rox é determinado após a adição dos inibidores do Complexo I e do Complexo III rotenona e antimicina A.

Medimos a respiração das células e preparações mitocondriais nas câmaras sV e cV. As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos anucleados de megacariócitos e representam uma fonte facilmente obtida de mitocôndrias humanas. Portanto, as plaquetas foram aplicadas como modelo para células vivas (ou partículas celulares) com membranas plasmáticas intactas. A respiração das células sanguíneas serve como um biomarcador de doenças mitocondriais sistêmicas e se correlaciona com a aptidão bioenergética de órgãos metabolicamente ativos 16,17,18,19, embora esses achados não possam ser generalizados 20,21,22. Os fibroblastos humanos foram escolhidos por sua aplicação como modelo celular de disfunção mitocondrial 1,23,24,25. A integridade das membranas plasmáticas é necessária para a viabilidade celular, mas sua permeabilização seletiva permite a troca de moléculas entre o citosol e o meio circundante. Assim, fibroblastos com membranas plasmáticas quimicamente permeabilizadas foram estudados como um exemplo de células permeabilizadas, em comparação com mitocôndrias isoladas usadas para avaliar a função mitocondrial e necessárias para separar subpopulações mitocondriais26,27.

Protocolo

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Para o estudo em plaquetas humanas, oito voluntários forneceram consentimento informado por escrito para participar do estudo, que foi aprovado pela Autoridade Sueca de Revisão Ética (nº 2013/181). Duas linhagens celulares de fibroblastos de pele humana de recém-nascidos do sexo masculino foram adquiridas da ATCC e usadas de acordo com a aprovação ética do Ministério da Saúde da República Tcheca (projeto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Os procedimentos envolvendo camundongos foram conduzidos de acordo com a Lei Austríaca de Experimentação Animal e em conformidade com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais Vertebrados usados para Fins Experimentais e outros Fins Científicos (Tierversuchsgesetz 2012; Diretiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). O princípio dos 3Rs foi aplicado para minimizar o número de animais experimentais.

1. Calibração de volume

  1. Monte as câmaras de pequeno volume (sV) ou as câmaras de volume clássico (cV) no Oroboros (Figura 1A, B; Tabela 1).
  2. Ligue o Oroboros e conecte-se ao DatLab.
  3. Seque as câmaras.
  4. Pipete 0,54 mL de H2O no sV (0,50 mL de volume experimental efetivo mais 0,04 mL de volume morto capilar) ou 2,07 mL de H2O no cV (2,00 mL de volume efetivo mais 0,07 mL de volume morto capilar).
    NOTA: Para evitar a perda de líquido entre a parte superior do cilindro de vidro e o suporte da câmara de polioximetileno (POM), insira a ponta da pipeta com profundidade suficiente para tocar a parede da câmara de vidro.
  5. Ligue os agitadores.
  6. Antes de fechar a câmara, humedeça os anéis de vedação das rolhas, mantendo o capilar seco. Soltar os anéis de calibração do volume e introduzir as rolhas para baixo até que o líquido encha o capilar da rolha e apareça uma pequena gota no recipiente na extremidade superior do capilar (quadro 1).
  7. Apertar os anéis de calibração do volume para fixar a sua posição de modo a que o volume calibrado seja obtido em inserções consecutivas dos batentes.

2. Configuração geral do Oroboros

  1. Inicie o software DatLab .
  2. Regular a temperatura experimental (37 °C) e a velocidade de rotação de agitação a 550 rpm (9,2 Hz ou rotações por s) na câmara sV ou a 750 rpm (12,5 Hz) na câmara cV. Defina o intervalo de amostragem de dados em 2 s com suavização acima de 80 s (40 pontos de dados) em testes instrumentais de fundo O2 ou 40 s (20 pontos de dados) para respirometria.
    NOTA: As barras agitadoras magnéticas (AlNiCo revestidas com difluoreto de polivinilideno [PVDF]; Tabela 1) são agitados por um campo magnético rotativo pulsado com intensidade de campo de 3,5 mT ao nível do agitador na câmara.
  3. Efectuar a calibração do ar28 no MiR05 ou no mesmo meio de incubação utilizado nas experiências subsequentes.
  4. Realize calibrações de oxigênio zero ocasionalmente, mas nunca imediatamente antes de iniciar os experimentos.
    1. Prepare uma solução reserva de Na-ditionita fresca dissolvendo o pó de O2-Zero em tampão fosfato 50 mM (pH 8,0) a uma concentração de 2,5 mM ou 10 mM paraas câmaras s V ou CV, respectivamente.
    2. Titular o excesso de Na-ditionite para obter o sinal bruto R0 ou a corrente nula [μA] na concentração de O2 0 μM14,28.

3. Teste de fundo instrumental O2

  1. Câmara sV
    1. Após a calibração do ar, feche a câmara. Monitore o sinal de oxigênio por cerca de 60 min até que a concentração de O2 diminua da saturação do ar para aproximadamente 150 μM. Defina quatro marcas J ° 1 a J ° 4 no gráfico 'O2 inclinação negativa'.
      NOTA: Execute este teste de fundo instrumental O2 todos os dias antes de iniciar um experimento.
    2. OPCIONAL: Com uma seringa Hamilton, titular a Na-ditionita preparada de acordo com o passo 2.4.1 para atingir uma concentração de O2 de 100 μM (Figura 1C).
      NOTA: Em outro protocolo, a Na-ditionita é titulada na câmara usando a microbomba de titulação-injeção (TIP2k; Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2) para comparação com um método padrão de determinação do fundo instrumental O2 fluxo28.
  2. Câmara cV
    1. Após a calibração do ar, feche a câmara, aguarde a estabilização da inclinação de O2 e defina a marca J ° 1 na parcela 'O2 slope neg.'28. Com uma seringa de Hamilton, titular a Na-ditionite preparada de acordo com o passo 2.4.1. em passos de 0,7 μL para corresponder ao regime de oxigénio da Câmara sV e diminuir a concentração de O2 para 150 μM.
    2. Adicione outra etapa de titulação de Na-ditionita (ca. 7 μL) para diminuir a concentração de O2 para 100 μM ( Figura 1D ).
  3. Análise de dados de fundo instrumental O2
    1. Calcule a inclinação de fundo instrumental de O2 no DatLab28. Selecione Fluxo/Inclinação no menu superior.
    2. Abra a janela de correção de fundo O2. Selecione Active File como fonte do fundo O2 e selecione as marcas J° a serem usadas para o cálculo da regressão linear. Aplique a correção de fundo O2.

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Figura 1: Câmaras de pequeno volume (sV) e volume clássico (cV) e teste de fundo instrumental O2. (A) Câmara sv. (B) Câmara cv. (C) Traços representativos de marcas de inclinação negativa e J ° 1, sV (0,5 mL; verde) e cV (2,0 mL; azul). (D) Concentração de oxigênio correspondente e marcas R1. Três titulações manuais de Na-ditionita (ca. 0,7 μL, estoque de 10 mM; cV) e titulação final de 7,0 μL de estoque de 2,5 mM e 10 mM na câmara sV e cV, respectivamente. Os picos causados pelas titulações foram eliminados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Adição de amostra às câmaras de Oroboros

NOTA: A amostra pode ser adicionada à câmara por dois métodos: reposição volêmica parcial (plaquetas e fibroblastos no presente estudo) ou reposição volêmica completa (mitocôndrias isoladas no presente estudo).

  1. Substituição parcial do volume
    1. Remova a rolha totalmente inserida. Pipetar e rejeitar um volume Vdo MiR05. Asaída V é de 60-70 μL para plaquetas e 80-150 μL para fibroblastos, calculados de acordo com as concentrações celulares na suspensão de células de estoque.
    2. Equivalente a Vout, pipetar o mesmo volume VJ.i de suspensão de célula de estoque (com concentração de célula conhecida) na câmara (Figura 2).
    3. Calcule a concentração celular experimental no volume real V' (0,54 mL e 2,07 mL), maior que o volume experimental efetivo V (0,5 mL e 2,0 mL).
      NOTA: As concentrações da suspensão de células de reserva e a concentração de células experimentais devem ser planeadas para obter volumes de VJ.i = Vque sejam compatíveis com um pequeno erro de titulação. Nos experimentos com plaquetas, foi utilizado um protótipo de rolha para oV da Câmara com volume morto capilar de 0,05 mL.
  2. Substituição completa do volume
    1. Extrair todo o meio da câmara e substituí-lo por pelo menos 0,54 mL ou 2,07 mL de solução estoque de mitocôndrias isolada na concentração experimental da amostranas câmaras s V ou CV, respectivamente.
    2. Feche a câmara e retire o excesso de solução de reserva mitocondrial do recipiente da rolha.
      NOTA: A reposição completa do volume exclui qualquer variabilidade na concentração mitocondrial que possa ocorrer ao titular para a câmara fechada através do capilar da rolha com uma seringa de Hamilton. Este último método é aplicável a amostras de pequeno diâmetro preparadas em suspensões concentradas (por exemplo, mitocôndrias isoladas); no entanto, expõe células frágeis a danos potenciais das membranas plasmáticas por forças de cisalhamento exercidas na agulha de 51 mm de comprimento da seringa Hamilton (0,41 mm de diâmetro interno). Isto é evitado removendo a rolha e pipetando a amostra para a câmara por substituição parcial ou total do volume. Três tipos de preparações mitocondriais foram estudados. As preparações de amostras são descritas no Arquivo Suplementar 1 1,26,29,30.
  3. Células vivas: plaquetas humanas
    1. Introduzir os criotubos contendo plaquetas num banho-maria a 37 °C e descongelar o conteúdo até restar pouco gelo.
    2. Abra os criogeniais e adicione 1 mL de meio pré-aquecido (DPBS + 10 mM EGTA, 37 ° C) lentamente em gotas.
    3. Misture delicadamente as plaquetas e transfira-as para um tubo de centrifugação de 50 mL com um volume total de 10 mL de meio pré-aquecido (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugar a 1000 g durante 10 min à temperatura ambiente (RT) utilizando um rotor basculante (aceleração 6, travão 2).
    4. Ressuspenda as plaquetas em 0,25 mL de DPBS + 10 mM EGTA (RT) e adicione-as às câmaras por substituição parcial do volume para uma concentração inicial de células experimentais variando de 157 · 106 até 210 · 106 x·mL-1 na câmara de 0,5 mL e de 164 · 106 até 220 · 106 x·mL-1 na câmara de 2,0 mL (ver31 para detalhes sobre a unidade elementar x).
      NOTA: Um Oroboros foi equipado com as câmaras sV e cV nas posições A e B, respectivamente, utilizadas em paralelo com outro Oroboros equipado com as câmaras sV e cV nas posições B e A, respectivamente.
  4. Células permeabilizadas: fibroblastos humanos
    1. Adicionar as células às câmaras de Oroboros por substituição parcial do volume até uma concentração nominal de células de 0,75 · 106 x·mL-1 em ambos os tipos de câmara e calcular a concentração real (passo 4.1.3).
      NOTA: Diferentes instrumentos Oroboros foram usados em paralelo, cada um equipado com ascâmaras SV ou CV.
  5. Mitocôndrias isoladas: coração de camundongo
    1. Adicione 15 μL de suspensão mitocondrial a 5985 μL de meio respiratório mitocondrial (MiR05), resultando em uma concentração de proteína mitocondrial padrão variando de 0,013-0,026 mg∙mL-1.
    2. Adicione a suspensão mitocondrial às câmaras de Oroboros por substituição completa do volume.
      NOTA: Um Oroboros foi equipado com as câmaras sV e cV nas posições A e B, respectivamente, utilizadas em paralelo com outro Oroboros equipado com as câmaras sV e cV nas posições B e A, respectivamente.

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Figura 2: Adição da suspensão celular por reposição parcial de volume. (A) Adição na Câmara de 0,5 mL sV e (B) na Câmara de 2,0 mL cV. (1) Câmara fechada com volumes de meio respiratório V e capilar de rolha cheio Vstc, para medição do fundo instrumental O2 fluxo JO2°. (2) Rolha removida, Vstc drenado para a câmara, resultando em volume total V'= V+Vstc. (3) Remoção parcial do meio Vout = -V J.i. Um volume V''= V'+Vde saída permanece na câmara. (4) Pipetagem de subamostra com volume V J.i de suspensão respirométrica de células de estoque na câmara, resultando em um volume total V# = V+Vstc de suspensão de células diluídas. (5) Câmara fechada com capilar de rolha cheia (volume morto Vstc) para medição do fluxo de O2 específico do volume JV,O 2 num volume experimental V. Esta figura foi modificada da Figura 2A em Contagem de células e normalização em HRR41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Protocolos SUIT

  1. Titular as soluções-mãe dos produtos químicos listados na Tabela Suplementar 1 nas câmaras com microsseringas de Hamilton, ajustando os volumes de titulação para obter as mesmas concentrações experimentais nas câmaras sV e cV (ver legendas das figuras 6, 8, 10).
  2. Selecione o protocolo SUIT-003_D018 32,33 (para plaquetas no presente estudo).
  3. Selecione os protocolos SUIT-001_D004 4,15,34,35 e SUIT-002_D007 4,15,35,36 (para fibroblastos no presente estudo).
  4. Selecione o protocolo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (para mitocôndrias isoladas no presente estudo).

6. Análise de dados SUIT

  1. No DatLab, defina marcas para definir seções de gráficos selecionados.
  2. Selecione Fluxo/Inclinação no menu superior. Abra a janela Fluxo/Inclinação . Aplicar a correção do volume de titulação para diluição de amostras suspensas por cada titulação no protocolo SUIT.
  3. Selecione Marcas no menu superior. Abra as estatísticas de marca para mostrar a mediana dos pontos de dados marcados corrigidos pela linha de base por subtração do consumo de oxigênio residual (rox).
  4. Calcular o intercepto e a inclinação entre os resultados pareados obtidos nas câmaras sV e cV por meio de análise de regressão invertida25,28 usando uma planilha.
  5. Comparar as freqüências respiratórias no estado rox (fluxos mínimos de O2) nas câmaras sV e cV por meio de um teste t de Student pareado usando o software jamovi 2.3.1338.
    NOTA: Como as duas câmaras em um instrumento Oroboros são funcionalmente independentes (exceto para temperatura e intervalos de gravação do DatLab), as medições em cada câmara podem ser consideradas separadamente, semelhante ao uso de instrumentos diferentes. Os resultados finais podem ser relatados como medianas ou médias de múltiplas câmaras com informações sobre sua variabilidade.

Resultados

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Espera-se que os sinais brutos R1 [μA] dos sensores de oxigênio (POS) sejam independentes do volume da fase aquosa em equilíbrio com a fase gasosa do ar na câmara 'aberta', conforme confirmado em Tabela suplementar 2. Na câmara fechada, no entanto, o fundo instrumental O2fluxo próximo à saturação do ar J°1[pmol∙s-1∙mL-1] depende do volume V (Tabela suplementar 2). The O2Consumo do sensor [PMOL∙s-1] pode ser previsto a partir do fluxo de elétrons medido como o sinal bruto corrigido para zero R1-R0 [μA], o número de carga 4 e-/O2e a constante de Faraday F = 96 485.33 C∙mol-1. 1 μA é equivalente a um fluxo de elétrons (e-) de 10,36 pmol∙s-1. Dividir pelo número de carga resulta em um O2fluir15,39 de 2.591 pmol∙s-1·μA-1. A mediana registrada de R1-R0 foi de 2,09 μA e 1,98 μA nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL, respectivamente (Tabela suplementar 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA no sV e R0 = 0,004 ± 0,003 μA no cV câmaras), correspondendo teoricamente a O2Taxas de consumo de 5,41 pmol∙s-1e 5,13 pmol∙s-1. The O2O fluxo do sensor é convertido no fluxo específico do volume esperado na saturação do ar (J°R1) em 5,41 pmol∙s-1/0,5 mL = 10,82 pmol∙s-1∙mL-1e 5,13 pmol∙s-1/2,0 mL = 2,56 pmol∙s-1∙mL-1no sV e cV câmara, respectivamente. Com o mesmo tipo de sensores polarográficos de oxigênio na câmara de 2,0 mL e 0,5 mL, o fundo específico do volume O2fluxo - calculado a partir do atual R1-R0 (J°R1) - aumenta teoricamente 4 vezes na proporção inversa ao volume da câmara. J°ar (na saturação do ar, onde a difusão de retorno é zero; compare Mesa 2 e Tabela suplementar 3) foi calculado para o O2concentração na saturação do ar a partir da regressão linear do teste experimental de fundo (Figura 3). J°ar aproximaram-se dos valores teoricamente esperados J°R1 para ambas as câmaras (Mesa 2). O J°ar / J°R1foi de 0,85 ± 0,04 e 0,92 ± 0,12 no SV e cV câmara, respectivamente, de acordo com uma série independente de 52 medidas na câmara de 2,0 mL, na qual essa relação foi de 0,95 ± 0,12 (Tabela suplementar 4). J°ar foi 3,9 vezes maior na câmara de 0,5 mL do que na câmara de 2,0 mL. O O líquido O2difusão de volta J°50, calculado a 50 μM O2da regressão linear do teste de fundo experimental, foi apenas três vezes maior na câmara de 0,5 mL (Mesa 2). A variabilidade do fundo instrumental O2Os fluxos de fluxo foram quase idênticos nos dois volumes de câmara diferentes, com desvio padrão (DP) de 0,5 e 0,3 pmol∙s-1∙mL-1durante J°ar e 0,9 e 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 durante J°50no sV e cV câmara, respectivamente (Mesa 2). Apesar do fundo instrumental mais alto O2inclinações na câmara de 0,5 mL, a dependência do fundo O2fluxos em cO2foi altamente reprodutível em ambos os tipos de câmara (Figura 3D). Isso resulta em valores baixos dos resíduos <±1 pmol∙s-1∙mL-1para ambas as câmaras (Tabela suplementar 5), em conformidade com o limite de deteção do Oroboros28.

Quantificamos o efeito da velocidade de agitação no sinal bruto de calibração R1 do POS entre 350 rpm (5,8 Hz) e 950 rpm (15,8 Hz) em passos de 100 rpm (1,7 Hz) com a câmara na configuração 'aberta'. Nesta configuração, o O2 dissolvido no meio está em equilíbrio com a fase gasosa; portanto, mudanças no sinal bruto (microampere [μA]) em função da velocidade de agitação não refletem diferenças verdadeiras em cO2. Os sensores de oxigênio responderam a uma mudança na velocidade de agitação com um pequeno desvio de R1 na velocidade padrão de 750 rpm, independente do volume da câmara (Figura 4). Na configuração 'aberta', o ruído da inclinação de O2, definido como SD para cada passo após a estabilização do sinal, foi menor a 850 rpm em ambos os tipos de câmara e aumentou quando a velocidade de agitação se desviou desse valor em qualquer direção (Figura 5A). Abaixo de 550 rpm, o ruído da inclinação de O2 excedeu o limite de ±4 pmol∙s-1∙mL-1, definindo a velocidade mínima de agitação prática. Devido a limitações técnicas, o limite superior não foi atingido, tornando 950 rpm como a velocidade máxima de agitação prática (Figura 5A). Dentro dessa faixa, o desvio do sinal de O2 de R1 foi de <2,5%. O fechamento das câmaras não alterou a relação entre ruído e velocidade de agitação (Figura 5B). A constante de tempo exponencial τ foi de 2,53 ± 0,05 s a 550 rpm e 2,50 ± 0,05 s a 750 rpm para a câmara de 0,5 mL (Figura Suplementar 3).

O protocolo SUIT-003_D018 aplicado às plaquetas inclui até 14 etapas de titulação. Ele é projetado para estudar o controle de acoplamento de células vivas, ce e permeabilidade da membrana plasmática como um índice de viabilidade celular32. O fluxo de oxigênio medido nos dois tipos de câmaras (Figura 6) foi fortemente compatível em todos os estados respiratórios (Figura 7). Reoxigenações intermitentes são necessárias para evitar hipóxia funcional ou restringir a concentração experimental de O2 a uma faixa definida. As reoxigenações foram realizadas abrindo a câmara para a posição 'aberta' após a titulação do Rot. Ao fechar a câmara, o fluxo de O2 se estabilizou em 4 min na câmara de 2,0 mL, mas aproximadamente 10 min foram necessários na câmara de 0,5 mL antes da estabilização e ajuste da nova marca (Figura 6 e Figura Suplementar 4). A reoxigenação no estado rox quando os fluxos de O2 são baixos evita um declínio da concentração de O2 durante o tempo necessário para a estabilização. O rox inibido pela rotenona foi de 0,9 ± 0,6 e 2,0 ± 0,6 pmol∙s-1∙mL-1 a 98 ± 17 e 94 ± 17 μM O2 (média ± DP) nas câmaras sV e cV, respectivamente. O Rox aumentou em 3,1 ± 0,9 e 0,9 ± 0,4 pmol∙s-1∙mL-1 após a reoxigenação para 159 ± 8 e 147 ± 11 μM O2 nas câmaras sV e cV, respectivamente. A dependência de oxigênio do rox observada nas plaquetas concorda com os resultados em fibroblastos humanos e células endoteliais da veia umbilical40.

Para a análise do OXPHOS em fibroblastos permeabilizados, foram utilizados dois protocolos SUIT com até 17 e 20 etapas de titulação (SUIT-001 e SUIT-002, respectivamente35; Figura 8); assim, a correção do volume de titulação é particularmente importante, pois no final do SUIT-002, a diluição foi de no máximo 14% e 10,5% na câmara sV e cV, respectivamente. Contagens de células de fibroblastos de 0,35 ·10 6 x e 1,44 ·10 6 x nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL, respectivamente, resultaram na mesma concentração de células de 0,75 ·10 6 x ∙ mL-1. A combinação de SUIT-001 e SUIT-002 abordou 20 estados respiratórios, todos os quais se correlacionaram estreitamente nos tipos de duas câmaras (r2 = 0,950 para SUIT-001 e r2 = 0,959 para SUIT-002). Em ambos os protocolos, o Complexo IV teve uma dispersão relativamente alta (Figura 9). A reoxigenação não foi necessária no SUIT-001 começando com um fluxo de O2 específico de baixo volume de 18,7 ± 7,0 pmol∙s-1∙mL-1 no estado de rotina (DP médio ±), permitindo que a concentração de O2 diminuísse para 56 μM até a seção ligada ao CIV do protocolo (Figura 8A; 8Ama). No entanto, no SUIT-002, a reoxigenação foi realizada antes das titulações do desacoplador, aumentando a concentração de O2 de 100 μM para 180 μM (Figura 8B; 6Gp). Considerando o longo tempo necessário para a estabilização do fluxo após a reoxigenação, a reoxigenação durante as titulações do desacoplador deve ser evitada.

Um protocolo SUIT abreviado foi aplicado às mitocôndrias isoladas (Figura 10). A concentração de proteína mitocondrial foi determinada após o ensaio respirométrico, impossibilitando a definição antecipada da concentração precisa da amostra na câmara. O fluxo respiratório específico do volume varia em função da concentração mitocondrial. Portanto, os dados foram apresentados como fluxo específico de volume e específico de massa de proteína (Figura 11). Ambas as representações mostram a estreita correlação entre as medidas obtidas nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL (Figura 11).

O consumo residual de oxigênio rox medido após a inibição do Complexo III pela antimicina A pode ser usado como um índice de desempenho instrumental em frequências respiratórias muito baixas. Em todas as séries experimentais, o rox foi comparável entre as câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL (plaquetas: t(5) = -0,34, p = 0,74; fibroblasto: SUIT-001: t(10) = 20,00, p = 0,06; SUIT-002: t(10) = 11,00, p = 0,96; mitocôndrias isoladas: t(4) = -1,18, p = 0,27). A dispersão dos dados correspondeu em grande parte à incerteza instrumental de ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28, conforme ilustrado na Figura 12. Os arquivos originais estão disponíveis para acesso aberto no repositório Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

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Figura 3: Fluxo de fundo instrumental O2 para as câmaras sV (0,5 mL; verde e preto) e cV (2,0 mL; azul). Faixa de concentração de O2 de saturação do ar (ca. 180 μM) a ca. 50 μM. Símbolos abertos: Concentrações de O2 obtidas sem Na-ditionita. Símbolos sólidos: Concentrações de O2 controladas por titulações manuais de Na-ditionite. Círculos pretos: Concentrações de O2 controladas por titulações de Na-ditionito usando o TIP2k na câmara de 0,5 mL (N = 8). Os resultados dos testes de fundo instrumentais foram agrupados de (A) Série 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) antes de usar células vivas (ce); (B) Série 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) antes do uso de células permeabilizadas (pce); (C) Série 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) antes de usar mitocôndrias isoladas (imt). (D) Dados sobrepostos dos painéis A-C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Efeito da velocidade de rotação da agitação no sinal POS na saturação do ar (câmara 'aberta') na câmara de 0,5 mL (verde) e câmara de 2,0 mL (azul). Resposta [%] em relação aos sinais de calibração de ar corrigidos por R0 R1-R0 [μA] a 750 rpm (sV: N = 4; cV: N = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Ruído da inclinação de O2 em função da velocidade de rotação da agitação. Ruído expresso como desvio-padrão em (A) câmara «aberta»; (B) câmara fechada (0,5 mL, verde; 2,0 mL, azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Consumo deO2 de plaquetas humanas criopreservadas na câmara de 0,5 mL. Traços representativos da concentração de O2 [μM] (linhas azuis) e fluxo de O2 por célula [amol∙s-1∙x-1] calculados como fluxo de O2 [pmol∙s-1∙mL-1] dividido pela concentração celular de 157∙106 x∙mL-1 (linhas vermelhas, corrigidas para o fluxo de O2 de fundo instrumental; os picos causados por titulações foram eliminados). A concentração de O2 foi mantida acima de 50 μM por reoxigenações intermitentes (ar, câmara 'aberta', sombra azul). Sequência de estados respiratórios (titulações e taxas; protocolo SUIT-003_D018): ce1, respiração de rotina R de células vivas. ce1P, piruvato 5 mM como substrato externo. ce2Omy10 (painel A), titulações Omy em passos de 5 nM; vazamento respiratório L. ce3U0,3 (painel A) e ce3U0,1 (painel B), titulações do desacoplador para concentração ótima de CCCP de 0,3 e 0,1 μM, respectivamente; Capacidade ET E. ce3Glc, glicose 11 mM; E progressivamente inibido pelo desacoplador. ce4Podridão consumo de oxigênio residual rox. ce5S, succinato 10 mM; estimulando E em células permeáveis à membrana plasmática. 1Dig15 (painel A) e 1Dig10 (painel B), titulações de digitonina em etapas de 5 μg·mL-1 para concentrações ótimas de 15 e 10 μg·mL-1, respectivamente, para permeabilização completa da membrana plasmática; capacidade de ET da via do succinato SE. 1c, citocromo c 10 μM; teste de integridade da membrana externa mitocondrial. 2Ama, antimicina A 2,5 μM inibindo CIII; rox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Correlação da respiração de plaquetas humanas criopreservadas medidas na câmara de 0,5 mL e 2,0 mL. O fluxo deO2 corrigido para Rox foi avaliado no protocolo SUIT-003_D018 (Figura 6); N = 6. (A) Com oligomicina Omy; (B) sem Omy. Inclinações figure-results-6 médias e interceptações figure-results-7 de regressão de mínimos quadrados invertidos e coeficientes de determinação r2 calculados a partir de todos os dados. Linhas pretas tracejadas representam as linhas de identidade. As linhas vermelhas representam as linhas de regressão calculadas. Os fluxos de O2 no estado após a adição de glicose foram excluídos (ver Figura 6). Os protocolos com e sem oligomicina são separados nos painéis A e B para evitar sobreposição de pontos de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Consumo de fibroblastos de O2 na câmara de 0,5 mL. Traços representativos de cO2 (linhas azuis [μM]) e fluxo de O2 por célula calculado como fluxo de O2 [pmol∙s-1∙mL-1] dividido pela concentração celular (0,75·106 x∙mL-1), corrigido para o fluxo de O2 de fundo instrumental (linhas vermelhas, picos causados por titulações foram eliminados). A concentração de O2 foi mantida acima de 50 μM por reoxigenações intermitentes (ar, câmara 'aberta', sombra azul). Sequência de estados respiratórios (titulações e frequências). (A) Protocolo SUIT-001_D004: ce1, respiração de rotina R. +Dig, digitonina 10 μg·mL-1 (ce a pce), respiração endógena residual ren. 1PM, piruvato 5 mM & malato 2 mM; Vazamento da via N RESPIRAÇÃO NL. 2D, ADP 2,5 mM; N-via OXPHOS capacidade NP. 2c, citocromo c 10 μM; teste de integridade da membrana externa mitocondrial. 3U1.5, titulações do desacoplador para concentração ótima de CCCP 1.5 μM; Capacidade de ET vinculada a NADH NE. 4G, glutamato 10 mM; N(PGM)E. 5S, succinato 10 mM; Capacidade de ET da via NSNS E. 6Podridão rotenona 0,5 μM; capacidade de ET da via do succinato SE. 7Gp, glicerofosfato 10 mM; SGpE. 8Ama, antimicina A 2,5 μM; rox. 9AsTm, ascorbato 2 mM & TMPD 0.5 mM; substratos para estimulação de CIV; a câmara foi mantida aberta por 20 min para permitir o equilíbrio redox sem depleção de oxigênio4; O2 fluxo fora da escala após o fechamento da câmara (205 amol·s-1·x-1). 10Azd, azida 100 mM; fluxo de fundo químico dependente de oxigênio chb. (B) Protocolo SUIT-002_D007: ce1, R. + Cavar, ren. +D, estimulando ren. +M.1, malato 0,1 mM e 1Oct, octanoilcarnitina 0,5 mM; Capacidade OXPHOS da via FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, malato 2 mM suportando a via N anaplerótica; F (N) P. 3P e 4G, ativação progressiva para FNP. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7U1.5, FNSGpE. 8Rot, SGpE. 9Ama, rox. 10AsTm O2 fluxo fora da escala 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, cap. Em geral, a atividade do Complexo IV é a diferença de taxas, J(AsTm)-J(Azd) em concentrações de O2 muito parecidas. Consulte a Figura 6 para obter mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Correlação da respiração de fibroblastos permeabilizados na câmara de 0,5 mL e 2,0 mL. Fluxo deO2 corrigido por Rox em (A) SUIT-001_D004 e (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Inclinação figure-results-10 média e interceptação figure-results-11 da regressão dos mínimos quadrados invertidos e coeficiente de determinação r2 calculados a partir de todos os dados. A linha preta tracejada representa a linha de identidade. As linhas vermelhas representam as linhas de regressão calculadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Consumo de O2 de mitocôndrias isoladas do coração de camundongos em câmaras de 0,5 mL (verde) e 2,0 mL (azul). Traços representativos de (A) fluxo deO2 específico de massa na concentração de proteína mitocondrial 0,023 mg∙mL-1 (corrigido para fluxo de O2 de fundo instrumental, picos causados por titulações foram eliminados) e (B) concentração de O2 [μM]. Sequência de estados respiratórios (titulações e taxas) seguindo o protocolo SUIT-002_D005: imt, ren respiratório endógeno residual. +D, ADP 2,5 mM; Estimulando Ren. +M.1, malato 0,1 mM e 1Oct, octanoilcarnitina 0,5 mM; Capacidade OXPHOS da via FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, citocromo c 10 μM; teste de integridade da membrana externa mitocondrial. 2M2, malato alto 2 mM suportando a via N anaplerótica; F (N) P. 3P, piruvato 5 mM; FNP. 4G, glutamato 10 mM; FNP. 5S, succinato 10 mM; FNSP. 6Gp, glicerofosfato 10 mM; FNSGpp. 7U0,5, titulações do desacoplador para concentração ideal de CCCP 0,5 μM; FNSGpE. 8Rot, rotenona 0,5 μM inibindo IC; SGpE. 9Ama, antimicina A 2,5 μM inibindo CIII; consumo de oxigênio residual rox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11: Correlação da respiração de mitocôndrias cardíacas isoladas de camundongos medidas nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL. O2 no protocolo mostrado na Figura 10 (N = 4). (A) Fluxo de O2 específico do volume. (B) Fluxo de O2 corrigido por Rox dividido pela concentração de proteína mitocondrial (0,013 - 0,026 mg∙mL-1). Inclinação figure-results-14 média e interceptação figure-results-15 da regressão dos mínimos quadrados invertidos e coeficiente de determinação r2 calculados a partir de todos os dados. As linhas pretas tracejadas representam a linha de identidade. As linhas vermelhas representam a linha de regressão calculada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 12: Rox de consumo de oxigênio residual nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL. Fluxo por volume medido após a adição de antimicina A, combinado a partir de experimentos com células vivas (ce, quadrados), células permeabilizadas (pce, círculos) e mitocôndrias isoladas (imt, triângulos). Inclinação figure-results-17 média e interceptação figure-results-18 da regressão dos mínimos quadrados invertidos. Linha tracejada: linha de identidade. Linha vermelha: linha de regressão calculada. Sombra: faixa de resolução instrumental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

MódulosVcV
Volume V da câmara experimental0,5 mL2,0 mL
Diâmetro interno do cilindro de vidro12,0 milímetros16.0 milímetros
Diâmetro externo do cilindro de vidro24.0 milímetros24.0 milímetros
Espessura da parede de vidro6,0 milímetros4,0 milímetros
Barra agitadora revestida com PVDF11,5 x 6,2 milímetros15,0 x 6,0 milímetros
Diâmetro capilar da rolha1,00 milímetros1,30 milímetros
Área da seção transversal capilar da rolha0,79 milímetros21,33 mm2
Comprimento capilar da rolha50,64 milímetros48,86 milímetros
Volume capilar da rolha39,8 μL64,9 μL
Rolha capilar volume morto Vstc incluindo uma pequena quedaa0,04 mL0,07 mL
Volume V' para calibração de volume0,54 mL2,07 ml

umA queda deve corresponder a 5 μL para a Câmara cV e próxima a 0 μL para a Câmara sV.
Tabela 1: Dimensões dos módulos de pequeno volume (sV) e volume clássico (cV) com rolhas de poliéter éter cetona (PEEK).

J ° ar / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Volume V da câmara experimental0,5 mL2,0 mL0,5 mL2,0 mL
Significar9.222.37-3.17-1.17
Mediana9.252.36-3.08-1.04
Desvio padrão0.490.340.930.83
Mínimo8.201.79-5.11-3.72
Máximo10.413.42-0.820.67

Quadro 2: J°ar extrapolado para saturação do ar e J°50 calculado à concentração de 50 μM O2 . Dados agrupados de testes de fundo instrumentais nas Séries 2 (pce) e 3 (imt) e antes das titulações TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60).

Processo suplementar 1: Preparações de amostras. Plaquetas humanas, fibroblastos humanos e mitocôndrias isoladas de corações de camundongos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Teste de fundo instrumental O2 usando o TIP2k. Traços representativos do teste realizado usando o TIP2k para titular Na-ditionita (2,5 mM) na câmara de 0,5 mL. Médio: MiR05, temperatura: 37 °C, velocidade de agitação: 750 rpm. Os picos causados pelas titulações foram eliminados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Fundo instrumental O2 fluxo J ° 1 em função da concentração de O2 . Câmara sV (0,5 mL; verde, N = 48) e Câmara cV (2,0 mL; azul, N = 60) nas Séries 2 (pce, círculos) e 3 (imt, triângulos), e antes das titulações TIP2k na câmara de 0,5 mL (círculos pretos, N = 8). Linhas vermelhas: mediana ± DP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Constante de tempo exponencial τ em função da velocidade de rotação de agitação. Valores individuais de τ para a câmara de 0,5 ml a 37 °C (N = 2). Na câmara de 0,5 mL, τ foi de 2,53 ± 0,05 s a 550 rpm, 2,50 ± 0,05 s a 750 rpm e 2,47 ± 0,04 s a 850 rpm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Consumo deO2 de plaquetas humanas criopreservadas na câmara de 2,0 mL. Traço representativo do protocolo SUIT-003_D018, incluindo titulações de oligomicina (Omy). O fluxo [pmol∙s-1∙mL-1] foi corrigido para o fluxo de fundo instrumental de O2 e dividido pela concentração celular (164∙106 x∙mL-1). Os picos causados pelas titulações foram eliminados. cO2 foi mantido acima de 60 μM por reoxigenações intermitentes (ar, câmara 'aberta', sombra azul). Sequência de estados respiratórios (titulações e taxas): ce1, respiração de rotina R de células vivas. ce1P, piruvato como substrato externo. ce2Omy10, titulações de Omy em passos de 5 nM; vazamento respiratório L. ce3U2.0, titulações do desacoplador para concentrações ótimas de 2 μM; Capacidade ET E. ce3Glc, glicose 11 mM; E progressivamente inibido pelo desacoplador. ce4Rot, rotenona 0,5 μM inibindo IC; consumo de oxigênio residual rox. ce5S, succinato 10 mM; estimulando E em células permeáveis à membrana plasmática. 1Dig20, titulações de digitonina para concentrações ótimas de 20 μg·mL-1, para permeabilização completa da membrana plasmática; capacidade de ET da via do succinato SE. 1c, citocromo c 10 μM; teste de integridade da membrana externa mitocondrial. 2Ama, antimicina A 2,5 μM inibindo CIII; rox. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Produtos químicos usados nos protocolos de titulação de inibidor de substrato (SUIT). Abreviaturas e concentrações de solução de estoque para as câmaras sV e cV . Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Comparação de R1-R0 e J°1 nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL. Dados agrupados de testes de fundo instrumentais nas Séries 2 (pce) e 3 (imt) e antes das titulações TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). Os dados foram calculados apenas das séries experimentais 2 (pce) e 3 (imt), que foram realizadas a uma pressão barométrica média de 94,9 kPa (Innsbruck, Áustria), excluindo os dados da série 1 (ce) obtidos ao nível do mar. O mesmo tipo, mas diferentes PDVs individuais foram usados nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL. Portanto, a variabilidade entre os sensores deve ser considerada ao comparar as câmaras sV e cV. Enquanto J ° 1 = 2,26 ± 0,41 pmol∙s-1∙mL-1 obtido experimentalmente para a câmara de 2,0 mL correspondeu de perto ao valor calculado, o experimental J ° 1 = 8,48 ± 0,53 pmol∙s-1∙mL-1 para a câmara de 0,5 mL foi menor do que o esperado. Isso foi explicado pelas seguintes observações. Após o fechamento da câmara, o fluxo de O2 de fundo mais alto na câmara de 0,5 mL reduz as concentrações de O2 nas marcas de J ° 1 definidas em intervalos de tempo comparáveis (Figura 1). A concentração de oxigênio em J°1 foi em média 4,06% e 1,72% abaixo da saturação de ar na câmara de 0,5 mL e 2,0 mL, respectivamente (Figura Suplementar 2, Tabela Suplementar 2). Em cO2 mais baixo, o consumo diminuído de O2 pelo sensor e alguma difusão reversa de O2 reduzem o J ° 1 determinado experimentalmente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Concentração de oxigênio [μM] na qual a calibração (R1) e J°1 foram obtidos e sua % de diferença. Dados agrupados de testes de fundo instrumentais nas Séries 2 (pce) e 3 (imt) e antes das titulações TIP2k (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 mL: N = 60). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: J°1 medido e esperado na câmara de 2,0 mL. Série independente de testes de fundo instrumentais com O2k série A (com rolhas de titânio13), V = 2,0 mL (37 °C, solução de NaCl com fator de solubilidade de O2 0,92; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. Com base na suposição de que a retrodifusão de O2 é insignificante em cO2,1, o que é verdade apenas em cO2,1 ~ cO2 *. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 5: Resíduos de regressão linear (valores absolutos [pmol O2∙s-1∙mL-1]) calculados para cada teste instrumental de fundo O2. Dados agrupados de testes de fundo instrumentais nas Séries 2 (pce) e 3 (imt) e antes das titulações TIP2k. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A quantidade de amostra disponível para respirometria é frequentemente limitada, por exemplo, em estudos de biópsias, células primárias ou culturas de células de crescimento lento com baixa contagem de células1. Além disso, as atividades respiratórias são deprimidas devido a lesões mitocondriais11 ou ao investigar vias mitocondriais com baixas capacidades, como a oxidação de ácidos graxos12. Nesses casos, um baixo volume da câmara respirométrica oferece vantagens para a resolução do fluxo deO2. No entanto, os fluxos de O2 de fundo instrumental aumentam em volumes de câmara mais baixos e induzem erros quando não medidos de forma confiável e não são corrigidos adequadamente em função da concentração de O2. A replicabilidade dos testes de fundo instrumentais de O2 e as correções de fundo são particularmente importantes para baixos volumes de câmara. Valores quase idênticos do fluxo teórico (J ° R1) e experimental (J ° ar) O2 fornecem evidências da precisão da medição polarográfica com 4 e- / O2 na reação catódica do POS. A diferença entre J°R1 e J°air foi de 1,64 ± 0,43 e 0,22 ± 0,31 pmol∙s-1∙mL-1 na câmara sV e cV, respectivamente, indicando uma precisão nas medidas que se enquadra no limite de detecção da câmara de 2,0 mL (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. Com o mesmo tipo de sensores polarográficos de oxigênio na câmara de 2,0 mL e 0,5 mL, o fluxo de O2 de fundo específico do volume aumentou 4 vezes em proporção inversa ao volume da câmara, e a variabilidade foi quase idêntica nos dois volumes da câmara, com DP de 0,5 e 0,3 pmol∙s-1∙mL-1 para J°air e 0,9 e 0,8 pmol∙s-1∙mL-1 para J°50 no sV e cV respectivamente (Tabela 2). Nas atividades respiratórias mínimas - para as quais a câmara de pequeno volume foi projetada - mesmo pequenos efeitos de fundo tornam-se significativos (Tabela Suplementar 3; Figura suplementar 2). Portanto, a avaliação de rotina do fluxo de fundo instrumental O2 (Figura 1) é necessária para aplicar a correção adequada28.

A agitação alta e constante do meio é necessária para manter um sistema homogêneo e garantir um sinal de oxigênio estável. A velocidade de agitação de 750 rpm é estabelecida para a câmara de 2,0 mL, mas a velocidade ótima não era conhecida na câmara de 0,5 mL. As diferentes geometrias da câmara de vidro e da barra do agitador (Tabela 2) requerem uma avaliação independente da velocidade de agitação ideal. Os sensores de oxigênio responderam a mudanças na velocidade de agitação entre 550 rpm e 950 rpm, com um pequeno desvio do sinal de O2 R1 a 750 rpm, independente do volume da câmara. A constante de tempo exponencial τ avaliada para oV da Câmara estava de acordo com o τ relatado para a câmara de 2,0 mL na mesma velocidade de agitação13. Esses resultados sugerem que a agitação é igualmente eficaz em ambas as geometrias da câmara e que a velocidade de agitação padrão de 750 rpm (câmara de 2,0 mL) pode ser aplicada à câmara de 0,5 mL. Nas configurações de câmara 'aberta' e 'fechada', a câmara de 0,5 mL apresentou uma relação sinal-ruído mais alta, sugerindo maior precisão como uma vantagem da câmara de 0,5 mL (Figura 5), embora o efeito da variabilidade individual da POS não possa ser excluído. Como o ruído não aumentou ao diminuir a velocidade de agitação de 750 rpm para 550 rpm, reduzir a velocidade de agitação para 550 rpm na câmara de 0,5 mL pode ser benéfico para minimizar a tensão de cisalhamento sem comprometer a relação sinal-ruído.

Taxas de consumo de O2 quase idênticas foram medidas nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL em três modelos experimentais quando a correção de fundo apropriada foi aplicada. Os resultados obtidos com plaquetas pequenas de 2 μm de diâmetro42, fibroblastos vivos e permeabilizados e mitocôndrias isoladas sugerem que taxas respiratórias consistentes podem ser obtidas nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL em uma ampla gama de tipos de células e preparações mitocondriais. As fibras musculares permeabilizadas, no entanto, não foram testadas no presente estudo. A medição precisa do rox requer controle dos níveis de oxigênio40 e alta resolução instrumental1. O fluxo de O2 específico do volume de rox pode ser tão baixo quanto o limite de detecção. As reoxigenações não são necessárias quando baixas contagens de células ou geralmente baixas quantidades de amostras são usadas em um experimento. Se necessário, no entanto, recomenda-se realizar reoxigenações em estados respiratórios com baixo fluxo deO2 para evitar um rápido declínio da concentração deO2 durante o período necessário para a estabilização do fluxo deO2. A estabilização do fluxo deO2 após a reoxigenação leva mais tempo na câmara de 0,5 mL.

Como contribuição para o controlo de qualidade, deve ser dada especial atenção à diluição da amostra em suspensão durante a substituição parcial do volume. Após a remoção da rolha totalmente inserida, o volume total V' do meio respiratório na câmara é dado pelo volume experimental V e pelo volume capilar da rolha Vstc (Tabela 2). Portanto, o volume de estoque V J.i é diluído no volume real V', que é maior que V, resultando em um fator de diluição V/V' de 0,5/0,54 = 0,926 e 2,0/2,07 = 0,966 nas câmaras de 0,5 mL e 2,0 mL, respectivamente (Figura 2). Nos experimentos com plaquetas, foi utilizado um protótipo de rolha para oV da Câmara com volume morto capilar de 0,05 mL, correspondendo a um fator de diluição de 0,909.

Quantidades quase quatro vezes menores de células vivas, células permeabilizadas e mitocôndrias isoladas são necessárias na câmara de 0,5 mL do que na câmara de 2,0 mL em concentrações de amostra idênticas (quantidade por volume), produzindo resultados quantitativamente comparáveis do consumo respiratório deO2 normalizado para contagem de células ou massa de proteína. Isso indica que oV da Câmara é uma ferramenta valiosa para estudos em que a quantidade de amostras disponíveis é limitada. Por outro lado, a aplicação de uma quantidade idêntica de amostra na CâmaraV aumenta o fluxo de O2 específico do volume e, portanto, reduz a incerteza das medições quando as atividades respiratórias são baixas.

O regime de oxigênio no presente estudo foi restrito à faixa de O2 de saturação do ar a 30 μM. A aplicabilidade em níveis de oxigênio além dessa faixa requer uma avaliação mais aprofundada para investigar a função mitocondrial na normóxia ou hipóxia tecidual43 e tecidos permeabilizados na hiperóxia9. Várias configurações multissensores dos módulos Oroboros NADH e Q; pH, NO e TPP+-eletrodos10,44 - não podem ser acomodados na Câmara sV e requerem a câmara de 2,0 mL.

Divulgações

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EL é funcionário da Oroboros Instruments. EG é o fundador e CEO da Oroboros Instruments.

O LFGS foi contratado pela Oroboros Instruments durante o projeto. A EÅF e a EE são funcionários da Abliva AB, Lund, Suécia, que mantém um acordo comercial com a Oroboros Instruments.

O LR declara não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Manuela Passrugger pela coleta dos dados sobre mitocôndrias isoladas, Patrizia Guerth pelo suporte técnico no teste da velocidade de rotação da agitação e Mateus Grings pela análise da constante de tempo dos testes do agitador. Agradecemos ao nosso parceiro, WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Áustria, pelas informações sobre os dados técnicos das câmaras de vidro, rolhas e intensidade do campo magnético. Agradecemos a Luiza HD Cardoso, Alejandra Romero-Martinez, Ondrej Sobotka, Alba Timon-Gomez e Jaime Willis por seus comentários. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção nº 859770, projeto NextGen-O2k. Contribuição para a Ação COST CA15203 MitoEAGLE com o apoio financeiro de missões científicas de curto prazo (LFGS, LR).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/software
ADPMerck, Alemanha117105
Antibióticos-antimicóticos 100xBiosera, FrançaXC-A4110CUIDADO H317 Pode causar uma reação alérgica na pele
Antimicina ASigma-Aldrich, EUAA8674ATENÇÃO H300  Fatal se ingerido, H400 perigo aquático de curto prazo (agudo)
AscorbateSigma-Aldrich, EUAA7631
ATPSigma-Aldrich, EUA&nbsp; A 2383
BSA livre de ácidos graxosSigma-Aldrich, EUAA 6003albumina de soro bovino
CaCO3Sigma-Aldrich, EUAC 4830
CCCPSigma-Aldrich, EUAC2759cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona CUIDADO H301 + H311 + H331 Tóxico se ingerido, em contato com a pele ou se inalado
Condessa Contador de células automatizadoThermo Fisher Scientific, EUAAMQAX100
Citocromo cSigma-Aldrich, EUAC7752
DatLab Oroboros Instruments, ÁustriaVersão 7.4Software para aquisição e análise de dados
DatLab Oroboros Instruments, ÁustriaVersão 8.1Software para aquisição e análise de dados
DC Protein AssayBio-Rad, EUA5000112Kit de ensaio de proteínas; CUIDADO H314 Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos
DigitoninSigma-Aldrich, EUAD5628CUIDADO H301 Tóxico se ingerido
DitiotreitolSigma-Aldrich, EUAD 0632CUIDADO H318 Causa sérios danos aos olhos
DMEMPan Biotech, AlemanhaP04-05551Dulbecco' s Águia modificada' s meio
DMSOSigma-Aldrich, EUAD2650dimetilsulfóxido
DPBSLonza Bioscience, SuíçaLONBE17-512FDulbecco sem cálcio' s solução salina tamponada com fosfato
EGTASigma-Aldrich, EUAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, EUAA5256701soro fetal bovino
GlicoseSigma-Aldrich, EUA&nbsp; G7528
Glutamato Sigma-Aldrich, EUAG1626
GlicerofosfatoSanta Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, EUACentrífugaHM3S
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Alemanha1701centrífuga
ImidazolHoneywell Fluka, Áustria56750CUIDADO H302 Nocivo por ingestão, H314 Provoca queimaduras graves na pele e lesões oculares, H360D Pode danificar o nascituro
O projeto jamoviVersão 2.3.13software
K+-MESSigma-Aldrich, EUAM 8250
Tubo Leucosep Greiner Bio-One GmbH, ÁustriaZ642843-300EAde centrífuga com barreira de polietileno
Malato Sigma-Aldrich, EUAM1000CUIDADO H319 Provoca irritação ocular grave.
ManitolSigma-Aldrich, EUAM 4125
MgCl2 Scharlau, EspanhaMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, Áustria60101-01meio de respiração mitocondrial
Mixer Swelab Instruments, Suécia440Smesa de balanço
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific, USA5100-0001recipiente de congelamento
OroborosOroboros Instruments, Áustriao NextGen-O2k e o O2k são abordados coletivamente com o termo ' Oroboros'
Câmara Oroboros cVOroboros Instruments, Áustria23100-01câmara de volume clássico
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments, Áustria33100-01câmara de pequeno volume
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments, Áustria11100-03Titration-Injection microPump
O2-Zero PowderOroboros Instruments, Áustria26600-02  Na-ditionita CUIDADO H251 Autoaquecimento: pode pegar fogo, H302 Nocivo se ingerido, H319 Causa irritação ocular grave
octanoilcarnitinaBiotrend - APExBIO Technology, AlemanhaB6371
OligomicinaSigma-Aldrich, EUAO4876
FosfocreatinaSigma-Aldrich, EUAP 7936
PiruvatoSigma-Aldrich, EUAP2256CUIDADO H317 Pode causar uma reação alérgica na pele
RotenonaSigma-Aldrich, EUAR8875CUIDADO H300 Fatal se ingerido
Linhas celulares de fibroblastos da pele   ATCC, EUA
Azida sódicaSigma-Aldrich, EUAS2002CUIDADO H300 + H310 + H330 Fatal se ingerido, em contato com a pele ou se inalado
Subtilisina ASigma-Aldrich, EUAP 5380CUIDADO H318 - Causa sérios danos aos olhos, H334 - Pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldades respiratórias se inalado
SuccinatoSigma-Aldrich, EUAS2378
SucroseSigma-Aldrich, EUAS 7903
Contador de células sanguíneas Swelab Alfa Boule Diagnostics AB, Suécia1420041
Taurine Sigma-Aldrich, EUAT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, Suíçaespectrofotômetro
TMPDSigma-Aldrich, EUAT3134N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato CUIDADO H315 Causa irritação na pele, H319 Causa irritação ocular grave
TripsinaSigma-Aldrich, EUAT4799ATENÇÃO H334 Pode causar sintomas de alergia ou asma ou dificuldades respiratórias se inalado
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, Áustria15452520
tubo

Referências

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