Artigo de método

Ressonância Magnética 3D Cine do Movimento Respiratório em Camundongos e Ratos Ventilados Mecanicamente

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DOI:

10.3791/67474

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19 de setembro de 2025

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1Department of Radiology and Nuclear Medicine, Amsterdam University Medical Center, 2Department of Intensive Care, Erasmus Medical Center, 3Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center, 4Department of Biomedical Engineering & Physics, Amsterdam University Medical Center, 5MR Solutions, 6Department of Intensive Care, Radboud University Medical Center, 7BioMedical Engineering and Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A configuração proposta permite ventilação mecânica controlada e ressonância magnética do movimento 3D do tórax em camundongos e ratos. Usamos essa configuração para estudar a fisiopatologia subjacente à disfunção muscular respiratória induzida pela ventilação mecânica.

Resumo

A fisiopatologia da disfunção do diafragma em pacientes ventilados mecanicamente ainda não foi totalmente compreendida, e modelos animais adequados são necessários para acomodar pesquisas adicionais. As configurações de ventilação mecânica, como o nível de pressão expiratória final positiva (PEEP), desempenham um papel crucial. O objetivo era desenvolver um método para obter imagens do movimento torácico em 3D durante a ventilação mecânica de camundongos e ratos em diferentes configurações de pressão respiratória. Ratos (Wistar) e camundongos (C57BL/6) foram anestesiados com uma mistura de cetamina, atropina e dexmedetomidina. A anestesia foi mantida por infusão contínua através de cateter peritoneal. Em seguida, foi realizada uma traqueostomia para permitir a ventilação mecânica dos animais. Os animais foram colocados em um sistema de RM 7T enquanto ventilados com um ventilador compatível com RM. A cine imaging 3D do tórax foi realizada usando uma sequência de eco gradiente 3D com preenchimento de espaço k pseudo-espiral. Um sinal do navegador, gerado pelo gradiente do rebobinador de seleção de corte, foi registrado a cada TR. O binning retrospectivo e a reconstrução dos dados em 12 períodos de tempo do cine respiratório foram realizados usando um software desenvolvido internamente. Visualizamos com sucesso o movimento torácico em 3D em ambas as espécies durante a ventilação mecânica, permitindo a investigação de mudanças na geometria do tórax ao longo do ciclo respiratório em diferentes níveis de PEEP. Descobrimos que o binning retrospectivo dos quadros respiratórios foi altamente facilitado pela taxa de respiração fixa. O protocolo aqui apresentado pode ser usado para estudar a geometria e o movimento cardíaco e torácico em camundongos e ratos ventilados mecanicamente.

Introdução

A ventilação mecânica é a base do tratamento da insuficiência respiratória aguda na unidade de terapia intensiva. Infelizmente, também pode causar ferimentos. Lesão pulmonar induzida por ventilador, lesão cerebral associada à ventilação mecânica e disfunção diafragmática induzida por ventilação mecânica são exemplos de complicações iatrogênicas associadas à ventilação mecânica aguda 1,2,3. A fisiopatologia subjacente a esses mecanismos de lesão permanece pouco compreendida. Trabalhos experimentais em animais identificaram mecanismos importantes subjacentes às complicações da ventilação mecânica, permitindo a tradução para a prática clínica por meio da aplicação de novas estratégias de ventilação4. Um exemplo recente é a pesquisa sobre o impacto das dissincronias ventilatórias na função diafragmática em modelos de SDRA suína5. Essa pesquisa em modelos animais ventilados mecanicamente é vital para elucidar os mecanismos de lesão, mesmo com a tendência atual de se afastar dos testes em animais. Estudos sobre os efeitos da ventilação mecânica requerem um sistema cardiopulmonar íntegro e a capacidade de simular fisiopatologia comumente vista na UTI4. Modelos animais de grande porte são usados frequentemente porque imitam a fisiologia humana mais de perto do que os roedores e podem ser ventilados com máquinas que são usadas na UTI4. As principais desvantagens são o grande custo associado ao uso de animais de grande porte e a falta de modelos de animais de grande porte geneticamente modificados para investigar os mecanismos moleculares da doença 6,7. Portanto, experimentos em roedores ventilados mecanicamente são inevitáveis, desde que alternativas, como culturas de tecidos sofisticadas ou modelos de órgãos em um chip, não estejam disponíveis.

Várias intervenções que melhoraram os resultados em animais não se traduziram em humanos 4,6, destacando a importância de entender como os modelos animais comumente usados de ventilação mecânica diferem dos humanos. Os efeitos das configurações do ventilador no sistema respiratório são determinados por uma infinidade de fatores que podem ser específicos da espécie, como elastância tecidual, tônus muscular e variação na resposta aos anestésicos comumente usados 8,9,10,11. Essas diferenças podem levar a efeitos contrastantes no movimento e na geometria do tórax e dos pulmões que podem explicar a disparidade entre humanos e animais. Investigar o efeito das configurações de ventilação na geometria e no movimento do sistema cardiopulmonar pode elucidar as diferenças entre as espécies e pode auxiliar na tradução de conceitos fisiopatológicos derivados de estudos com animais para o ambiente clínico. O avanço técnico da ressonância magnética cardiovascular resolvida por movimento permitiu a imagem do coração batendo em modelos de roedores, fornecendo informações sobre forma, função e fisiopatologia em modelos de roedores de doenças cardiovasculares12,13. Esses métodos são subutilizados para obter imagens do tórax e do movimento durante o ciclo respiratório em animais ventilados mecanicamente.

Aqui, apresentamos um método para estudar a geometria e os movimentos do tórax em roedores ventilados mecanicamente usando cine MRI 3D. Isso permite estudar os efeitos agudos de várias configurações de ventilação ou outras intervenções na geometria e no movimento do tórax em roedores ventilados mecanicamente. Aplicamos uma nova aquisição de ressonância magnética 3D em pseudo-espiral e controlada respiratória para pequenos animais ventilados13,14. Neste estudo inicial, investigamos os efeitos da pressão expiratória final positiva (PEEP), mas esse método também pode ser usado para estudar o efeito de outras intervenções ou configurações respiratórias, como relação I: E, volume corrente e frequência respiratória. Este método abrirá uma gama de possibilidades para imagens pré-clínicas de modelos de roedores que requerem ventilação mecânica no campo da pesquisa em terapia intensiva e além.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com a diretiva 86/609 da União Europeia CE. Os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Ética Animal da UMC de Amsterdã, local VUmc e AMC. Camundongos C57BL/N e ratos Wistar foram obtidos dos laboratórios Charles River. Camundongos machos e fêmeas com idade entre 3-6 meses e peso de 25-32 g e ratos machos e fêmeas com idade entre 3-6 meses e peso entre 200-400 g foram utilizados para todos os experimentos. Comida e água foram fornecidas ad libitum. Todos os animais foram aclimatados por pelo menos 1 semana antes do início dos experimentos.

1. Preparação da configuração

  1. Prepare os medicamentos anestésicos seguindo as dosagens mencionadas na etapa 2.
  2. Calibre o ventilador mecânico percorrendo o menu do ventilador e clicando em Configurar > Mais Ventiladores > Testes de Calibração. Execute todos os quatro testes e calibrações listados lá: Teste de Vazamento, Tubulação de Purga, Medição de Espaço Morto e Tubulação de Purgação.
  3. Coloque o ventilador mecânico compatível com RM na sala de RM e puxe os cabos conectados ao ventilador compatível com RM através do orifício da máquina de RM. Pode-se usar um pulmão de teste (por exemplo, um pequeno balão) para verificar a ventilação proveniente do ventilador compatível com RM.
  4. Conecte o ventilador mecânico compatível com RM ao compressor e a uma fonte de fluxo de oxigênio.
  5. Prepare uma coluna PEEP enchendo uma coluna de medição de 10 mL com água e marcando a profundidade da água em centímetros. Coloque o tubo expiratório do ventilador compatível com RM na coluna PEEP. Uma visão geral da configuração é mostrada na Figura 1.
  6. Prenda uma almofada respiratória frouxamente no berço de RM no local onde estará o tórax do animal.

2. Anestesia e início da ventilação mecânica

  1. Inicie a sedação do animal (camundongo ou rato) colocando-o em uma câmara de gás cheia de isoflurano a 4% em 100% O2.
  2. Pese o animal para determinar a dose de anestesia. Injete o local cirúrgico (área laríngea) com 3 mg/kg de bupivacaína e aplique pomada ocular em ambos os olhos.
  3. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento enquanto respira espontaneamente 2% -4% de isoflurano em oxigênio a 100% através de um cone nasal. Garanta o monitoramento da frequência cardíaca, saturação de oxigênio e temperatura colocando um oxímetro de pulso em uma das patas do animal e inserindo a sonda do termômetro retal.
  4. Teste de ausência de reflexos antes da incisão. Levante a pele que cobre a laringe e a traqueia com uma pinça cirúrgica e faça uma incisão usando uma tesoura dobrada.
  5. Dissecar sem rodeios as glândulas salivares e a musculatura subjacente até que a traqueia fique visível.
  6. Usando uma pinça dobrada e afiada, disseque o lado dorsal da traqueia e coloque uma pinça embaixo da traqueia para puxar uma sutura de seda trançada não absorvível (tamanho 6/0) ao redor da traqueia.
  7. Pegue a traqueia em um anel de cartilagem e abra a traqueia imediatamente sob o anel usando uma tesoura de mola.
  8. Canule a traqueia com um Abbocath 20G (camundongo) ou 14G (rato), cortado em aproximadamente 1-1,5 cm de comprimento. Amarre a sutura ao redor da traqueia canulada para garantir uma vedação hermética.
  9. Iniciar a ventilação do animal com volume corrente de 7 mL/kg, frequência de 150 BPM para camundongos e 80 BPM para ratos, 2 cmH2O PEEP com isoflurano a 3% em oxigênio a 100%.
  10. Realize uma injeção intraperitoneal da dose de indução da anestesia injetável (camundongo: cetamina 126 mg / kg, dexmedetomidina 0,1 mg / kg, atropina 0,5 mg / kg; rato: cetamina 90 mg / kg, dexmedetomidina 0,25 mg / kg, atropina 0,05 mg / kg) e após 5 min, diminua gradualmente o fluxo de isoflurano (3% a 0% em 10 min) para permitir uma transição suave da anestesia com gás para a injeção.
  11. Coloque 24G Abbocath por via intraperitoneal e conecte ao perfusor com as seguintes taxas de camundongo: cetamina 36 mg / kg / h, dexmedetomidina 0,02 mg / kg / h, atropina 0,075 mg / kg / h; Rato: cetamina 30 mg/kg/h, dexmedetomidina 0,015 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h. Iniciar a infusão.
    NOTA: Realizamos uma traqueostomia para ventilar os animais em vez de intubação oral, pois isso nos permitiu colocar uma sutura ao redor da traqueia. Isso foi necessário para evitar vazamento de ar, o que é crucial para manter PEEP suficiente.

3. Ressonância magnética sob ventilação mecânica

  1. Coloque o animal no berço dedicado para RM em decúbito dorsal e coloque a bobina de RM apropriada para camundongos ou ratos sobre ele, mantendo um olho no tubo de traqueostomia.
  2. Pare e desconecte o ventilador mecânico usado em 1.2 e a bomba de anestesia e transporte o animal para a sala de RM. Reconecte o animal ao ventilador compatível com RM e comece a ventilar com um volume corrente de 10 mL/kg e uma frequência de 150 BPM para camundongos e 80 BPM para ratos. O volume corrente é maior do que com o ventilador usado em 1.2 para recrutar tecido pulmonar que pode ter entrado em colapso durante o transporte.
  3. Reconecte a bomba de anestesia nas taxas mencionadas acima para manter a profundidade da anestesia. Dependendo do sistema de RM, coloque as linhas de anestesia dentro ou fora do orifício de RM.
  4. Coloque o sensor do monitor de saturação e frequência cardíaca no membro posterior do animal e insira a sonda do termômetro retal. Conecte o sistema de monitoramento respiratório à almofada respiratória. Verifique todos os sinais e certifique-se de que a frequência cardíaca, a saturação de oxigênio e a temperatura estejam na faixa fisiológica.
    NOTA: O monitoramento respiratório deve indicar a frequência respiratória definida no ventilador compatível com RM e é usado apenas para detectar o esforço respiratório do animal. Em caso de esforço respiratório do animal, a curva respiratória mostra picos adicionais. Isso requer a administração de uma dose adicional de anestesia (1/3 da dose inicial de indução).
  5. Coloque o animal no scanner de RM com a bobina centralizada sobre o tórax e conecte os cabos de radiofrequência à bobina. Há uma bobina e um berço separados para acomodar a diferença de tamanho entre camundongos e ratos (a bobina e o berço do rato têm um diâmetro maior em comparação com a bobina do camundongo). Mergulhe o tubo expiratório 6 cm na coluna d'água, administrando 6 cmH2O PEEP.
  6. Titule o volume corrente para 7-9 mL / kg, dependendo da saturação de oxigênio (escolha o menor volume corrente possível com uma saturação de 100%).

4. Aquisição de digitalização

NOTA: A Tabela 1 fornece uma visão geral das configurações de varredura.

  1. Use métodos especificados pelo fornecedor para executar a calibração de RF e o shimming.
  2. Adquira um SCOUT com cinco imagens na orientação coronal e axial e certifique-se de que todo o tórax esteja no campo de visão (FOV). Um SCOUT é uma varredura rápida usada para planejar os outros planos de imagem e geralmente cobre um campo de visão maior do que as outras imagens. Se necessário, reajuste a posição do animal no berço e refaça o SCOUT.
  3. Planeje as varreduras 2D (consulte a Tabela 1 e a Figura 2) nas imagens SCOUT. Certifique-se de que os planos coronal e sagital cubram todo o tórax.
    NOTA: O plano sagital é colocado na parte superior do hemidiafragma direito para limitar a porção do coração dentro do FOV. Ao adquirir o SCOUT a 6 cmH2O PEEP, garantimos que o diafragma seja visualizado na posição mais caudal.
  4. Adquira as varreduras 2D a 6 cmH2O PEEP e reconstrua imediatamente as imagens para verificar o posicionamento do animal e garantir a qualidade da imagem (siga o passo 6). Se necessário, reajuste o posicionamento do FOV ou do animal e refaça as varreduras.
  5. Planeje a varredura 3D (Figura 2) colocando o FOV ao redor de todo o tórax e cubra as varreduras 2D. Certifique-se de que cerca de 20% do FOV na direção do corte esteja fora do animal para evitar artefatos de dobra.
    NOTA: As varreduras 2D são adicionadas ao protocolo porque o tempo de aquisição é menor do que para as varreduras 3D, tornando-as adequadas para testar rapidamente o efeito das intervenções.
  6. Adquira a varredura 3D com o esquema de amostragem do espaço k pseudo-espiral necessário (Figura 3), permitindo um agrupamento retrospectivo robusto de dados e visualização do movimento respiratório14.
  7. Repita as varreduras 2D e 3D a 3 e 0 cmH2O PEEP. O tempo total de varredura foi de 2,5 minutos por varredura 2D e 15 minutos por varredura 3D.
    NOTA: Neste caso, adaptamos a PEEP durante os experimentos. Selecionamos PEEP de 0, 3 e 6 cmH2O porque sabemos por experimentos (pesquisas anteriores e estudos em andamento) com animais ventilados de longa duração que esses níveis de PEEP resultam em alterações relevantes na geometria do diafragma e do tórax15. Além disso, optou-se por usar zero, um nível médio e um alto de PEEP neste trabalho para mostrar o efeito da PEEP. Dependendo da questão de pesquisa, outras intervenções são possíveis. Por exemplo, os efeitos de relaxantes musculares ou outros medicamentos na geometria do tórax podem ser estudados. O protocolo nos permite estudar os efeitos da intervenção dentro do sujeito.

figure-protocol-1
Figura 1: Visão geral da configuração. (A) Uma visão geral esquemática da configuração, (B) a configuração da bobina para um camundongo, (C) a configuração da bobina para um rato, com um diâmetro maior do que a bobina do camundongo, (D) configuração da bobina em relação ao scanner de RM, (E) a coluna PEEP com tubo expiratório colocado a 3 cmH2O PEEP e (F) um close-up da válvula que regula a ventilação, indicando quais tubos devem ser colocados na coluna PEEP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Planejamento das imagens de RM para os cines 2D e 3D. Figura mostrando como o campo de visão foi definido para as varreduras 2D na orientação sagital e coronal (linha superior e média) e varreduras 3D na orientação sagital (linha inferior). A coluna da esquerda representa uma das fatias do SCOUT na orientação axial ao nível do coração, a coluna do meio mostra uma fatia do SCOUT na orientação coronal e a coluna da direita mostra uma fatia na orientação axial ao nível do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Padrão de amostragem pseudo-espiral de RM. O padrão de amostragem está na direção de codificação da fase ky/kz com tamanho de matriz 80 x 80 otimizado para binning de movimento respiratório retrospectivo. As espirais são criadas começando no centro do espaço k e depois virando para fora e para dentro novamente, repetindo assim cada espiral. Todo o padrão de amostragem é realizado com 25 repetições para gerar dados suficientes dentro de cada quadro respiratório. Cada espiral tem uma cor diferente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Fim do experimento

  1. Depois de terminar todas as digitalizações, remova o animal do scanner. Os animais não podem sobreviver ao experimento devido à traqueostomia. Eutanasiar camundongos com luxação cervical e ratos por exsanguinação.
  2. Salve todos os arquivos MR brutos e reconstruídos.
Tipo de digitalizaçãoEco Gradiente SCOUTEco gradiente 2DEco gradiente 3D
OrientaçãoCoronal e SagitalCoronal e SagitalSagital
esquema de amostragem do k-SpaceCartesianoCartesianoPseudo-espiral
Número de fatias10180
Espessura da fatia (mm)1 (Rato)1 (Rato)0,38 (Mouse)
1 (Rato)1 (Rato)0,81 (Rato)
Folga da fatia (mm)2 (Rato)0 (Mouse)0 (Mouse)
5 (Rato)0 (Rato)0 (Rato)
Amostragem de fatias*0.80.80.8
FOV (leitura x fase x fatia; mm)35 x 35 (Mouse)30 x 23 (Mouse)30 x 23 x 30 (Mouse)
80 x 80 (Rato)65 x 49 (Rato)65 x 49 x 65 (Rato)
Tamanho da matriz (freq x fase)256 x 192256 x 192211 x 80 x 80
TR / TE (ms)453284533045328
Ângulo de inversão (°)151510
Número de repetições807025
Desencadeamento respiratórioNãoSim, retrospectivamenteSim, retrospectivamente
Tempo de imagem (min:s)2:022:2316:00
Níveis de PEEP (cmH2O)66, 3, 06, 3, 0

Tabela 1: Parâmetros de aquisição para todos os exames. * A amostragem de fatia indica qual porcentagem do pulso de seleção de fatia é usada para geração de imagens

6. Reconstrução de imagem

  1. Para realizar a reconstrução de imagens, use o software desenvolvido internamente disponível no GitHub16. Execute estas etapas para todas as varreduras com um navegador que exija gating respiratório retrospectivo.
    NOTA: Foi descrito anteriormente por Daal et al., mas esse trabalho foi focado em imagenscardíacas 13. Aqui, descrevemos um método para reconstruir imagens respiratórias de todo o tórax.
  2. Carregue o arquivo de dados brutos clicando em Carregar MRD. Isso visualiza o sinal bruto do navegador e seu espectro no painel superior esquerdo. Se o sinal respiratório não estiver claramente visível, adapte o navegador primário na guia Configurações.
  3. Em Filtros de coração/respiração, preencha a frequência respiratória definida no ventilador mecânico compatível com RM e defina a largura para 15. As configurações nas outras caixas não são relevantes para este tipo de reconstrução. Pressione Filter para aplicar as configurações, o que resulta em um sinal de navegador fechado, conforme mostrado na Figura 4. Certifique-se de que o sinal vermelho na caixa Navegador de respiração e Taxa de respiração siga o sinal azul do navegador bruto.
  4. No Cine, selecione o Filme respiratório e defina o número de quadros para 12 e o número de dinâmicas para 1. Na guia Geometria, ligue o PCA (nível 8) e o Filtro de toque. Pressione Classificar espaço k para aplicar as configurações.
  5. Nos parâmetros CS reco, aplique as seguintes configurações: WVxyz 0.0010, TVxyz 0.0000, LLRxyz 0.0050, TVcine 0.015, TVdyn 0.000. Pressione Reco Movies para iniciar a reconstrução.
  6. Inspecione a reconstrução no painel inferior direito percorrendo os quadros e (se aplicável) as fatias. Exporte as imagens reconstruídas pressionando Exportar DCM e/ou Exportar GIF.

7. Análise de imagem

NOTA: Dependendo da questão de pesquisa, vários parâmetros de resultado podem ser calculados a partir das imagens de cinema. Aqui, nos concentramos em parâmetros que quantificam a geometria do tórax, o volume pulmonar e a excursão.

  1. Abra um visualizador DICOM apropriado, por exemplo, o software mencionado na Tabela de Materiais e carregue um cine 2D clicando em File > Open e selecionando os arquivos de cine 2D. Identifique o quadro com a posição mais alta do diafragma (quadro expiratório final). Selecione o quadro e abra-o no visualizador DICOM.
  2. Meça as dimensões do pulmão ântero-posterior e craniocaudal (Figura 5) no cine 2D sagital e a dimensão esquerda-direita no cine 2D orientado para o coronal manualmente usando o botão de medição no microdicom. Repita essas medições para todos os níveis de PEEP ou outras intervenções. Essas medições também podem ser realizadas em um quadro do cinema 3D, dependendo da escolha das varreduras.
  3. Carregue o cinema 3D no programa de análise de imagem 3D e coloque a imagem na orientação correta clicando em Ferramentas > Reorientar imagem. Preencha SPL como código RAI. Selecione o quadro expiratório final rolando pela dinâmica em Ferramentas > Inspetor de camada e, em seguida, aumente o número do componente.
  4. Inicialize a segmentação contornando manualmente a parte central dos pulmões em duas fatias para cada orientação (Figura 6). Use o modo pincel e ajuste o tamanho do pincel, se necessário.
  5. Inicie a segmentação 3D pressionando Contorno ativo na barra de ferramentas principal. Certifique-se de que a caixa vermelha (ROI) cubra todo o tórax. Ative Inicializar com segmentação atual e pressione Segmento 3D.
  6. Selecione Limite como modo de pré-segmentação e use apenas um limite superior selecionando o Modo de limite mais à direita. Pressione Avançar. Em seguida, pule a etapa de adicionar bolhas pressionando novamente Avançar. Como a segmentação já foi inicializada na etapa 7.5, não há necessidade de adicionar bolhas.
  7. Inicie o contorno ativo pressionando o botão Play e pause-o assim que a segmentação atingir as bordas do pulmão. Percorra as imagens para verificar a segmentação. Pressione Concluir para finalizar a segmentação.
  8. Pressione Atualizar para visualizar a segmentação 3D no painel inferior esquerdo e inspecioná-la e girá-la.
  9. Salve a segmentação como NiFTI clicando em Segmentação > Salvar imagem de segmentação e arquivo de malha STL clicando em Segmentação > Exportar malha de segmentação.
  10. Anote o volume pulmonar que pode ser encontrado em Segmentação, Volume e Estatística.
  11. Registre as imagens dos outros estados respiratórios para a dinâmica de expiração final usando o script fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Aplique as transformações computadas à segmentação, resultando em uma segmentação para cada dinâmica. Use essas segmentações para calcular parâmetros de resultado, como excursões em todas as direções.

Resultados

Usando o protocolo descrito neste estudo, escaneamos um grupo de 8 camundongos C57BL/6 WT saudáveis e 8 ratos Wistar WT usando um scanner de ressonância magnética de 7 Tesla. Conseguimos ventilar mecanicamente os animais em diferentes níveis de PEEP e monitorar parâmetros fisiológicos básicos durante a varredura (Figura 7).

Na Figura 5, um exemplo de três varreduras 2D no quadro expiratório final é mostrado de um camundongo e um rato na orientação sagital. Como pode ser visto, a PEEP introduz um deslocamento caudal do diafragma em ambos os animais, mas em camundongos, isso também é acompanhado por um alargamento do tórax, indicado por um aumento no diâmetro ântero-posterior.

Essas varreduras de alta qualidade mostram que, usando essa técnica, podemos medir o tamanho das diferentes partes do tórax e mostrar os efeitos de várias configurações ventilatórias no movimento do tórax e do diafragma. O curto tempo de varredura permite a comparação dentro dos sujeitos dos parâmetros de resultado nos quais se está interessado, reduzindo o número necessário de animais. A Tabela 2 mostra os parâmetros de resultado de todos os animais.

A Figura 8 mostra as segmentações pulmonares da dinâmica expiratória final em três níveis de PEEP com o volume pulmonar correspondente. Como esperado, o aumento da PEEP resultou em aumento do volume pulmonar. Os cines 3D também são exibidos como um filme no Vídeo Suplementar 1 e no Vídeo Suplementar 2.

figure-results-1
Figura 4: Captura de tela do software usado para reconstruir as imagens com gating retrospectivo dos dados. O gating dos dados é baseado no sinal do navegador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 5: Resultados representativos de imagens 2D em um rato e um camundongo em três níveis de PEEP, com as dimensões do pulmão ântero-posterior e crânio-caudal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 6: Captura de tela do software usado para segmentar os pulmões nas cines 3D. No painel superior esquerdo, uma visão axial do cinema 3D é mostrada com o pulmão segmentado em vermelho. No painel superior direito, uma visão sagital é mostrada com o pulmão segmentado em vermelho. No painel inferior esquerdo, uma renderização 3D do pulmão segmentado é mostrada. No painel esquerdo-direito, uma visão coronal é mostrada com o pulmão segmentado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 7: Parâmetros vitais dos animais durante os experimentos. N = 8 camundongos (azul), N = 8 ratos (laranja). Os dados são mostrados como média com DP. Observe a queda na frequência cardíaca quando os animais entram em um plano cirúrgico de anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Segmentação 3D dos pulmões em três níveis de PEEP com os volumes pulmonares correspondentes. Segmentação de um pulmão de rato em PEEP 0 (coluna esquerda), PEEP 3 (coluna do meio) e PEEP 6 (coluna direita). Na linha superior, o lado posterior dos pulmões é mostrado. Na linha do meio, o lado anterior dos pulmões é mostrado. Os volumes mostrados na linha inferior são medidos dentro dos pulmões renderizados em 3D que são visíveis nesta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Cinema 3D de um mouse. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 2: Cinema 3D de um rato. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo de Codificação Suplementar 1: Script para registrar as segmentações para outras aquisições. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo mostra que a imagem de RM 3D com gating retrospectivo permite medir o movimento do tórax em dois modelos animais durante a ventilação mecânica. Essas técnicas têm potencial para serem usadas em pesquisas futuras envolvendo imagens cardíacas e torácicas em camundongos e ratos ventilados mecanicamente. Descobrimos que, devido à frequência respiratória fixa, o binning retrospectivo era altamente robusto.

Uma etapa crítica do protocolo é configurar o posicionamento correto dos animais dentro das bobinas de RM. Durante a digitalização, não é possível reposicionar os animais. Além disso, a manutenção da normotermia é muito importante para garantir que as medidas sejam feitas em condições fisiológicas, pois os anestésicos podem causar hipotermia por vasodilatação periférica, e os pulsos de radiofrequência desse protocolo de RM podem causar hipertermia17,18. Na Figura 7, as flutuações da temperatura corporal podem ser vistas durante o curto período em torno da transferência dos animais para o scanner (em torno da marca de 1 h) em que nenhum calor é aplicado de uma fonte externa. Outra etapa crítica é a titulação da anestesia, especialmente em camundongos. O plano de anestesia em que os camundongos não exibem esforço respiratório, mas mantêm parâmetros vitais estáveis, é estreito e requer monitoramento cuidadoso do sinal respiratório e ajuste das taxas de infusão de anestesia. Em ratos, não enfrentamos tais problemas dentro da faixa de sedação utilizada. A qualidade da imagem será impactada negativamente se houver esforços respiratórios do animal devido à reconstrução retrospectiva das imagens com base na frequência respiratória definida. É possível usar um regime anestésico diferente, como anestesia inalatória com isoflurano ou anestésicos injetáveis alternativos que causam mais supressão do esforço respiratório. O ventilador para pequenos animais CWE-MRI-1 utilizado neste protocolo é compatível com anestésicos inalatórios19.

Existem três etapas críticas para a reprodução do método de RM proposto neste estudo. Primeiro, a mesma sequência básica de ressonância magnética (ou seja, 3D FLASH) deve ser usada. Essa sequência está disponível em basicamente todos os sistemas de ressonância magnética. Em segundo lugar, a trajetória do espaço-k mencionada neste trabalho (pseudo-espiral) pode exigir um patch de software que possa executar trajetórias do espaço-k definidas pelo usuário. Convidamos os leitores a entrar em contato com o autor correspondente se desejarem replicar a aquisição. Há experiência na implementação desse tipo de aquisição em sistemas de outros fornecedores. Por fim, o pipeline de reconstrução que compartilhamos como software de código aberto é neutro em relação ao fornecedor e, portanto, aplicável a todos os sistemas pré-clínicos.

Escolhemos o gatilho retrospectivo e o binning em vez do gatilho prospectivo por vários motivos. Principalmente, o disparo retrospectivo e o binning de dados do espaço k oferecem total flexibilidade no número de quadros CINE respiratórios reconstruídos, permitindo-nos otimizar a resolução temporal, a resolução espacial e a relação sinal-ruído. Além disso, o disparo prospectivo introduz um tempo morto no final de cada ciclo respiratório, pois o scanner aguarda o próximo gatilho, o que pode interromper o estado estacionário e resultar em um ciclo incompleto. Com a ventilação mecânica, esse tempo morto é mínimo, mas ainda está presente.

A principal limitação deste protocolo é a incapacidade de medir as pressões das vias aéreas ou esofágicas. Até onde sabemos, não há sensores de pressão pulmonar ou esofágica compatíveis com RM para pequenos animais no mercado. Outra limitação é a falta de medições contínuas da pressão arterial na ressonância magnética. O protocolo anestésico foi baseado em pesquisas institucionais prévias. A atropina foi adicionada devido à alta prevalência de bradicardia e hipotensão arterial observada anteriormente. Embora o monitoramento contínuo da pressão arterial não tenha sido possível devido a restrições do ambiente de RM, a hipertensão é improvável, pois não foi observada taquicardia (Figura 7). A monitorização empregada nesse protocolo consistiu em frequência cardíaca, saturação de oxigênio, temperatura e sinal respiratório baseado no movimento da parede torácica. Usando essas medições, uma visão geral dos parâmetros vitais dos animais pode orientar a administração da anestesia, mas ter uma leitura da pressão arterial pode evitar a superdosagem de animais com esforço respiratório. Nenhum outro estudo de ressonância magnética sobre a fisiologia respiratória de roedores ventilados mecanicamente foi publicado, mas esse método pode ser empregado para uma ampla gama de questões de pesquisa fora da pesquisa respiratória. O programa de reconstrução mencionado no manuscrito (Retrospectivo) também pode ser usado para reconstruir imagens ao longo do ciclo cardíaco, permitindo assim ao pesquisador adquirir imagens de alta resolução do coração e dos vasos sem artefatos de movimento. Este protocolo pode ser aplicado em todos os projetos que requerem ventilação mecânica de ratos ou camundongos durante a digitalização. Pode-se, por exemplo, considerar o estudo da relação entre as configurações de ventilação mecânica e a função cardíaca. Outras opções incluem imagens de animais com o peito aberto ou após cirurgias que requerem ventilação mecânica.

Divulgações

Ruslan Garipov é funcionário da MR Solutions Ltd., Guildford, Reino Unido.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela ZonMW Grant 09120011910004 (GS, CO, LH) e NIH grant 5R01HL121500 (CO).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
  Bomba de seringa dupla digital 11 PlusAparelho de Harvard (EUA)229193-2Bomba de seringa dupla com recursos programáveis para laboratórios
Condicionador de sinal de canal único e multicanal AccuSensOpsens solutions inc. (Canadá)ACS-P4-N-62SCUsado com sensor de temperatura de fibra óptica para monitorar a temperatura corporal
Sensor de temperatura de fibra óptica Opsens solutions inc. (Canadá)OTP-M
Berço do rato&Agudo; equipamento Vé té rinaire Minerve (França)
Mousestat Jr. Kent-scientific (EUA)MSTAT-JRO MouseSTAT Jr. fornece  oximetria de pulso precisa em camundongos e ratos.
MR ScannerMR Solutions Lt. (Reino Unido)MRS-7024
Monitoramento e monitoramento compatíveis com RM Sistema de gating para pequenos animaisSA Instruments, Inc. (EUA)1030Módulo RT (módulo de interface respiratória), Módulo de controle / gating ERT, bateria
Ventilador compatível com MRI-1CWE (EUA)12-07000Ventilador mecânico adequado para ventilar pequenos animais em ambientes de ressonância magnética. Ventila com um princípio baseado no fluxo x tempo controlado por volume usando válvulas pneumáticas.
Unidade de controle de temperatura multiestação e PCA de alto fluxo&Agudo; equipamento Vé té rinaire Minerve (França)
Coluna PEEPColuna de medição de fluidos reaproveitada
Ventilador Mecânico PhysiosuiteKent-scientific (EUA)Ventilador mecânico adequado para ventilação de pequenos animais. Ele ventila com um princípio controlado por volume e regulado por pressão. 
Oxímetro de pulso Sensores de pata, compatíveis com ressonância magnéticaKent-scientific (EUA)SPO2-MSE-RMSensor de pata compatível com ressonância magnética para Mousestat Jr.
Berço de rato&Agudo; equipamento Vé té rinaire Minerve (França)
Bobina do RF, ratoMR Solutions Lt. (Reino Unido)Bobina de RF de volume de mouse de 38 mm para estudos do corpo do mouse
Bobina do RF, ratoMR Solutions Lt. (Reino Unido)65mm  bobina de RF de volume de rato para estudos de corpo de rato
Ferramentas cirúrgicas
Abbocath 14G, 20G, 22G, 24GAbbocath14G, 20G, 22G para uso como tubo endotraqueal, 24G para infusão intraperitoneal de anestesia
Ethilon 3-0  Sutura FD-1 com agulhaEthicon (EUA)663H
Fórceps #55Dumont (Suíça)55
Tesoura MetzenbaumFerramentas de ciências exaustivas (Alemanha)14017-14
Porta-agulhasFerramentas de ciências exaustivas (Alemanha)12005-15
Sutura de seda trançada não absorvível 6/0Ferramentas de ciências exaustivas (Alemanha)18020-60
Tesoura de molaFerramentas de ciências exaustivas (Alemanha)15033-09
Tesoura de tenotomia StevensFerramentas de ciências exaustivas (Alemanha)14064-11
Pinça de amarração de suturaFerramentas de ciências exaustivas (Alemanha)18025-10
Fita medipore3M (EUA)
Medicação
Atropina 0,25 mg/mL
Dexmedetomidina 0,5 mg/mL DexdormitorOrion pharma (Finlândia)
Pomada para os olhos DuratearsAlcon Nederland BV (Países Baixos)
IsofluranoAST pharma (França)
Cetamina 100 mg/mL KetexxAlfasan (Países Baixos)
Vaselina vaselinaUnilever (Países Baixos)
Software
ElastixInstituto de Ciências da Imagem, UMC Utrecht (Holanda)
ItksnapUniversidade da Pensilvânia (EUA)
Matlab 2019aWolfram Research Inc (EUA)
MicrodicomMicrodicom (Bulgária)
RetrospectivaAmsterdam UMC (Países Baixos)

Referências

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